La transfusion sanguine permet de sauver des vies et réduit la morbidité pour un grand nombre de maladies et d'affections cliniques, mais elle n'est pas exempte de complications. Un incident néfaste lié à une transfusion, également appelé Effet Indésirable Receveur (EIR), est un incident défavorable survenant chez un patient pendant ou après une transfusion sanguine. Parmi eux, le TRALI est considéré comme l’une des réactions inflammatoires les plus critiques. Cette pathologie se développe généralement dans les 6 heures après transfusion. On en reconnaît deux types, les TRALI immunologiques et les TRALI non-immunologiques. En France, les premiers sont presque entièrement prévenus par une politique de sécurité des produits sanguins, tandis que la fréquence des seconds augmente. La physiopathologie du TRALI reste mal connue. Tandis que certains y accordent une place importante aux plaquettes sanguines du patient transfusé, d’autres les considèrent comme pas réellement impliquées. Le but de ce travail de thèse a été, dans un premier temps, d’investiguer le potentiel inflammatoire des plaquettes sanguines conservées dans les concentrés plaquettaires et l’influence de cette inflammation sur l’endothélium vasculaire général. Ensuite, sera évalué le rôle des plaquettes sanguines de l’organisme, notamment par l’intermédiaire de leurs produits de sécrétion, dans la pathogénie de cette complication transfusionnelle. Pour cela, un ALI (mimant un TRALI) a été déclenché, dans un modèle in vivo, par une injection d’anticorps anti-CMH I chez des souris préalablement stimulées avec du LPS. L’ensemble de nos résultats confirme le potentiel inflammatoire des plaquettes sanguines, au sein des concentrés plaquettaires, pouvant probablement assumer l’entière responsabilité du déclenchement d’un TRALI non-immunologique, ainsi qu’un rôle secondaire des plaquettes sanguines de l’organisme, participant activement à l’amplification de la sévérité de la pathologie. Cette thèse s’inscrit dans la continuité logique des études menées, au sein du laboratoire GIMAP-EA3064, investiguant la place des plaquettes sanguines au sein de l’inflammation, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives dans la sécurité transfusionnelle. / Blood transfusion saves lives and reduces morbidity for many diseases and clinical conditions, but it is not without complications. A transfusion-related adverse event, also known as the Adverse Reaction (AR), is an incident occurring in a patient during or after a blood transfusion. Among them, TRALI is considered as one of the most critical inflammatory reactions. This pathology usually occurs within 6 hours after transfusion. Two types are recognized: immune TRALI and non-immune TRALI. In France, the first is almost completely prevented by a blood product safety policy, while the frequency of the second increases. The pathophysiology of TRALI remains poorly understood. While some scientists give an important function of patient blood platelets, others consider them dispensable. The aim of this thesis was, first, to investigate the inflammatory potential of blood platelets stored in platelet concentrates and its impact on the general vascular endothelium. Next, the role of patient blood platelets, including their secretory products, in the pathogenesis of this transfusion complication will be evaluated. For it, an ALI (mimicking a TRALI) was triggered, in an in vivo model, by an injection of anti-MHC I antibody in mice previously stimulated with LPS. Our results confirm the inflammatory potential of blood platelets in platelet concentrates, which can probably assume the entire responsibility for triggering a non-immune TRALI, and a secondary role for patient blood platelets in the amplification of the severity of this pathology. This thesis is the continuity of studies conducted in the laboratory GIMAP-EA3064, investigating the function of blood platelets in inflammation, thus opening up new perspectives in transfusion safety.

Le TRALI immunologique est un syndrome de détresse respiratoire aiguë rare, provoqué par la présence d’alloanticorps dans les produits transfusés. Il est classiquement étudié au moyen d’un modèle de souris qui reçoivent un anticorps monoclonal contre les molécules d’histocompatibilité de classe I, anti-H-2d. Or les mécanismes qui conduisent au TRALI restent encore largement incompris. Dans ce travail de thèse, je montre que l’inhibition des récepteurs P2X1 à l’ATP et du canal calcique TRPC6, diminue le développement des œdèmes péri-artériolaires pulmonaires lors d’un TRALI, suggérant un rôle des cellules musculaires lisses. Les expériences de déplétions cellulaires spécifiques montrent que les plaquettes et les neutrophiles ne sont pas nécessaires pour l’initiation du TRALI, contrairement à ce qui avait été montré par d’autres équipes. Les monocytes et/ou les macrophages sont par contre indispensables. J’ai aussi développé un modèle de TRALI immunologique utilisant des souris transgéniques pour le récepteur humain FcγRIIA, et un anticorps recombinant muni d’une partie Fc d’IgG1 humaine. Mes travaux montrent que le TRALI est plus sévère dans les souris transgéniques, accompagné d’une activation plus importante des plaquettes et des neutrophiles. Ce modèle permet d’envisager l’étude des mécanismes du TRALI sous un nouvel angle, plus proche de la physiopathologie humaine, ainsi que celle de la contribution des parties Fc des anticorps humains. / Immunological TRALI is a rare acute respiratory distress syndrome induced by the presence of alloantibodies in transfused products. A mouse model using a monoclonal antibody against the major histocompatibility complex class I, anti-H-2d, is usually used to study its mechanisms. Nevertheless, there is a lack in our understanding regarding the course of events. In this thesis, I show that the inhibitions of the ATP-gated receptor P2X1 and of the TRPC6 channel reduce the development of periarteriolar pulmonary edema occurring during TRALI, pointing to a role of smooth muscles cells. Specific cell depletions show that platelets and neutrophils are dispensable for TRALI initiation, in contrast to previous reports. Monocytes and/or macrophages are however necessary. I also developed a model of immune TRALI using transgenic mice expressing the human receptor FcγRIIA, and a recombinant antibody with a human IgG1-Fc fragment. My work reveal a more severe TRALI response in transgenic mice, with enhanced activation of platelets and neutrophils. This model allow a finer study of mechanisms underlying TRALI, moving towards the human actors of the pathology. We can also use this novel approach to assess the contribution of human Fc fragment.

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Le TRALI représente un œdème pulmonaire lésionnel aigu survenant au cours d’une transfusion. Son mécanisme étiopathologique encore très imprécis conduit aujourd’hui à une sous-estimation de son incidence. Des études clinico-anatomiques ont souligné le rôle central des polynucléaires neutrophiles (PMN) en montrant que le TRALI résulte de l’accumulation de PMN au contact de l’endothélium lésé des capillaires pulmonaires. De nombreux investigateurs ont tenté de définir le facteur déclenchant présent dans le produit sanguin transfusé et évoquèrent l’existence d’un conflit immunologique par infusion d’anticorps anti-HLA. En appui avec les données de la littérature, ce travail a pour but d’apporter une meilleure connaissance du mécanisme du TRALI afin d’en améliorer son diagnostic, sa prévention et la prise en charge du patient. Tout d’abord, nous confirmons l’implication des anticorps anti-HLA dans la survenue du TRALI en validant pour la première fois l’hypothèse du modèle en deux étapes: une première étape préalable est requise chez le patient présentant une situation clinique ou thérapeutique prédisposante qui aboutit à une pré-stimulation des PMN, puis une seconde étape, dépendante de l’apport d’anticorps anti-HLA lors de la transfusion, entraîne l’activation de la NADPH oxydase phagocytaire. Cela conduit à l’activation des PMN et la libération de dérivés réactifs de l’oxygène qui sont directement responsables de la lésion endothéliale pulmonaire et provoque une augmentation de la perméabilité endothéliale. Nous démontrons en plus l’existence d’un seuil d’anticorps anti-HLA nécessaire pour déclencher une forte activation des PMN. Enfin, nous avons mis en évidence un mécanisme d’activation des PMN par les anticorps anti-HLA faisant intervenir la formation de complexes immuns antigène – anticorps à la surface des PMN. Ces complexes immuns sont reconnus avec une affinité plus grande que les anticorps seuls par les récepteurs Fc des PMN. Cette double interaction au sein d’un même PMN pourrait favoriser la formation de cluster de récepteurs Fc activés au niveau de radeaux lipidiques, ce qui induirait une activation optimisée de ces récepteurs, entraînant une cascade de signalisation aboutissant à l’activation de la NADPH oxydase des PMN. Nos résultats constituent un rationnel scientifique solide pour accéder à une meilleure connaissance du TRALI. / TRALI represents an acute non-cardiogenic pulmonary oedema following blood transfusion. The unknown etiopathological mechanism of TRALI leads to an underestimation of the incidence. Clinical and anatomical studies highlighted the major role of neutrophils (PMN) and showed that TRALI results from an increased number of neutrophils within the pulmonary capillary endothelium. Many evidence suggest that antibodies recognizing human leukocyte antigens (HLA) present in the blood transfusion are the predominant trigger leading to TRALI. Towards theses findings, we investigated the precise mechanism in TRALI in order to get a better knowledge of its diagnosis, its prevention and the patient care. We confirm the major role of anti-HLA antibodies and validate for the first time the two-hit model: the first-hit related to the patient clinical condition leads to their PMN stimulation, followed in the second-hit by the infusion of blood products containing anti-HLA antibodies that activate the phagocytic NADPH oxidase. This event induces PMN activation and the release of reactive oxygen species that are directly responsible for the pulmonary endothelial damage and cause the endothelial permeability increase. We also demonstrate the cut-off of anti-HLA antibodies that raises PMN activation. Finally, we showed that both the antigen-binding and the Fc-binding systems to antibodies are needed to induce a major PMN activation. We found that the binding of anti-HLA antibodies to HLA antigens promote the formation of cluster of Fc receptors within lipid rafts. The translocation of Fc receptors into lipid rafts improve Fc receptors activation, leading to intracellular signal transduction and activation of effector functions, such as NADPH oxidase activation and release of reactive oxygen species involved in tissue damage.

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