Toxoplasma gondii é um parasito do filo Apicomplexa que infecta uma grande variedade de hospedeiros, incluindo os humanos. O parasito invade a célula hospedeira por penetração ativa, com a participação das proteínas de suas organelas secretoras durante esse processo. Até o momento, somente um número limitado de proteínas secretoras tem sido descoberto, além disso, as moléculas efetoras envolvidas na invasão e sobrevivência do parasito não estão completamente compreendidas. A osteopontina (OPN) é uma glicofosfoproteína adesiva secretada, multifuncional, que contém o domínio arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) de ligação à integrina, que está envolvida em uma variedade de eventos fisiológicos e patológicos, incluindo sinalização e sobrevivência celular. Pela primeira vez, nós demonstramos pelas técnicas de imunofluorescência e imunocitoquímica ultraestrutural que há uma intensa marcação para uma proteína OPN-like nos grânulos densos de taquizoítos de T. gondii extracelulares. O western blotting e o RT-PRC confirmaram a expressão de OPN-like nos taquizoítos. Nossos resultados também mostram que após a invasão dos macrófagos, a proteína OPN-like está localizada na membrana do vacúolo parasitóforo. Esses dados sugerem que os grânulos densos secretam uma proteína OPN-like, e nós podemos especular que essa proteína participa durante o processo de interação do parasito com as células hospedeiras. . / Toxoplasma gondii is an apicomplexan parasite infecting a broad host range, including humans. The parasite invades host cell by active penetration with the participation of its secretory organelles proteins during this process. Until now, only a limited number of secretory proteins have been discovered, and the effectors molecules involved in parasite invasion and survival are not well understood. Osteopontin (OPN) is a multifunctional secreted adhesive glycophosphoprotein containing the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) integrin-binding domain, which is involved in various physiological and pathological events including cell signaling and survival. For the first time we demonstrated by immunofluorescence and immunoelectron microscopy approaches that there is an intense labeling for an OPN-like protein in the dense granules of extracellular T. gondii tachyzoites. Western blotting and RTPCR confirmed this protein expression in tachyzoites. Our results also showed that after macrophage invasion the OPN-like protein is localized at the parasitophorous vacuole membrane. These data suggest that dense granules secrete an OPN-like protein, and we can speculate that this protein participates during the parasite interaction process with host cells.

Toxoplasma gondii é um parasito do filo Apicomplexa que infecta uma grande variedade de hospedeiros, incluindo os humanos. O parasito invade a célula hospedeira por penetração ativa, com a participação das proteínas de suas organelas secretoras durante esse processo. Até o momento, somente um número limitado de proteínas secretoras tem sido descoberto, além disso, as moléculas efetoras envolvidas na invasão e sobrevivência do parasito não estão completamente compreendidas. A osteopontina (OPN) é uma glicofosfoproteína adesiva secretada, multifuncional, que contém o domínio arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) de ligação à integrina, que está envolvida em uma variedade de eventos fisiológicos e patológicos, incluindo sinalização e sobrevivência celular. Pela primeira vez, nós demonstramos pelas técnicas de imunofluorescência e imunocitoquímica ultraestrutural que há uma intensa marcação para uma proteína OPN-like nos grânulos densos de taquizoítos de T. gondii extracelulares. O western blotting e o RT-PRC confirmaram a expressão de OPN-like nos taquizoítos. Nossos resultados também mostram que após a invasão dos macrófagos, a proteína OPN-like está localizada na membrana do vacúolo parasitóforo. Esses dados sugerem que os grânulos densos secretam uma proteína OPN-like, e nós podemos especular que essa proteína participa durante o processo de interação do parasito com as células hospedeiras. . / Toxoplasma gondii is an apicomplexan parasite infecting a broad host range, including humans. The parasite invades host cell by active penetration with the participation of its secretory organelles proteins during this process. Until now, only a limited number of secretory proteins have been discovered, and the effectors molecules involved in parasite invasion and survival are not well understood. Osteopontin (OPN) is a multifunctional secreted adhesive glycophosphoprotein containing the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) integrin-binding domain, which is involved in various physiological and pathological events including cell signaling and survival. For the first time we demonstrated by immunofluorescence and immunoelectron microscopy approaches that there is an intense labeling for an OPN-like protein in the dense granules of extracellular T. gondii tachyzoites. Western blotting and RTPCR confirmed this protein expression in tachyzoites. Our results also showed that after macrophage invasion the OPN-like protein is localized at the parasitophorous vacuole membrane. These data suggest that dense granules secrete an OPN-like protein, and we can speculate that this protein participates during the parasite interaction process with host cells.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2016-06-02T13:19:25Z No. of bitstreams: 1 Flaviana Santos Wanderley.pdf: 2218547 bytes, checksum: 33783f2ee07821db7f23103bcb5d7838 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-02T13:21:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Flaviana Santos Wanderley.pdf: 2218547 bytes, checksum: 33783f2ee07821db7f23103bcb5d7838 (MD5) Previous issue date: 2013-02-26 / The objective was to evaluate the clinical, pathological, and reproductive aspects of the Toxoplasma gondii experimental infection in goats. Firstly was studied the transmission T. gondii in goats inseminated vaginally with semen contaminated with strain tachyzoites CPG (genotype III). Were divided into two experimental groups (G1 and G2) each with five goats. The females of the G1 were inseminated with semen containing 1x105 tachyzoites and females G2 (control) with semen free tachyzoites (insemination = day 0). To confirm infection were performed serologic tests (indirect immunofluorescence) and detection of parasitic DNA (polymerase chain reaction) in blood and organs. For monitoring pregnancy ultrasound exams were used. In G1, seroconversion occurred between days 7 and 14 at 4/5 goats. In the same group, the DNA of T. gondii was present between days 7 and 49 in blood and various tissues of 3/5 goats and two kids born at full term. In G2, all samples were negative for both techniques. In the second experiment, the goats of the G1 in the first experiment were monitored in the acute and chronic phases of infection; embryonic reabsorption occurred in 4/5 goats in the acute phase, while in the chronic phase were observed in anestrus 2/5 goats, 1/5 goats had both hydrosalpinx and ovarian cysts. The third experiment investigated to venereal transmission of T. gondii in goats mated with breeder experimentally infected orally with oocysts of the ME-49 strain. Ten goats were allocated into two groups (G1 and G2) each with five animals. The female goats in G1 were mated with a breeder that had been experimentally infected with T. gondii oocysts whereas those in G2 (control) were mated with a serologically negative goat. The infection of the breeder and the females was confirmed through clinical, serological, molecular and histopathological findings. Seroconversion ocurred in the breeder infected on the 7th day post-infection (d.p.i.) and T. gondii DNA was present in the blood and semen in the 3th d.p.i. In G1, 2/5 goats seroconverted and DNA was present in the blood in 2/5 goats. In G2, all goats were negative in all tests. With regards to gestational development, the goats in G1 ocurred embryonic reabsorption in 1/5 in day 34 after mating, 1/5 aborted in day 42 after mating and 3/5 goats gave birth to full-term healthy kids. One of the kids exhibited PCR-positive blood at birth. In total, 2/5 of the females in G1 and 4/5 of the kids born alive in G1 exhibited PCR-positive in at least one organ. In G2, the goats gave birth goats healthy. In conclusion, artificial insemination with semen containing tachyzoites of T. gondii infected goats, causing reproductive pathologies during acute and chronic phases of infection. Furthermore, it was found that venereal transmission of T. gondii occurs in goats mated with an infected breeder. / Objetivou-se estudar os aspectos clínicos, patológicos e reprodutivos da infecção experimental por Toxoplasma gondii em caprinos. No primeiro experimento foi avaliada a transmissão de T. gondii em cabras inseminadas via vaginal com sêmen contaminado com taquizoítos da cepa CPG (Genótipo III). Foram formados dois grupos experimentais (G1 e G2) constituídos por cinco cabras cada um. As fêmeas do G1 foram inseminadas com sêmen contendo 1x105 taquizoítos e as fêmeas do G2 (controle) com sêmen livre de taquízoitos (inseminação=dia 0). Para confirmar a infecção foram realizados testes sorológicos (reação de imunofluorescência indireta) e detecção do DNA parasitário (reação em cadeia da polimerase) no sangue e órgãos. Para o acompanhamento gestacional foram utilizados exames ultrassonográficos. No G1, a soroconversão ocorreu entre os dias 7 e 14 em 4/5 cabras. Neste mesmo grupo, o DNA de T. gondii foi detectado entre os dias 7 e 49 no sangue e vários tecidos de 3/5 cabras e em dois cabritos nascidos a termo. No G2, todas as amostras foram negativas para ambas as técnicas. No segundo experimento, as cabras do G1 do primeiro experimento foram monitoradas nas fases aguda e crônica da infecção; reabsorção embrionária ocorreu em 4/5 cabras na fase aguda, enquanto que na fase crônica foram observados anestro em 2/5 cabras, hidrossalpinge em 1/5 cabras e cisto ovariano em 1/5 cabras. No terceiro experimento pesquisou-se a transmissão venérea de T. gondii em cabras acasaladas com o reprodutor infectado experimentalmente por via oral com oocistos da cepa ME-49. Dez cabras foram alocadas em dois grupos (G1 e G2) cada um com cinco animais, sendo as cabras do G1 acasaladas com o bode infectado e G2 (controle) acasaladas com bode sorologicamente negativo. A infecção do reprodutor e das cabras foi confirmada por meio dos achados clínicos, sorológicos, moleculares e histopatológicos. No reprodutor, a soroconversão ocorreu no 70 dia pós-infecção (d.p.i.) e o DNA para T. gondii esteve presente no sangue e sêmen no 30 d.p.i. No G1, 2/5 cabras soroconverteram e em 2/5 cabras o DNA foi detectado no sangue. As cabras do G2 e o reprodutor não infectado foram negativos em todos os testes. Em relação ao desenvolvimento gestacional, nas cabras do G1 ocorreu reabsorção embrionária em 1/5 no 340 dia após o acasalamento, 1/5 abortou no 420 dia após acasalamento e 3/5 pariram cabritos saudáveis a termo. No G1, o DNA de T. gondii estava presente no sangue em 1/5 cabritos ao nascimento e em pelo menos um órgão em 2/5 cabras e 4/5 cabritos nascidos vivos. As cabras do G2 pariram cabritos saudáveis. A partir dos resultados obtidos, conclui-se que a inseminação artificial com sêmen contaminado com taquizoítos de T. gondii infecta cabras, causando patologias reprodutivas durante as fases aguda e crônica da infecção. Além disso, constatou-se que a transmissão venérea por T. gondii ocorre em cabras acasaladas com reprodutor caprino infectado experimentalmente.