Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-12T11:09:27Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1226647 bytes, checksum: 9e3237bb24db4758f26f774a630a1f7e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-12T11:09:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1226647 bytes, checksum: 9e3237bb24db4758f26f774a630a1f7e (MD5) Previous issue date: 2002-10-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A proteína SBP (Sucrose Binding Protein) foi inicialmente identificada pela sua capacidade de se ligar a sacarose e parece estar envolvida na via de translocação de sacarose em plantas superiores. Nesta investigação, foram isolados de uma biblioteca genômica de soja, propagada em λZAPII, dois clones genômicos, que correspondem às formas alélicas do gene SBP2. O número de cópias gênicas da família SBP foi estimado por Southern blot e por FISH (Fluorescence in situ Hibridization), utilizando o cDNA SBP e o clone genômico SBP2 como sondas, em lâminas com núcleos interfásicos de soja. O padrão de hibridização demonstrou a existência de dois pares de genes homólogos, com razão de hibridização diferente, representando os dois genes distintos, SBP e SBP2. Para investigar a funcionalidade da sequência do promotor SBP2, aproximadamente 2,0 quilobases da região 5’ foram sequenciadas e fusionadas aos genes repórteres GUS (beta-glucuronidase) e GFP (Green Fluorescent Protein) e analisados em plantas de tabaco transgênicas. Os ensaios histoquímicos demonstraram que ambos os promotores exibem expressão tecido- específica. Estes resultados foram confirmados pela fluorescência tecido- específica da expressão de GFP. Consistente com seu envolvimento no transporte de sacarose a longa distância, os promotores SBP2 dirigiram a expressão dos genes repórteres com alta especificidade para o floema de todos os órgãos analisados, como meristema, caule, folha e raiz. Entretanto, altos níveis de expressão foram observados predominantemente no meristema e em folhas- dreno. Foi também demonstrado que o promotor SBP2 é regulado de modo dependente da forma e da concentração de açúcar disponível no meio de cultura de células de tabaco transgênico em suspensão. Deleções no promotor SBP2 foram feitas para a identificação de regiões contendo elementos regulatórios em cis. Ensaios histoquímicos com plantas transgênicas contendo as construções quiméricas com as deleções do promotor demonstraram que o padrão tecido-específico do gene SBP2 é coordenado pela interação entre elementos regulatórios positivos e negativos. A região contida entre as posições -2000 até -490 possui elementos positivos que potencializam a expressão no floema, uma vez que a deleção dessa região causou um decréscimo substancial na atividade do promotor. A deleção adicional do promotor até a posição -364 restaurou a atividade do promotor em todos os tecidos analisados. Como conseqüência, a atividade quantitativa de GUS foi muito superior àquela observada para o promotor intacto. Estes resultados indicam a presença de um elemento silenciador, na região delimitada pelas posições -489 a -364. Além disso, a região de -363 a -132 possui um elemento positivo, responsável pela expressão no meristema radicular, uma vez que a deleção deste fragmento silencia a expressão de GUS no meristema radicular. O padrão de expressão tecido- específico, das construções quiméricas das deleções do promotor, se correlaciona com a distribuição dos elementos DOF na seqüência do promotor, em associação com os elementos O2 e GCN4. Coletivamente, estes resultados mostram que o promotor SBP representa uma poderosa ferramenta biotecnológica útil para o direcionamento da expressão de genes alvos para o tecido vascular de plantas de soja e tabaco transgênicas. / Tese importada do Alexandria, apresenta somente resumo em português.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:36:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3795682 bytes, checksum: 12bec11cea96f50faf5ddfa5a06024dc (MD5) Previous issue date: 2007-03-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The soybean SBP2 (sucrose binding protein) promoter is capable to drive vascular tissue-specific expression of reporter genes in tobacco transgenic lines. This vascular-specific activity of the SBP2 promoter is confined to a distal region (-2000 to -700 sequences) designated CRD-A (cis-regulatory domain-A). Here, we first confirmed the tissue-specific activity of CRD-A through gain-of-function experiments, in which the CRD-A sequences were directly fused to 5´end of GUS cDNA, -136pSBP2-GUS and -92pSBP2-GUS constructs. In tobacco, CRD-A was able to reduce GUS activity in all organs analyzed, recapitulating in some cases the tissue-specific pattern of the full promoter. In addition, CRD-A promoted GUS transcription in the absence of the proximal TATA-containing region, which suggests that CRD-A may contain cis-regulatory elements to sustain basal transcription. In fact, this region (-2000 a -700) harbors several TATA box-like sequences, positions -790, -783 and -761, that potentially may function as alternative TATA boxes. To delimit the cis-regulatory elements responsible for the tissue-specific activity of SBP2 promoter, the -2000 to -700 sequence was divided into five fragments, which were fused to -92pSBP2-GUS construct and used to obtain transgenic lines. Histochemical analysis revealed that all the CRDA sub-fragments reduced the SBP2 promoter activity, as their fusion to the 5 end of -92pSBP2 altered its constitutive expression pattern. These results identified the presence of several potentially cis-regulatory domains. The region encompassing the sequences -1765 to -945 may contain strong shoot apex expression-repressing elements, capable to totally abolish expression, whereas the region -944 to -705 may harbor weaker repressing elements that restricted GUS expression to the vascular tissue. We also found several root expression silencers, operating in the root meristem (-1765 to -705) and in the root elongation zone (-1765 to -1485 and -1211 to -945). Furthermore, the region delimited by positions -1765 to -1485 also exhibited a strong root expressionrepressing element whose effect may be attenuated by cis-regulatory elements present in the -1485 to -705 region. Finally, a cis-element that confines GUS expression to the inner phloem of stem was identified in the region delimited by positions -1485 to -1212. The function of the identified cis-elements was evaluated through electrophoretic mobility shift assay (EMSA) that revealed sequence-specific interactions between putative transfactors from soybean and tobacco nuclear extracts and the -1765/-1485 (fragII) fragment from GmSBP2. To determine whether the SBP2 protein accumulation correlated with the tissuespecific promoter activity, a SBP2-GFP fusion was expressed in tobacco transgenic lines under the control of SBP2 promoter. Fluorescence analysis revealed that the SBP2 protein was, indeed, located in the vascular tissue, which was consistent with SBP2 promoter activity and the involvement of SBP2 in physiological process dependent of sucrose translocation. / O promotor do gene SBP2 (sucrose binding protein) de soja é capaz de dirigir a expressão tecido vascular-específica de genes repórteres em plantas transgênicas de tabaco. Esta regulação se deve à presença de domínios cisregulatórios distais (CRD-A, posição -2000 a -700) presentes no promotor. Neste trabalho, a atividade tecido-específica de CRD-A foi confirmada por meio de experimentos de ganho-de-função, nos quais o fragmento CRD-A foi diretamente fusionado ao gene repórter GUS e às construções -136pSBP2-GUS e -92pSBP2-GUS e sua atividade avaliada no sistema heterólogo de tabaco. CRDA foi capaz de reduzir a atividade de GUS em todos os órgãos analisados, restaurando, em alguns casos, o padrão tecido-específico do promotor completo. Além disso, observou-se que CRD-A é capaz de promover a transcrição de GUS, independente de promotor mínimo, indicando a presença de cis-elementos capazes de promoverem a transcrição basal. De fato, nessa região (-2000 a -700) foram identificados vários elementos TATA box, localizados nas posições -790, -783 e -761, que podem potencialmente funcionar como TATA boxes alternativos. No intuito de delimitar os cis-elementos responsáveis pelo padrão tecido-específico do promotor SBP2, a seqüência -2000 a -700 foi dividida em cinco fragmentos, os quais foram inseridos na construção -92pSBP2-GUS, e utilizados para obtenção de plantas transgênicas. Análises histoquímicas revelaram que todos os fragmentos foram capazes de reduzir a atividade do promotor SBP2, uma vez que sua inserção na extremidade 5 de -92pSBP2 alterou o padrão de expressão constitutiva do mesmo. Com base nestes resultados, diversas regiões potencialmente regulatórias foram identificadas. A região compreendida entre -1765 e -945 deve conter fortes elementos repressores para o ápice caulinar, capazes de abolir totalmente a atividade do promotor, enquanto que a região entre -944 e -705 demonstrou conter elementos repressores mais fracos, que restringiram a expressão ao tecido vascular. Foram encontrados vários elementos silenciadores para a raiz, tanto para o meristema radicular (região entre -1765 e -705), quanto para a zona de alongamento (de -1765 a -1485 e de -1211 a -945). Além disso, a região de -1765 a -1485 também apresenta um forte repressor para raiz, cujo efeito deve ser atenuado por ciselementos presentes entre -1485 e -705. Por fim, foi identificado um elemento responsável por restringir a expressão apenas ao floema interno no caule, na região entre -1485 e -1212. A funcionalidade dos cis-elementos identificados foi avaliada através do ensaio de mudança na mobilidade eletroforética (EMSA), tendo sido observada a interação seqüência-específica entre possíveis transfatores presentes em extratos nucleares de soja e de tabaco e o fragmento -1765/-1485 (fragII) de GmSBP2. A fim de verificar se o acúmulo da proteína SBP2 correlaciona-se com a atividade do promotor em tecidos específicos, foi obtida a proteína quimérica SBP2-GFP, sob o controle do promotor SBP2, em tabacos transgênicos. A análise de fluorescência revelou que a proteína SBP2 está, de fato, localizada na região de tecido vascular, consistente com o padrão de atividade do gene repórter e com seu envolvimento nos processos fisiológicos dependentes de translocação de sacarose.