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Estudo da adesão, sobrevivência e tubulogênese endotelial em modelo de células de glioma silenciadas para a expressão de Tenascina-C / Study of endothelial adhesion, survival and tubulogenesis in model of glioma cells silenced for Tenascin-c expressionLaila Ribeiro Fernandes 14 August 2013 (has links)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Recentemente, nosso grupo demonstrou que a matriz extracelular de astrocitomas promove a seleçãode células endoteliais altamente proliferativas, porém com reduzida capacidade tubulogênica, além de determinar a morte de uma segunda sub-população endotelial, por desaderência ou anoikis. Estratégias de simulação dos teores de tenascina-C (TN-C) e fibronectina (FN) nas matrizes de astrocitomas, realizados com ambas as proteínas purificadas na forma de substratos definidos, sugeriram que o balanço TN-C:FN estava relacionado com os fenótipos endoteliais observados. No entanto, este procedimento não permitia abordar a participação de outros componentes da matriz tumoral nativa neste processo. Com objetivo de estudar a modulação do fenótipo angiogênico das células endoteliais por matrizes de astrocitoma, realizamos o silenciamento da expressão de TN-C na linhagem de astrocitoma U-373 MG. O silenciamento foi confirmado por western blotting, PCR em tempo real e ELISA, que permitiram concluir que, no período pós-transfecção (120h) necessário para se obter matrizes tumorais nativas para ensaios funcionais com células endoteliais, as células U-373 MG mantiveram-se silenciadas em índices superiores a 90%. A diminuição de TN-C nas matrizes tumorais resultou em um pequeno (≅18%, em média), porém significativo aumento na taxa de adesão endotelial. HUVECs incubadas com a matriz secretadas por células silenciadas apresentaram uma redução de ≅35% do número de núcleos picnóticos, quando comparadas a HUVECs incubadas com a matriz de células U-373 MG (selvagens ou transfectadas com siRNA controle). O silenciamento da expressão da TN-C na matriz nas células U-373 MG restaurou ainda o defeito tubulogênico das células endoteliais, que passaram a apresentar formação de tubos comparável à obtida quando HUVECs foram incubadas com sua matriz autóloga, rica em FN. Tais resultados apoiam observações anteriores do grupo, que já sugeriam que a maior proporção de FN na matriz autóloga, comparada a matriz do astrocitoma, seria o fator principal para a seleção dos fenótipos angiogênicos observados, demonstrando mais uma vez a importância do balanço FN:TN-C na regulação de processos angiogênicos. Dados anteriores sugeriam ainda que a sub-população endotelial que morre por anoikisapós contato prolongado (24 horas) com matrizes de astrocitomas corresponde a células que já haviam entrado na fase S do ciclo celular, no início da incubação. A fim de nos aprofundarmos sobre a participação do ciclo celular neste processo, a expressão da proteína p27, um inibidor de quinases dependentes de ciclinas (CKI), também foi analisada. HUVECs incubadas com a matriz de astrocitoma apresentaram um aumento de 2 a 3 vezes na expressão de p27, quando comparada com HUVECs provenientes de sua matriz autóloga. No entanto, células endoteliais incubadas com matriz secretada por células U-373 MG silenciadas apresentaram um nível de expressão de p27 comparável ao das HUVECs incubadas com matriz secretada por células selvagens, indicando que a expressão de TN-C não modula, ou não está diretamente correlacionada à expressão da proteína p27. Este resultado sugere que outros componentes da matriz tumoral devam estar envolvidos na modulação do ciclo celular endotelial. / We have previously shown that extracellular matrices secreted by high-grade astrocitoma promotes the selection of highly proliferative and tubulogenesis-defective endothelial cells, while also leading to the death, by anoikis, of another endothelial subpopulation. The use of defined adhesion substrata containing various levels of tenascin-C (TN-C) and fibronectin (FN) allowed us to confirm that the balance between TN-C and FN was a major cause of the selection of both endothelial phenotypes. However, this strategy did not allow us to address the potential role of other molecular components present in tumor matrices. In the present work, we studied the effect of a matrix produced by U-373 MG cells previously silenced for TN-C expression in endothelial cell adhesion, survival and tubulogenic differentiation, as compared to the matrix secreted by wild-type astrocitoma cells. U-373 MG cells silencing was confirmed by Western blotting, real time RT-PCR and ELISA, and cells remained silenced (≥ 90 %) throughout the 120 hours period necessary for generating immobilized native matrices required for endothelial cell function assays. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) adhesion to the extracellular matrix secreted by astrocitoma cells silenced for TN-C expression was significantly increased by ≅18 %, as compared to wild-type tumor matrix. The number of HUVECs exhibiting picnotic nuclei a hallmark of advanced apoptosis has also been significantly decreased by ≅35 %, when endothelial cells were allowed to incubate with TN-C-depleted tumor matrix, as compared to the wild-type tumor matrix. Concerning angiogenic differentiation, endothelial cells incubated with the matrix produced by silenced U-373 cells were strongly attenuated for their tubulogenesis defect, as compared to HUVECs incubated with the TN-C-rich wild-type matrix. Thus, these data corroborated our previous observations that TN-C in astrocitoma matrices crucially interferes with endothelial cell differentiation. Besides adhesion, survival and tubulogenic differentiation, the responses of endothelial cells to astrocitomas matrices are also affected by cell cycle transitions. We have previously shown that endothelial cells undergoing anoikis had already transitioned through the S-phase of cell cycle at the moment of seeding. Thus, we decided to investigate the expression of p27 protein, an inhibitor of ciclin-dependent kinases (CKI) that has been already implicated in glioma angiogenesis. We found that HUVECs incubated with the matrix secreted by U-373 MG wild-type cells for 24 hours exbibited a 2 to 3-fold increase in p27 expression. In contrast to the other results discussed herein, these differences were not correlated with the expression of TN-C by U-373 MG cells, since the matrix produced by tumor cells silenced for TN-C did not alter the expression of p27 in endothelial cells. Overall, the present data suggest that, although TN-C in native tumor matrix does play a major role in endothelial cell angiogenic differentiation, other matrix components may act in concert with TN-C to modulate endothelial cell proliferation in tumor contexts.
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Estudo da adesão, sobrevivência e tubulogênese endotelial em modelo de células de glioma silenciadas para a expressão de Tenascina-C / Study of endothelial adhesion, survival and tubulogenesis in model of glioma cells silenced for Tenascin-c expressionLaila Ribeiro Fernandes 14 August 2013 (has links)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Recentemente, nosso grupo demonstrou que a matriz extracelular de astrocitomas promove a seleçãode células endoteliais altamente proliferativas, porém com reduzida capacidade tubulogênica, além de determinar a morte de uma segunda sub-população endotelial, por desaderência ou anoikis. Estratégias de simulação dos teores de tenascina-C (TN-C) e fibronectina (FN) nas matrizes de astrocitomas, realizados com ambas as proteínas purificadas na forma de substratos definidos, sugeriram que o balanço TN-C:FN estava relacionado com os fenótipos endoteliais observados. No entanto, este procedimento não permitia abordar a participação de outros componentes da matriz tumoral nativa neste processo. Com objetivo de estudar a modulação do fenótipo angiogênico das células endoteliais por matrizes de astrocitoma, realizamos o silenciamento da expressão de TN-C na linhagem de astrocitoma U-373 MG. O silenciamento foi confirmado por western blotting, PCR em tempo real e ELISA, que permitiram concluir que, no período pós-transfecção (120h) necessário para se obter matrizes tumorais nativas para ensaios funcionais com células endoteliais, as células U-373 MG mantiveram-se silenciadas em índices superiores a 90%. A diminuição de TN-C nas matrizes tumorais resultou em um pequeno (≅18%, em média), porém significativo aumento na taxa de adesão endotelial. HUVECs incubadas com a matriz secretadas por células silenciadas apresentaram uma redução de ≅35% do número de núcleos picnóticos, quando comparadas a HUVECs incubadas com a matriz de células U-373 MG (selvagens ou transfectadas com siRNA controle). O silenciamento da expressão da TN-C na matriz nas células U-373 MG restaurou ainda o defeito tubulogênico das células endoteliais, que passaram a apresentar formação de tubos comparável à obtida quando HUVECs foram incubadas com sua matriz autóloga, rica em FN. Tais resultados apoiam observações anteriores do grupo, que já sugeriam que a maior proporção de FN na matriz autóloga, comparada a matriz do astrocitoma, seria o fator principal para a seleção dos fenótipos angiogênicos observados, demonstrando mais uma vez a importância do balanço FN:TN-C na regulação de processos angiogênicos. Dados anteriores sugeriam ainda que a sub-população endotelial que morre por anoikisapós contato prolongado (24 horas) com matrizes de astrocitomas corresponde a células que já haviam entrado na fase S do ciclo celular, no início da incubação. A fim de nos aprofundarmos sobre a participação do ciclo celular neste processo, a expressão da proteína p27, um inibidor de quinases dependentes de ciclinas (CKI), também foi analisada. HUVECs incubadas com a matriz de astrocitoma apresentaram um aumento de 2 a 3 vezes na expressão de p27, quando comparada com HUVECs provenientes de sua matriz autóloga. No entanto, células endoteliais incubadas com matriz secretada por células U-373 MG silenciadas apresentaram um nível de expressão de p27 comparável ao das HUVECs incubadas com matriz secretada por células selvagens, indicando que a expressão de TN-C não modula, ou não está diretamente correlacionada à expressão da proteína p27. Este resultado sugere que outros componentes da matriz tumoral devam estar envolvidos na modulação do ciclo celular endotelial. / We have previously shown that extracellular matrices secreted by high-grade astrocitoma promotes the selection of highly proliferative and tubulogenesis-defective endothelial cells, while also leading to the death, by anoikis, of another endothelial subpopulation. The use of defined adhesion substrata containing various levels of tenascin-C (TN-C) and fibronectin (FN) allowed us to confirm that the balance between TN-C and FN was a major cause of the selection of both endothelial phenotypes. However, this strategy did not allow us to address the potential role of other molecular components present in tumor matrices. In the present work, we studied the effect of a matrix produced by U-373 MG cells previously silenced for TN-C expression in endothelial cell adhesion, survival and tubulogenic differentiation, as compared to the matrix secreted by wild-type astrocitoma cells. U-373 MG cells silencing was confirmed by Western blotting, real time RT-PCR and ELISA, and cells remained silenced (≥ 90 %) throughout the 120 hours period necessary for generating immobilized native matrices required for endothelial cell function assays. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) adhesion to the extracellular matrix secreted by astrocitoma cells silenced for TN-C expression was significantly increased by ≅18 %, as compared to wild-type tumor matrix. The number of HUVECs exhibiting picnotic nuclei a hallmark of advanced apoptosis has also been significantly decreased by ≅35 %, when endothelial cells were allowed to incubate with TN-C-depleted tumor matrix, as compared to the wild-type tumor matrix. Concerning angiogenic differentiation, endothelial cells incubated with the matrix produced by silenced U-373 cells were strongly attenuated for their tubulogenesis defect, as compared to HUVECs incubated with the TN-C-rich wild-type matrix. Thus, these data corroborated our previous observations that TN-C in astrocitoma matrices crucially interferes with endothelial cell differentiation. Besides adhesion, survival and tubulogenic differentiation, the responses of endothelial cells to astrocitomas matrices are also affected by cell cycle transitions. We have previously shown that endothelial cells undergoing anoikis had already transitioned through the S-phase of cell cycle at the moment of seeding. Thus, we decided to investigate the expression of p27 protein, an inhibitor of ciclin-dependent kinases (CKI) that has been already implicated in glioma angiogenesis. We found that HUVECs incubated with the matrix secreted by U-373 MG wild-type cells for 24 hours exbibited a 2 to 3-fold increase in p27 expression. In contrast to the other results discussed herein, these differences were not correlated with the expression of TN-C by U-373 MG cells, since the matrix produced by tumor cells silenced for TN-C did not alter the expression of p27 in endothelial cells. Overall, the present data suggest that, although TN-C in native tumor matrix does play a major role in endothelial cell angiogenic differentiation, other matrix components may act in concert with TN-C to modulate endothelial cell proliferation in tumor contexts.
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