Submitted by VANESSA ABREU SANCHES MARQUES null (van.marqs@gmail.com) on 2017-02-23T19:23:43Z No. of bitstreams: 1 Dissertação VANESSA MARQUES - final.pdf: 2551351 bytes, checksum: 08aba962e10de0b5101aa6db2928561f (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2017-02-24T19:12:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 marques_vas_me_araca.pdf: 2551351 bytes, checksum: 08aba962e10de0b5101aa6db2928561f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-24T19:12:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 marques_vas_me_araca.pdf: 2551351 bytes, checksum: 08aba962e10de0b5101aa6db2928561f (MD5) Previous issue date: 2017-02-21 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Objetivo: Avaliar a resposta tecidual e a capacidade de biomineralização dos materiais endodônticos SK Seal Root Canal Sealer (SK Seal), Sealer 26® e AH plus® em tecido subcutâneo de ratos. Material e Métodos: Vinte e quatro ratos Wistar (n=6) receberam implantes subcutâneo contendo os cimentos e um tubo vazio como controle. Após 7, 15, 30 e 60 dias, os animais foram eutanasiados e os tubos de polietileno foram removidos junto com o tecido circunjacente. Em seguida, os espécimes foram processados para análise em Hematoxilina-Eosina, von Kossa, luz polarizada e imunoistoquímica para fibronectina (FN) e tenascina (TN). Os dados foram tabulados e analisados através do teste de Kruskal-Wallis e Dunn (p<0,05). Resultados: Todos os materiais testados induziram uma reação inflamatória moderada aos 7 e 15 dias (p> 0,05). Não foram observadas diferenças entre os grupos após 30 ou 60 dias (p> 0,05). A cápsula fibrosa foi considerada espessa aos 7 dias, tornando-se fina no final do experimento. Todos os grupos apresentaram marcadores positivos para FN e TN em todos os tempos de análise, com maior imunomarcação para os cimentos em comparação ao grupo controle (p <0,05). Os cimentos não apresentaram von Kossa positiva ou estruturas birrefringentes à luz polarizada. Conclusão: Todos os cimentos testados apresentaram biocompatibilidade, porém não estimularam a mineralização. / FAPESP: 2015/08251-8

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Recentemente, nosso grupo demonstrou que a matriz extracelular de astrocitomas promove a seleçãode células endoteliais altamente proliferativas, porém com reduzida capacidade tubulogênica, além de determinar a morte de uma segunda sub-população endotelial, por desaderência ou anoikis. Estratégias de simulação dos teores de tenascina-C (TN-C) e fibronectina (FN) nas matrizes de astrocitomas, realizados com ambas as proteínas purificadas na forma de substratos definidos, sugeriram que o balanço TN-C:FN estava relacionado com os fenótipos endoteliais observados. No entanto, este procedimento não permitia abordar a participação de outros componentes da matriz tumoral nativa neste processo. Com objetivo de estudar a modulação do fenótipo angiogênico das células endoteliais por matrizes de astrocitoma, realizamos o silenciamento da expressão de TN-C na linhagem de astrocitoma U-373 MG. O silenciamento foi confirmado por western blotting, PCR em tempo real e ELISA, que permitiram concluir que, no período pós-transfecção (120h) necessário para se obter matrizes tumorais nativas para ensaios funcionais com células endoteliais, as células U-373 MG mantiveram-se silenciadas em índices superiores a 90%. A diminuição de TN-C nas matrizes tumorais resultou em um pequeno (&#8773;18%, em média), porém significativo aumento na taxa de adesão endotelial. HUVECs incubadas com a matriz secretadas por células silenciadas apresentaram uma redução de &#8773;35% do número de núcleos picnóticos, quando comparadas a HUVECs incubadas com a matriz de células U-373 MG (selvagens ou transfectadas com siRNA controle). O silenciamento da expressão da TN-C na matriz nas células U-373 MG restaurou ainda o defeito tubulogênico das células endoteliais, que passaram a apresentar formação de tubos comparável à obtida quando HUVECs foram incubadas com sua matriz autóloga, rica em FN. Tais resultados apoiam observações anteriores do grupo, que já sugeriam que a maior proporção de FN na matriz autóloga, comparada a matriz do astrocitoma, seria o fator principal para a seleção dos fenótipos angiogênicos observados, demonstrando mais uma vez a importância do balanço FN:TN-C na regulação de processos angiogênicos. Dados anteriores sugeriam ainda que a sub-população endotelial que morre por anoikisapós contato prolongado (24 horas) com matrizes de astrocitomas corresponde a células que já haviam entrado na fase S do ciclo celular, no início da incubação. A fim de nos aprofundarmos sobre a participação do ciclo celular neste processo, a expressão da proteína p27, um inibidor de quinases dependentes de ciclinas (CKI), também foi analisada. HUVECs incubadas com a matriz de astrocitoma apresentaram um aumento de 2 a 3 vezes na expressão de p27, quando comparada com HUVECs provenientes de sua matriz autóloga. No entanto, células endoteliais incubadas com matriz secretada por células U-373 MG silenciadas apresentaram um nível de expressão de p27 comparável ao das HUVECs incubadas com matriz secretada por células selvagens, indicando que a expressão de TN-C não modula, ou não está diretamente correlacionada à expressão da proteína p27. Este resultado sugere que outros componentes da matriz tumoral devam estar envolvidos na modulação do ciclo celular endotelial. / We have previously shown that extracellular matrices secreted by high-grade astrocitoma promotes the selection of highly proliferative and tubulogenesis-defective endothelial cells, while also leading to the death, by anoikis, of another endothelial subpopulation. The use of defined adhesion substrata containing various levels of tenascin-C (TN-C) and fibronectin (FN) allowed us to confirm that the balance between TN-C and FN was a major cause of the selection of both endothelial phenotypes. However, this strategy did not allow us to address the potential role of other molecular components present in tumor matrices. In the present work, we studied the effect of a matrix produced by U-373 MG cells previously silenced for TN-C expression in endothelial cell adhesion, survival and tubulogenic differentiation, as compared to the matrix secreted by wild-type astrocitoma cells. U-373 MG cells silencing was confirmed by Western blotting, real time RT-PCR and ELISA, and cells remained silenced (&#8805; 90 %) throughout the 120 hours period necessary for generating immobilized native matrices required for endothelial cell function assays. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) adhesion to the extracellular matrix secreted by astrocitoma cells silenced for TN-C expression was significantly increased by &#8773;18 %, as compared to wild-type tumor matrix. The number of HUVECs exhibiting picnotic nuclei a hallmark of advanced apoptosis has also been significantly decreased by &#8773;35 %, when endothelial cells were allowed to incubate with TN-C-depleted tumor matrix, as compared to the wild-type tumor matrix. Concerning angiogenic differentiation, endothelial cells incubated with the matrix produced by silenced U-373 cells were strongly attenuated for their tubulogenesis defect, as compared to HUVECs incubated with the TN-C-rich wild-type matrix. Thus, these data corroborated our previous observations that TN-C in astrocitoma matrices crucially interferes with endothelial cell differentiation. Besides adhesion, survival and tubulogenic differentiation, the responses of endothelial cells to astrocitomas matrices are also affected by cell cycle transitions. We have previously shown that endothelial cells undergoing anoikis had already transitioned through the S-phase of cell cycle at the moment of seeding. Thus, we decided to investigate the expression of p27 protein, an inhibitor of ciclin-dependent kinases (CKI) that has been already implicated in glioma angiogenesis. We found that HUVECs incubated with the matrix secreted by U-373 MG wild-type cells for 24 hours exbibited a 2 to 3-fold increase in p27 expression. In contrast to the other results discussed herein, these differences were not correlated with the expression of TN-C by U-373 MG cells, since the matrix produced by tumor cells silenced for TN-C did not alter the expression of p27 in endothelial cells. Overall, the present data suggest that, although TN-C in native tumor matrix does play a major role in endothelial cell angiogenic differentiation, other matrix components may act in concert with TN-C to modulate endothelial cell proliferation in tumor contexts.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Recentemente, nosso grupo demonstrou que a matriz extracelular de astrocitomas promove a seleçãode células endoteliais altamente proliferativas, porém com reduzida capacidade tubulogênica, além de determinar a morte de uma segunda sub-população endotelial, por desaderência ou anoikis. Estratégias de simulação dos teores de tenascina-C (TN-C) e fibronectina (FN) nas matrizes de astrocitomas, realizados com ambas as proteínas purificadas na forma de substratos definidos, sugeriram que o balanço TN-C:FN estava relacionado com os fenótipos endoteliais observados. No entanto, este procedimento não permitia abordar a participação de outros componentes da matriz tumoral nativa neste processo. Com objetivo de estudar a modulação do fenótipo angiogênico das células endoteliais por matrizes de astrocitoma, realizamos o silenciamento da expressão de TN-C na linhagem de astrocitoma U-373 MG. O silenciamento foi confirmado por western blotting, PCR em tempo real e ELISA, que permitiram concluir que, no período pós-transfecção (120h) necessário para se obter matrizes tumorais nativas para ensaios funcionais com células endoteliais, as células U-373 MG mantiveram-se silenciadas em índices superiores a 90%. A diminuição de TN-C nas matrizes tumorais resultou em um pequeno (&#8773;18%, em média), porém significativo aumento na taxa de adesão endotelial. HUVECs incubadas com a matriz secretadas por células silenciadas apresentaram uma redução de &#8773;35% do número de núcleos picnóticos, quando comparadas a HUVECs incubadas com a matriz de células U-373 MG (selvagens ou transfectadas com siRNA controle). O silenciamento da expressão da TN-C na matriz nas células U-373 MG restaurou ainda o defeito tubulogênico das células endoteliais, que passaram a apresentar formação de tubos comparável à obtida quando HUVECs foram incubadas com sua matriz autóloga, rica em FN. Tais resultados apoiam observações anteriores do grupo, que já sugeriam que a maior proporção de FN na matriz autóloga, comparada a matriz do astrocitoma, seria o fator principal para a seleção dos fenótipos angiogênicos observados, demonstrando mais uma vez a importância do balanço FN:TN-C na regulação de processos angiogênicos. Dados anteriores sugeriam ainda que a sub-população endotelial que morre por anoikisapós contato prolongado (24 horas) com matrizes de astrocitomas corresponde a células que já haviam entrado na fase S do ciclo celular, no início da incubação. A fim de nos aprofundarmos sobre a participação do ciclo celular neste processo, a expressão da proteína p27, um inibidor de quinases dependentes de ciclinas (CKI), também foi analisada. HUVECs incubadas com a matriz de astrocitoma apresentaram um aumento de 2 a 3 vezes na expressão de p27, quando comparada com HUVECs provenientes de sua matriz autóloga. No entanto, células endoteliais incubadas com matriz secretada por células U-373 MG silenciadas apresentaram um nível de expressão de p27 comparável ao das HUVECs incubadas com matriz secretada por células selvagens, indicando que a expressão de TN-C não modula, ou não está diretamente correlacionada à expressão da proteína p27. Este resultado sugere que outros componentes da matriz tumoral devam estar envolvidos na modulação do ciclo celular endotelial. / We have previously shown that extracellular matrices secreted by high-grade astrocitoma promotes the selection of highly proliferative and tubulogenesis-defective endothelial cells, while also leading to the death, by anoikis, of another endothelial subpopulation. The use of defined adhesion substrata containing various levels of tenascin-C (TN-C) and fibronectin (FN) allowed us to confirm that the balance between TN-C and FN was a major cause of the selection of both endothelial phenotypes. However, this strategy did not allow us to address the potential role of other molecular components present in tumor matrices. In the present work, we studied the effect of a matrix produced by U-373 MG cells previously silenced for TN-C expression in endothelial cell adhesion, survival and tubulogenic differentiation, as compared to the matrix secreted by wild-type astrocitoma cells. U-373 MG cells silencing was confirmed by Western blotting, real time RT-PCR and ELISA, and cells remained silenced (&#8805; 90 %) throughout the 120 hours period necessary for generating immobilized native matrices required for endothelial cell function assays. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) adhesion to the extracellular matrix secreted by astrocitoma cells silenced for TN-C expression was significantly increased by &#8773;18 %, as compared to wild-type tumor matrix. The number of HUVECs exhibiting picnotic nuclei a hallmark of advanced apoptosis has also been significantly decreased by &#8773;35 %, when endothelial cells were allowed to incubate with TN-C-depleted tumor matrix, as compared to the wild-type tumor matrix. Concerning angiogenic differentiation, endothelial cells incubated with the matrix produced by silenced U-373 cells were strongly attenuated for their tubulogenesis defect, as compared to HUVECs incubated with the TN-C-rich wild-type matrix. Thus, these data corroborated our previous observations that TN-C in astrocitoma matrices crucially interferes with endothelial cell differentiation. Besides adhesion, survival and tubulogenic differentiation, the responses of endothelial cells to astrocitomas matrices are also affected by cell cycle transitions. We have previously shown that endothelial cells undergoing anoikis had already transitioned through the S-phase of cell cycle at the moment of seeding. Thus, we decided to investigate the expression of p27 protein, an inhibitor of ciclin-dependent kinases (CKI) that has been already implicated in glioma angiogenesis. We found that HUVECs incubated with the matrix secreted by U-373 MG wild-type cells for 24 hours exbibited a 2 to 3-fold increase in p27 expression. In contrast to the other results discussed herein, these differences were not correlated with the expression of TN-C by U-373 MG cells, since the matrix produced by tumor cells silenced for TN-C did not alter the expression of p27 in endothelial cells. Overall, the present data suggest that, although TN-C in native tumor matrix does play a major role in endothelial cell angiogenic differentiation, other matrix components may act in concert with TN-C to modulate endothelial cell proliferation in tumor contexts.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:30:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Elaine Baldissera_TESE.pdf: 2456356 bytes, checksum: eaccf33a07294f70b9babaa3140cc017 (MD5) Previous issue date: 2006-07-06 / Aim Based on the great importance of the extracellular matrix (EM) in tissue development and repair, the aim of this study was to investigate the expression of their major glycoproteins, tenascin (TN) and fibronectin(FN) in the human pulp repair. Methodology Using immunohistochemistry, the expression of TN and FN was analyzed in forty-two human teeth, which were taken from a previous study. TN and FN profiles were evaluated after 7, 30, and 90 days after pulp capping with calcium hydroxide, being used three different haemostatic agents (0.9% salin solution, 5.25% sodium hypoclorite and 2% chlorhexidine digluconate) before pulp capping. Results There was no difference in the expression of TN and FN among the distinct haemostatic agents being all the time intervals taken into consideration. Both glycoproteins were found in all the pulp tissue, accomplishing the collagen fiber, and they were absent in all the mineralized tissues. Within 7 days post-treatment, it was observed a slightly more pronounced immunostaining on the exposure pulp site. Within 30 days, TN and FN demonstrated a stronger expression around the dentin barrier. TN also showed focal staining inside the reparative dentin, which was in mineralization. Within 90 days, it was observed a thin and linear expression of TN and FN delimitating the reparative dentin. In the predentin, TN showed strong immunostaining, and FN had a variable expression. Conclusions Based on the results, it may be concluded that there was no difference in the expression of TN and FN among the distinct haemostatic agents being all the time intervals taken into account. Moreover, TN and FN were present in pulp repair,confirming their active participation in this event. It might also be suggested that both glycoproteins are responsible for the odontoblastic differentiation and for the maintenance of the cell shape. It can also be concluded that TN and FN are important factors in the mineralization of the newly-formed dentin matrix. / O controle do sangramento frente a uma exposição pulpar é de fundamental importância no sucesso do capeamento direto. As soluções de hipoclorito de sódio e de gluconato de clorexidina têm sido utilizadas como agentes de limpeza e hemostasia na terapia pulpar conservadora. Alguns estudos têm indicado para o controle da hemorragia e sucesso do capeamento pulpar adesivo o hipoclorito de sódio (COX et al, 1998; COX et al., 1999). Além de ser bom agente antimicrobiano, o hipoclorito possui elevado Ph, o que implicaria na solubilização de fatores de crescimento da dentina, e conseqüentemente, na estimulação à formação de dentina (SMITH et al., 2002). No entanto, pesquisas também demonstram a atividade de dissolução tecidual do hipoclorito quando empregado a 5.25%. Porém esta é limitada às células superficiais pulpares sem efeitos adversos sobre o tecido pulpar subjacente (SENIA et al., 1971; ROSENFELD et al., 1978). Pouco se sabe a respeito da biocompatibilidade da clorexidina (THOMAS et al., 1995). Cox et al. (1998) sugeriram que esta substância poderia ser a causa de desastrosos resultados encontrados no estudo de Pameijer & Stanley (1998). Em contrapartida, a clorexidina a 0,2% utilizada no capeamento pulpar direto como agente hemostático e de limpeza, tem demonstrado boa performance em estudos em humanos (HORSTED et al., 2003) e em macacos (MURRAY et al. 2004) Diante das evidências apresentadas, pode-se observar que não há unanimidade entre os pesquisadores a respeito de qual dessas substâncias e suas respectivas concentrações seria mais efetiva na realização das terapias conservadoras vitais, especialmente no capeamento pulpar direto. Adicionalmente, as alterações na distribuição de componentes da matriz extracelular (ME) têm sido estudadas durante o desenvolvimento dentário e nos processos de reparo pulpar. As duas maiores glicoproteínas da ME, Fibronectina (FNC) e Tenascina (TNC) têm sido descritas como importantes para o estímulo e mobilidade celulares, durante a diferenciação de células odontoblastóides a partir de células multipotentes da polpa. No entanto, a participação da ME e sua interação com as reações celulares têm sido pouco exploradas e compreendidas. Desta forma, tornam-se fundamentais as investigações sobre a expressão dos componentes da 15 ME durante o processo de reparo pulpar, na tentativa de buscar melhor entendimento dos eventos de resposta deste tecido após o capeamento direto. O objetivo deste estudo é avaliar a biocompatibilidade do hipoclorito de sódio e do gluconato de clorexidina em diferentes concentrações, através de estudo in vitro de cultivo celular; a genotoxicidade dessas duas soluções, utilizando a reação de Feulgen para detecção e análise de micronúcleos e a expressão de componentes da matriz extracelular, através de estudo imunoistoquímico (técnica da estreptoavidina-biotina) em polpas humanas expostas, tratadas com os agentes hemostáticos hipoclorito de sódio a 5,25% e gluconato de clorexidina a 2%, empregados previamente ao capeamento pulpar direto. Para o ensaio de citotoxicidade do MTT será utilizada a linhagem celular NIH/3T3 (fibroblastos de rato). Este ensaio foi escolhido porque estudos prévios (COSTA, 2001; ZHANG et al., 2003) têm mostrado ser o mesmo apropriado para a avaliação da viabilidade ou citotoxicidade celulares, frente a materiais de uso odontológico. Serão testadas em diferentes tempos de exposição, as soluções de hipoclorito de sódio a 0,5%, 1%, 2,5% e 5,25% e de gluconato de clorexidina a 0,12%, 0,2%, 1% e 2%, bem como a solução salina 0,9%, que funcionará como controle negativo dos testes. Para o ensaio de genotoxicidade, será feita a análise semi-quantitativa dos micronúcleos de amostras previamente emblocadas, oriundas de 45 espécimens com polpas humanas tratadas com hipoclorito de sódio a 5,25% (n=16), gluconato de clorexidina (n=15) e