L'insuffisance cardiaque (IC) est une pathologie évolutive avec une forte morbi-mortalité suggérant que les traitements actuels ne modifient que peu les mécanismes physiopathologiques responsables de la maladie. L'inflammation et la réponse immune inappropriée sont récemment apparues comme de nouveaux acteurs de la progression de l'insuffisance cardiaque (IC). La réponse inflammatoire lors d'un stress tissulaire semble initiée par la néo-synthèse ou la libération de protéines normalement non présentes ou non accessibles dans le tissu. Ces molécules, appelées " damage associated molecular pattern " ou DAMPs, sont des ligands des récepteurs Toll like capable d'induire l'expression de cytokines et de chimiokines pro-inflammatoires. La ténascine-C (TNC), une protéine présente dans la matrice extracellulaire lors d'état inflammatoire est considérée comme une DAMP car elle est capable d'induire l'expression de cytokines pro-inflammatoires via TLR4. Bien que l'expression de la TNC soit augmentée lors de pathologies cardiaques, son rôle exact dans les processus inflammatoires au cours d'une surcharge de pression cardiaque est encore peu défini. Nous avons montré que la TNC est exprimée dans le cœur hypertrophié où elle se concentre en foyers associés à un fort infiltrat monocytaire. L'utilisation de chimères hématopoïétiques a permis de montrer que la TNC est exprimée exclusivement par les cellules stromales du compartiment cardiaque et notamment les fibroblastes et non les cellules inflammatoires. Grâce à l'utilisation de souris dont le gène codant pour la TNC a été invalidé (TNCKO), nous avons mesuré l'impact de l'absence de TNC sur la fonction et le remodelage cardiaques après constriction de l'aorte transverse (TAC). L'analyse des paramètres échocardiographiques a montré une meilleure fonction contractile cardiaque chez les souris TNCKO par rapport aux souris WT après TAC. De plus la réponse inflammatoire cardiaque induite par la constriction est fortement atténuée chez les souris TNCKO par rapport aux WT. En effet, l'expression cardiaque des cytokines et des chimiokines pro-inflammatoires ainsi que l'infiltration monocytaire sont prévenues chez les souris TNCKO après TAC. Le développement d'un lentivecteur recombinant pour la TNC (LV-TNC), a permis de montrer que cette protéine stimule, in vitro, l'expression de cytokines et de chimiokines pro-inflammatoires (CCL2, CCL5) par les fibroblastes cardiaques. De plus, le microenvironement produit par la TNC induit un effet attractant sur les monocytes in vitro et in vivo et favorise la polarisation des macrophages vers un phénotype pro-inflammatoire. En plus de son effet sur le chimiotactisme monocytaire, nous avons observé que la TNC modifie également la clairance des macrophages du tissu cardiaque hypertrophié. Le suivi des monocytes/macrophages après marquage par des billes fluorescentes nous a permis de montrer que leur migration vers les ganglions lymphatiques drainants le cœur est augmentée chez les souris KO après TAC. En effet la TNC semble inhiber l'expression de CCR7 par les macrophages cardiaques, récepteur majeur impliqué dans le processus de drainage des cellules immunes dans les vaisseaux lymphatiques. En conclusion, la TNC aggrave le remodelage cardiaque et la transition vers l'IC dans un modèle murin de surcharge de pression. Elle entraine un état inflammatoire en induisant l'expression de gènes pro-inflammatoires par les fibroblastes cardiaques favorisant ainsi l'infiltration monocytaire dans le tissu. La TNC maintient l'inflammation en polarisant les macrophages vers un phénotype pro-inflammatoire. Enfin, la TNC inhibe le drainage des macrophages cardiaques vers les ganglions lymphatiques en diminuant l'expression de CCR7. Cette accumulation de cellules inflammatoires dans le tissu cardiaque induite par la TNC semble favoriser la dysfonction contractile et pourrait participer à l'apparition de l'IC. / Sustained pressure overload leads to myocardial hypertrophy and subsequent heart failure, a leading cause of morbidity and mortality. Several studies suggest a potential role of inflammation induced by the Danger Associated Molecular Patterns (DAMPs) in the development of heart failure. These molecules are able to induce pro-inflammatory cytokines synthesis through Toll like receptors (TLRs). Tenascin-C (TNC), an extracellular matrix glycoprotein considered as DAMP is slightly present in adult tissue but highly expressed in various cardiac diseases. We investigated the prospective role of TNC on inflammation in a cardiac remodeling induced by pressure overload. An experimental model of pressure overload (transverse aortic constriction or TAC) was established in WT and knockout mice for TNC (TNCKO). TNC was greatly expressed after transverse aortic constriction in cardiac tissue of WT animals. TNCKO mice displayed no ventricular dilatation and a preserve cardiac function compared with wild type animals after TAC. In absence of TNC, mice showed a blunted cardiac inflammatory response and a decreased myocardial remodeling. Bone marrow transplantation from wild-type mice into TNCKO animals and vice versa indicated that TNC is exclusively synthesized by cardiac cells and not by hematopoietic cells. Furthermore, immunostaining experiments showed that TNC was found in areas where infiltration of monocytes/macrophages was abundant. To better understand the role of TNC, cardiac fibroblasts were transduced by a lentivector encoding for GFP (LV-GFP) or TNC (LV-TNC). TNC production by fibroblasts stimulated their expression of pro-inflammatory cytokines and chemokines (CCL2, CCL5). In vitro chemotaxis assays showed that conditioned medium from LV-TNC transduced cardiac fibroblasts exhibited chemoattractant properties for bone marrow derived monocytes. Moreover, TNC production by cardiac fibroblasts increased macrophages phagocytic activity, pro-inflammatory markers expression and nitrite release suggesting a pro-inflammatory polarization of macrophages. The administration of a recombinant TNC lentivector in the myocardium was sufficient to induce monocyte infiltration, promote cytokine and chemokine expression and a contractile dysfunction. Finally, TNC did not modify macrophage apoptosis and proliferation but hindered cardiac macrophage clearance by reducing their migration into lymph nodes. In presence of TNC, expression of CCR7 on monocyte/macrophage was down-regulated. CCR7 has been described as the major receptor controlling immune cells migration to lymph nodes. In vivo tracking of monocytes/macrophages by the injection of fluorescents phagocytic beads confirmed a higher number of bead-positive macrophages in lymph nodes of TNCKO mice than in WT mice after TAC. Our results identified cardiac TNC as a monocyte chemoattractant factor increasing chemokines synthesis, decreasing emigration signals and thus promoting the maintenance of monocyte/macrophage in pathological heart. By promoting chronic inflammation, TNC accentuated cardiac dilation and deleterious outcome of cardiac remodeling and function during pressure overload.

Ce travail de thèse fait partie d’un effort pour le développement des biomarqueurs, actuellement largement inexistants, pour une meilleure classification, pour une détermination plus précise du pronostic, et pour la prédiction de la réponse au traitement des tumeurs gliales malignes de l’enfant (épendymomes et gliomes de haut grade). Dans certains cas, ces biomarqueurs peuvent aussi devenir des cibles thérapeutiques.Dans ces études, nous avons pu montrer que la surexpression fréquente des marqueurs neuronaux distingue les épendymomes supratentoriels des formes infratentorielles. Parmi les épendymomes supratentoriels, une forte expression de neurofilament 70 (NF) est corrélée avec une meilleure survie sans récidive. La tenascine C (TNC) est surexprimée dans les épendymomes infratentoriels. Une étude de collaboration européenne multi-institutionnelle a été mise en place, permettant d’analyser une cohorte pédiatrique de 250 patients atteints d’un épendymome, et de démontrer la forte immunoexpression de TNC comme un marqueur robuste, associé a des survies globale et sans récidive plus péjoratives, particulièrement parmi les enfants âgés de moins de trois ans. Ceci a été validé dans une cohorte indépendante. Des immunomarquages pour NF et TNC pourraient être utilisés en clinique pour aider à déterminer le pronostic des épendymomes chez l’enfant.Une analyse des marqueurs pour la prédiction de la réponse à une thérapie ciblée anti-EGFR (erlotinib) a été réalisée par imunnohistochimie et FISH. La perte fréquente de PTEN dans les gliomes infiltrants du tronc cérébrale et la confirmation des caractéristiques des certains sous groupes (avec une forte expression de EGFR ou avec une différentiation oligodendrogliale) nous a permis de dessiner le protocole pour la prochaine étude de phase III pour cette maladie dans le cadre d’un futur essai thérapeutique de phase I/II. Nous rapportons par ailleurs des mutations du gène PI3KCA dans certains gliomes infiltrants du tronc cérébral, qui comme la perte d’expression de PTEN pourrait entrainer une activation de la voie mTOR qui devient donc une cible thérapeutique majeure théorique dans cette maladie. Des études ultérieures seront nécessaires pour définir le rôle de l’interaction entre la perte de PTEN, la surexpression de EGFR, la différentiation oligodendrogliale, les mutations de PI3KCA et d’autres altérations récemment décrites, (gains et amplifications de PDGFRA/MET mutations de TP53) et leur relation avec le devenir des patients sous traitement ciblé et les thérapies ciblées les plus intéressantes dans cette maladie uniformément fatale.Ce travail de thèse nous a permis d’explorer le rôle de la pathologie moléculaire dans la prise en charge des épendymomes et gliomas de haut grade chez l’enfant. / Biomarkers for the classification, clinical management and prognosis of pediatric brain tumors (ependymoma and high grade glioma, (HGG)) are lacking. To address this, biomarkers were developed and explored in view of classification, prognostication, target identification and prediction of the efficacy of treatment for patients with such tumors.We show that overexpression of neuronal markers distinguishes supratentorial from infratentorial ependymoma, and among the former higher immunoexpression of neurofilament 70 (NEFL) is correlated with better progression free survival (PFS). Tenascin-C (TNC) is significantly overexpressed in infratentorial ependymoma. A multi-institutional European ependymoma collaboration group was established and analyses were performed in a pediatric cohort of 250 patients, where immunohistochemistry (IHC) for TNC showed to be a robust marker of poor overall survival (OS) and PFS, particularly among children under 3 years, this being further validated in an independent cohort. Techniques and scoring performed in different laboratories were highly reproducible. IHC for NEFL and TNC could be used for prognostication of pediatric ependymoma.The analysis of putative predictive markers for the response to targeted therapies in pediatric HGG in the setting of a clinical trial with the anti-EGFR agent erlotinib was performed by IHC and fluorescent in situ hybridization. The frequent loss of PTEN in diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG) and the confirmation of the biological singularity of the certain subgroups (expressing EGFR, displaying oligodendroglial differentiation) which seem to be associated with better response to erlotinib have helped our group to establish the design of the next Phase III protocol for this disease at our institution. We report mutations in PI3KCA constituting the first identification of oncogene mutations in some DIPG, which further highlight their biological heterogeneity. Further studies are needed to define the interaction between PTEN loss, EGFR overexpression, oligodendroglial differentiation, PI3KCA mutations and other recent findings such as PDGFRA/MET gains/amplification and TP53 mutations in these heterogeneous lesions and their relationship to the outcome of patients under new targeted therapies for this largely fatal disease.This thesis has allowed us to explore the molecular pathology in the context of biology and clinical setting of pediatric brain tumors.