Few empirical studies examine the influence that the maternal parasite environment can have on offspring fitness (maternal effects) in invertebrates. Several recent studies have found that mothers can adjust offspring phenotype to counter the negative effects of parasite infection. In this thesis I subjected the parental generation of the host species, Tenebrio molitor (Insecta: Coleoptera), to a high parasite, high density, or control treatment. Offspring were subsequently subjected to either the same stress, the alternate stress, or to the control, and fitness-related life history traits were measured in both generations. The results from this thesis do not support the hypothesis that T. molitor mothers influence offspring fitness in a positive way. Instead, maternal effects led to a reduction in offspring fitness under both types of stress. At least under some environmental conditions, females invest in their fitness at the expense of their offspring.

Os estudos da função intestinal foram particularmente estimulados após a conscientização de que o tubo digestivo é uma enorme interface relativamente pouco protegida entre o inseto e o meio ambiente e pode ser usado como alvo para controle de pragas. Neste contexto, nosso trabalho envolve a purificação e caracterização de uma α-manosidase solúvel e a detecção de uma α-manosidase de membrana. As α-manosidases pertencem a uma família de exoglicosidases as quais hidrolisam resíduos de α-D-manosil a partir de terminais não redutores de oligossacarídeos. Estas enzimas são implicadas no catabolismo de carboidratos e na via de N-glicosilação protéica em insetos, mas pouco se sabe sobre a bioquímica destas glicosidases. O Tenebrio molitor é um Coleoptera bastante estudado pelo nosso laboratório devido a sua relevância como praga agrícola e o seu posicionamento em um ponto estratégico da árvore filogenética de insetos. O estudo de distribuição desta enzima mostrou que a α-manosidase encontra-se, principalmente, como uma enzima solúvel no conteúdo anterior e médio do intestino médio, mas também existe uma atividade significante na fração de membrana. Para confirmar a existência desta enzima de membrana, microvilosidades foram purificadas por precipitação diferencial com cálcio. A enzima aminopeptidase foi utilizada como marcadora, uma vez que sabe-se que esta enzima é uma típica de membrana microvilar. Como a α-manosidase solúvel é majoritária demos início a sua purificação e posterior caracterização. A sua purificação foi realizada utilizando uma combinação de quatro passos de cromatografia: Uma de troca iônica em Hitrap Q XL (Amersham/Bioscience), duas filtrações em gel, uma em Superdex 75 e outra em Superdex 200 (Amersham/Bioscience) usando o sistema AKTA, e o último passo é uma hidrofóbica em Phenyl Superose. Nós observamos a presença de dois picos de atividade nomeados de Man 1 e Man 2, sugerindo a existência de duas α- manosidases solúveis, que se diferem quanto a hidrofobicidade. O pH ótimo das α-manosidases é de 5,6 e sua massa molecular, determinada por cromatografia de 8 filtração em gel, é de 123 kDa, e no SDS-PAGE observamos uma única banda de 70 KDa, indicando a existência de duas subunidades. Em um gel nativo revelado com o substrato fluorescente (metilumbelliferil-α-D-manopiranosídeo) nota-se somente uma banda de atividade. A Man 2 possui pI de 3,38. α-manosidases de T. molitor seguem a cinética de Michaelis-Menten com Km para o substrato p-nitrofenil-α-D-manopiranosídeo de 0,84 mM para Man 1 e 0,62 mM para Man 2. Também foram feitos ensaios de inibição com dois inibidores que sabidamente inibem carboidrases, um é o deoximanojirimicina e o outro é a swainsonina. O Ki encontrado para o primeiro inibidor foi de 0,12 mM para Man 1 e 0,15 mM para Man 2 e o Ki para o segundo inibidor foi de 67,8 nM para Man 1 e 63 nM para Man 2, sendo ambos inibidores competitivos. O fato destas enzimas serem inibidas apenas por Swainsonina em concentrações razoáveis, permite a sua classificação como tipo II. Isso sugere que elas são derivadas da forma lisossômica, embora apresente pH ótimo alterado. / Studies of intestinal function were prompted after noticing that the gut is a huge and relatively unprotected interface between the insect and the environment and can thus be used as a target for pest control. In this context, our work involves the purification and characterization of an soluble alpha-mannosidase and detection of a membrane α-mannosidase. α-Mannosidases are a family of exoglycosidases which hydrolyse α-D-mannosyl residues from terminal non-reducing end of oligossacharides. These enzymes are implicated in the catabolism of carbohydrates and N-linked protein glycosylations in insects, but little is known on this biochemistry. T.molitor is a Coleoptera studied in our laboratory because of its relevance as agricultural pest and its position at a strategic point in the phylogenetic tree of insects. α-Mannosidase is more active in the anterior and middle midgut content of T.molitor larvae, although there is a significant activity in the membrane fraction. To confirm the existence of this membrane enzyme, microvilli were purified by differential precipitation with calcium. Aminopeptidase was used as a marker, since it is known that it is a typical microvilar membrane enzyme. Most α-mannosidase activity is soluble. This led us to purify this enzyme for further characterization. The purification of T. molitor α-mannosidase was attained by using a combination of four chromatographic steps: an anion-exchange chromatography in Hitrap Q XL (Amersham/Bioscience), two gel filtration chromatographies, one in Superdex 200 and another in Superdex 75 (Amersham/Bioscience) using an AKTA system, and the last step is a Hydrophobic cromatography in Phenyl Superose. Two peaks of activity were resolved: Man 1 and Man 2, suggesting the existence of two soluble α-mannosidases, differing only in hydrophobicity. The optimum pH of the α- mannosidases is 5.6 and the molecular mass is 123 KDa determined by gel filtration and 70 KDa in the case of SDS PAGE. This suggests that the holoenzyme has two subunits. In a native gel revealed with the fluorescent substrate (methylumbelliferyl-α-D-mannopyranoside) only one band of activity is seen. Man 2 has pI 3.38. T. molitor α-mannosidases followed Michaelis-Menten kinetics with a Km value of 0.84 mM for Man 1 and 0.62 mM for Man 2 using p-nitrophenyl-α-D-mannopyranoside as substrate. Inhibition tests were made with typical inhibitors of α-mannosidases: one is the 1-deoxymannojirimycin and the other is the Swainsonine. The Ki for the first was of 0.12 mM for Man 1 and 0.15 mM for Man 2 and for the second was 67.8 nM for Man 1 and 63 nM for Man 2. Both were competitive inhibitors. The fact that the enzymes are inhibited only by swainsonine in reasonable concentrations, allows us to classify them as type II. This suggests that they are derived from the lysosomal form, although they have an altered optimum pH.

Devido aos problemas, ambientais e à população humana, causados pelos inseticidas químicos, novas investigações para o controle de insetos tornaram-se necessárias. Para isto, um maior conhecimento sobre a fisiologia digestiva dos insetos torna-se essencial, visto que o intestino é uma interface, grande e relativamente desprotegida, entre o inseto e o seu ambiente. Neste contexto, nosso trabalho envolve a purificação e caracterização de uma dipeptidase e de uma carboxipeptidase digestivas de T. molitor. Estas enzimas, compreendem as classes de enzimas digestivas de insetos menos estudadas. O estudo de distribuição das atividades de dipeptidase e carboxipeptidase nas diferentes regiões do intestino médio de larvas de T. molitor mostrou que essas enzimas encontram-se majoritariamente no conteúdo luminal. Para a purificação da dipeptidase e carboxipeptidase foram utilizadas cromatografias de troca iônica e filtração em gel. A carboxipeptidase purificada era muito instável para estudos mais detalhados. O estudo dos parâmetros cinéticos mostrou que a dipeptidase digestiva de T. molitor possui massa molecular de 38,6 kDa, pH ótimo 7,4, baixa solubilidade a fenantrolina e parece preferir dipeptídeos com cadeia lateral volumosa na posição P1. Devido a essas propriedades, mesmo sendo solúvel, assemelha-se a dipeptidase de membrana (EC 3.4.13.19). / Because of adverse effects caused by insecticides in environment and in animals and humans, new methods for insect control are necessary. Knowledge on insect digestive physiology may be instrumental in this direction, as the gut is the major interface between insect and its environment. Our work involves the purification and characterization of a digestive carboxypeptidase and a digestive dipeptidase from Tenebrio molitor. Those enzymes comprise the class of insect digestive enzymes less studied. Distribution studies showed that T. molitor dipeptidase and carboxypeptidase are more active in the midgut content. The purification of T. molitor dipeptidase and carboxypeptidase was attained using a combination of anion-exchange chromatographies and gel filtration. The optimum pH of dipeptidase is 7.6 and the carboxypeptidase is 7.4. The kinetic parameters showed that the T. molitor digestive dipeptidase prefers as substrates dipeptides having a large lateral chain in P1 position.

Os estudos da função intestinal foram particularmente estimulados após a conscientização de que o tubo digestivo é uma enorme interface relativamente pouco protegida entre o inseto e o meio ambiente e pode ser usado como alvo para controle de pragas. Neste contexto, nosso trabalho envolve a purificação e caracterização de uma α-manosidase solúvel e a detecção de uma α-manosidase de membrana. As α-manosidases pertencem a uma família de exoglicosidases as quais hidrolisam resíduos de α-D-manosil a partir de terminais não redutores de oligossacarídeos. Estas enzimas são implicadas no catabolismo de carboidratos e na via de N-glicosilação protéica em insetos, mas pouco se sabe sobre a bioquímica destas glicosidases. O Tenebrio molitor é um Coleoptera bastante estudado pelo nosso laboratório devido a sua relevância como praga agrícola e o seu posicionamento em um ponto estratégico da árvore filogenética de insetos. O estudo de distribuição desta enzima mostrou que a α-manosidase encontra-se, principalmente, como uma enzima solúvel no conteúdo anterior e médio do intestino médio, mas também existe uma atividade significante na fração de membrana. Para confirmar a existência desta enzima de membrana, microvilosidades foram purificadas por precipitação diferencial com cálcio. A enzima aminopeptidase foi utilizada como marcadora, uma vez que sabe-se que esta enzima é uma típica de membrana microvilar. Como a α-manosidase solúvel é majoritária demos início a sua purificação e posterior caracterização. A sua purificação foi realizada utilizando uma combinação de quatro passos de cromatografia: Uma de troca iônica em Hitrap Q XL (Amersham/Bioscience), duas filtrações em gel, uma em Superdex 75 e outra em Superdex 200 (Amersham/Bioscience) usando o sistema AKTA, e o último passo é uma hidrofóbica em Phenyl Superose. Nós observamos a presença de dois picos de atividade nomeados de Man 1 e Man 2, sugerindo a existência de duas α- manosidases solúveis, que se diferem quanto a hidrofobicidade. O pH ótimo das α-manosidases é de 5,6 e sua massa molecular, determinada por cromatografia de 8 filtração em gel, é de 123 kDa, e no SDS-PAGE observamos uma única banda de 70 KDa, indicando a existência de duas subunidades. Em um gel nativo revelado com o substrato fluorescente (metilumbelliferil-α-D-manopiranosídeo) nota-se somente uma banda de atividade. A Man 2 possui pI de 3,38. α-manosidases de T. molitor seguem a cinética de Michaelis-Menten com Km para o substrato p-nitrofenil-α-D-manopiranosídeo de 0,84 mM para Man 1 e 0,62 mM para Man 2. Também foram feitos ensaios de inibição com dois inibidores que sabidamente inibem carboidrases, um é o deoximanojirimicina e o outro é a swainsonina. O Ki encontrado para o primeiro inibidor foi de 0,12 mM para Man 1 e 0,15 mM para Man 2 e o Ki para o segundo inibidor foi de 67,8 nM para Man 1 e 63 nM para Man 2, sendo ambos inibidores competitivos. O fato destas enzimas serem inibidas apenas por Swainsonina em concentrações razoáveis, permite a sua classificação como tipo II. Isso sugere que elas são derivadas da forma lisossômica, embora apresente pH ótimo alterado. / Studies of intestinal function were prompted after noticing that the gut is a huge and relatively unprotected interface between the insect and the environment and can thus be used as a target for pest control. In this context, our work involves the purification and characterization of an soluble alpha-mannosidase and detection of a membrane α-mannosidase. α-Mannosidases are a family of exoglycosidases which hydrolyse α-D-mannosyl residues from terminal non-reducing end of oligossacharides. These enzymes are implicated in the catabolism of carbohydrates and N-linked protein glycosylations in insects, but little is known on this biochemistry. T.molitor is a Coleoptera studied in our laboratory because of its relevance as agricultural pest and its position at a strategic point in the phylogenetic tree of insects. α-Mannosidase is more active in the anterior and middle midgut content of T.molitor larvae, although there is a significant activity in the membrane fraction. To confirm the existence of this membrane enzyme, microvilli were purified by differential precipitation with calcium. Aminopeptidase was used as a marker, since it is known that it is a typical microvilar membrane enzyme. Most α-mannosidase activity is soluble. This led us to purify this enzyme for further characterization. The purification of T. molitor α-mannosidase was attained by using a combination of four chromatographic steps: an anion-exchange chromatography in Hitrap Q XL (Amersham/Bioscience), two gel filtration chromatographies, one in Superdex 200 and another in Superdex 75 (Amersham/Bioscience) using an AKTA system, and the last step is a Hydrophobic cromatography in Phenyl Superose. Two peaks of activity were resolved: Man 1 and Man 2, suggesting the existence of two soluble α-mannosidases, differing only in hydrophobicity. The optimum pH of the α- mannosidases is 5.6 and the molecular mass is 123 KDa determined by gel filtration and 70 KDa in the case of SDS PAGE. This suggests that the holoenzyme has two subunits. In a native gel revealed with the fluorescent substrate (methylumbelliferyl-α-D-mannopyranoside) only one band of activity is seen. Man 2 has pI 3.38. T. molitor α-mannosidases followed Michaelis-Menten kinetics with a Km value of 0.84 mM for Man 1 and 0.62 mM for Man 2 using p-nitrophenyl-α-D-mannopyranoside as substrate. Inhibition tests were made with typical inhibitors of α-mannosidases: one is the 1-deoxymannojirimycin and the other is the Swainsonine. The Ki for the first was of 0.12 mM for Man 1 and 0.15 mM for Man 2 and for the second was 67.8 nM for Man 1 and 63 nM for Man 2. Both were competitive inhibitors. The fact that the enzymes are inhibited only by swainsonine in reasonable concentrations, allows us to classify them as type II. This suggests that they are derived from the lysosomal form, although they have an altered optimum pH.

Devido aos problemas, ambientais e à população humana, causados pelos inseticidas químicos, novas investigações para o controle de insetos tornaram-se necessárias. Para isto, um maior conhecimento sobre a fisiologia digestiva dos insetos torna-se essencial, visto que o intestino é uma interface, grande e relativamente desprotegida, entre o inseto e o seu ambiente. Neste contexto, nosso trabalho envolve a purificação e caracterização de uma dipeptidase e de uma carboxipeptidase digestivas de T. molitor. Estas enzimas, compreendem as classes de enzimas digestivas de insetos menos estudadas. O estudo de distribuição das atividades de dipeptidase e carboxipeptidase nas diferentes regiões do intestino médio de larvas de T. molitor mostrou que essas enzimas encontram-se majoritariamente no conteúdo luminal. Para a purificação da dipeptidase e carboxipeptidase foram utilizadas cromatografias de troca iônica e filtração em gel. A carboxipeptidase purificada era muito instável para estudos mais detalhados. O estudo dos parâmetros cinéticos mostrou que a dipeptidase digestiva de T. molitor possui massa molecular de 38,6 kDa, pH ótimo 7,4, baixa solubilidade a fenantrolina e parece preferir dipeptídeos com cadeia lateral volumosa na posição P1. Devido a essas propriedades, mesmo sendo solúvel, assemelha-se a dipeptidase de membrana (EC 3.4.13.19). / Because of adverse effects caused by insecticides in environment and in animals and humans, new methods for insect control are necessary. Knowledge on insect digestive physiology may be instrumental in this direction, as the gut is the major interface between insect and its environment. Our work involves the purification and characterization of a digestive carboxypeptidase and a digestive dipeptidase from Tenebrio molitor. Those enzymes comprise the class of insect digestive enzymes less studied. Distribution studies showed that T. molitor dipeptidase and carboxypeptidase are more active in the midgut content. The purification of T. molitor dipeptidase and carboxypeptidase was attained using a combination of anion-exchange chromatographies and gel filtration. The optimum pH of dipeptidase is 7.6 and the carboxypeptidase is 7.4. The kinetic parameters showed that the T. molitor digestive dipeptidase prefers as substrates dipeptides having a large lateral chain in P1 position.

This thesis was developed in order to determine whether the selected species most commonly kept feeding insects affect fertility in captive bred assassin bugs \kur{Platymeris biguttatus}. Used feeding insects were \kur{Blaptica dubia} roaches, \kur{Acheta domestica} crickets and larvae of \kur{Tenebrio molitor} bugs. The reason of using assassin bugs \kur{Platymeris biguttatus} was their popularity among breeders, their easy care needs and their superior fertility. Assassin bugs were kept in an air conditioned room with a constant temperature conditions and light regime. It has been shown that the given diet has no effect on fertility in this kind of bugs, also that breeding in groups has negative impact on fertility of this assassin bugs species. The results of this study could demonstrate the importance of proper feeding in keeping these bugs and help breeders to have better results.

This diploma theses focuses on comparison of natural and intentionally inducated supressiveness of environment induced by application of entomopathogenic fungi Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Isaria fumosorosea a Lecanicillium muscarium. In tests were evaluated the in vitro parameters as well as the effectiveness in vivo biotests on insect host larva Tenebrio molitor. The species of entomopatoghenic fungi were applied in suspensions, single strains and also in combination of two strains. In the in vitro conditions the possibilities of objective evaluation of the supresivity level were tested by using the CFU test (Colony Forming Units) on three different nutrient media (PDA, PDA + A , PDA + D), as one of the basic evaluation parameters. Further the germination tests were evaluated according to GI (Germination Index), determination of radial growth (comparison of median cultures) and interaction of strain suspensions on nutrient media PDA. In the in vivo biotests were watched the epizooties from suspensions of these entomopathogenic fungi on insect larva Tenebrio molitor in competitive test of strains according to FDI (Fungl development index) evaluation scala. Chosen larva covered by fully sporulating mycelium from epizootie were further evaluated in CFU test. The result were dominant strain/s on the larva from applied suspensions.

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