Safety concerns are one of the main causes of drug attrition. In these events, the moment at which the drug toxic effects are discovered changes dramatically the importance of the finding; discarding a valuable candidate at clinical testing stages means wasting years of efforts and huge economicinvestments. Even more dramatic is the discovery of toxic effect at post marketing stages, when the drug could have already produced severe side effects on a number of patients. For these reason there is a pushing need of developing methods able to assess the safety of drug candidates at early stages of development. Among these, in silico methods have many advantages, like not even requiring the availability of the compound, not wasting any quantity of it in case it has been already synthesized, being fast, cheap and make no use of animal testing. Unfortunately, in silico prediction methods of toxicity endpoints do not perform always as expected. The reasons are still under debate, but likely reasons are the complexity of the biological phenomena under study and the large structural diversity of the drug candidates, among others. The aim of this thesis is to improve currently used in silico prediction methods for their application to biological endpoints of interest in drug development, with a special emphasis to toxicological endpoints. Here, we report a novel general methodology called ADAN (Applicability Domain Analysis) for assessing the reliability of drug property predictions obtained by in silico methods. Furthermore, we proposed a unifying strategy for the use of in silico predictive methods in this field, defining rational criteria for the application of a whole spectrum of methods; from structural alerts to global QSAR models, including read across and local models. The usefulness of all the proposed methodologies is tested using a systematic analysis on representative datasets, obtaining good results that confirm their validity. / La manca de seguretat és una de les raons principals per la qual els candidats a fàrmacs són descartats. La fase en què els possibles efectes tòxics són identificats és crítica: descartar un candidat en fase clínica implica la pèrdua d'anys d'esforços i enormes inversions econòmiques. Encara pitjor és identificar efectes tòxics un cop el fàrmac està comercialitzat, quan es poden haver produït greus efectes secundaris en pacients. Per aquestes raons hi ha la necessitat de desenvolupar mètodes capaços d'avaluar la seguretat dels candidats a fàrmacs en les primeres etapes. Entre aquests, els mètodes in silico tenen molts avantatges, com no requerir la disponibilitat del compost, no perdre cap quantitat en cas que ja s'hagi sintetitzat, ser ràpid, econòmic i no fer ús de l'experimentació amb animals. Per desgràcia, els mètodes de predicció in silico aplicats a criteris d'avaluació de toxicitat no produeixen els resultats adequats. Les raons són objecte de debat, però raons probables són la complexitat dels fenòmens biològics en estudi i la gran diversitat estructural els fàrmacs candidats, entre d'altres. L'objectiu d'aquesta tesi és millorar els mètodes de predicció in silico emprats en l’avaluació de criteris d'interès en el desenvolupament de fàrmacs amb especial èmfasi en els de toxicitat. Presentem una nova metodologia general anomenada ADAN (Applicability Domain Analysis) per avaluar la fiabilitat de les prediccions obtingudes amb mètodes in silico. A més, proposem una estratègia unificada de l’ús de mètodes de predicció in silico emprats en aquest camp; com alertes estructurals, read-across, QSAR local i global. La estratègia incorpora criteris racionals per la seva utilització. Els bons resultats obtinguts amb dades representatives confirmen la validesa de les metodologies.

Positron emission tomography (PET) has been well established the last years as a powerfull tool in research and clinical applications. Advances in technology have enabled the use of small animal PET imaging in preclinical applications although the size differences in humans and rodents create many challenges to this imaging modality. In this thesis, the performance evaluation ofsmall animal PET systems through specific standards and Monte Carlo simulation codes are investigated using the microPET R4 system. In the first part, the performance evaluation of the microPET R4 scanner according to the new NEMA NU 4-2008 standards for small animal positron emission tomography is assessed and a comparison against its previous evaluation according to the adapted clinical NEMA NU 2-2001 standards is presented. In the second part, dedicated Monte Caro simulation models (using GATE and PeneloPET) of the performance of the R4 system is compared against experimental data. / La tomografia per emissió de positrons (PET) és una poderosa eina per a la investigació translacional adreçada constantment al repte de les noves tecnologies. Per tant, els aspectes tècnics són cada vegada més rellevants en el disseny i desenvolupament de nous sistemes de PET. El coneixement de les característiques físiques és el punt clau especialment en el cas de les tècniques d'imatge de petits animals. Per a la optimització de les capacitats dels sistemes de PET per animals de laboratori, el seu rendiment ha de ser avaluat mitjançant protocols específics i codis de simulació de MonteCarlo. En aquesta tesi, en la primera part, es presenta l'avaluació del rendiment de l'escàner microPET R4 d'acord amb les normes NEMA NU 4-2008 de la tomografia per emissió de positrons petit animal és compara amb l'avaluació anterior realitzada d'acord amb la clínica adaptada NEMA NU 2-2001. Es van obtenir diferències en els resultats entre NEMA NU 4-2008 i NEMA NU 2-2001 associat a la utilització de diferents fantoms i finestres d'energia. A la segona part, es compara l’ exactitud de diferents codis de simulació Monte Carlo (utilitzant GATE i PeneloPET) per avaluar el rendiment del sistema de R4 en relació a les dades experimentals. Tots dos codis van proporcionar resultats exactes si bé PeneloPET va demostrar ser més ràpid que GATE

Los contaminantes ambientales difenil éteres polibromados (PBDEs) se encuentran en altas concentraciones en mujeres. El propósito de la presente tesis es el estudio de la toxicidad ocasionada por el traspaso materno de BDE-99 sobre la descendencia. Entre los resultados más destacables, se encontró que la exposición materna al BDE-99 induce toxicidad en fetos de rata causando retraso en la formación de los huesos, ligera hipertrofia de corazón e hígado y fomentando el aumento de producción de substancias reactivas de oxigeno (ROS) en el hígado de los fetos debido a una mayor actividad de las enzimas p450 (CYP). Por otra parte, las crías de rata mostraron un retraso en la tarea de aprendizaje espacial y un efecto ansiolítico de forma dosis-dependiente después de la lactancia. También se encontró que los niveles en suero de hormonas tiroideas disminuyeron y mostraron signos de hapatoxicidad. Estos resultados indican que realmente existe un efecto toxico del contaminante BDE-99 sobre la descendencia de rata a concentraciones encontradas en humanos. / The main human concern about the environmental pollutants polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) are the rising concentrations accumulated in women. The aim of the present thesis is the study of the toxicity by maternal transference of BDE-99 in the offspring. Among highlights of the results, we found that exposure to BDE-99 during the gestational period produced a delayed ossification, slight hypertrophy of the heart, and enlargement of the liver in rat fetuses. A transplacental effect of BDE-99, evidenced by the activation of nuclear hormones receptors that induce the upregulation of P450 isoforms, was also found in fetal liver correlated with an increase of reactive oxygen substances. Maternal transference of BDE-99 also produced a delay in the spatial learning task and a significant dose-response anxiolytic effect when rat pups were weaned. It was also found that the serum levels of thyroid hormones decreased and signs of hepatoxicity were observed. These results indicate a clear signal of toxicity in rat offspring by BDE-99 at levels comparable to those found in humans.

3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA, ecstasy) is one of the most abused recreational drugs in the world. It has been extensively reported that this drug inhibits its own metabolism by inhibiting a polymorphic liver enzyme, CYP2D6, which is responsible for the clearance of one quarter of drugs used in therapeutics. This phenomenon has important clinical implications, since MDMA users display a higher prevalence of psychopathology, particularly of mood disorders, compared to control population. Importantly, these psychiatric diseases are treated with drugs most of them substrate of this enzyme. In addition, it is not elucidated how MDMA is still metabolically cleared even after repeated drug doses. Therefore, the first part of this thesis was focused on studying the metabolic autoinhibition by MDMA assessing several liver enzyme activities in men and women. Although MDMA pharmacology is well established, is it still not clear which is the mechanism of action of the drug. MDMA interacts with the serotonergic system at several levels, but nowadays is technically difficult to study the serotonergic function in living human brain. Imaging methods are limited by a number of factors. Thus, it would be advantageous to have a reliable peripheral index of the serotonergic activity in the blood. The second part of this thesis presents the development of several approaches aimed to assess whether the serotonin transporter in platelets can be used as a peripheral biomarker for central serotonergic activity, and determine if it plays any role in drug mechanism of action. / La 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA, èxtasi) és una de les drogues més consumides al món. Aquesta droga inhibeix el seu propi metabolisme, inhibint un enzim polimòrfic del fetge, el CYP2D6, que és el responsable de l’eliminació d’una quarta part dels medicaments. Aquest fet té implicacions clíniques rellevants, ja que els consumidors de MDMA presenten una prevalença de psicopatologia més alta respecte a la població no consumidora, i moltes de la patologies psiquiàtriques es tracten amb fàrmacs substrats d’aquest enzim. A més, encara no s’ha discernit com aquesta droga pot ser eliminada de l’organisme, inclús després d’haver-ne consumit dosis de manera repetida. Així doncs, la primera part d’aquesta tesi es centra en estudiar l’autoinhibició de la MDMA determinant l’activitat de diferents enzims del fetge, en homes i dones. Encara que la farmacologia de la MDMA està descrita a fons, no està del tot clar quin és el seu mecanisme d’acció. La MDMA interactua amb el sistema serotonèrgic de diverses maneres, però avui en dia és molt difícil estudiar tècnicament el sistema serotonèrgic en el cervell humà. Les tècniques d’imatge estan limitades per molts factors, i per tant, seria molt útil tenir un índex perifèric a la sang de l’activitat serotonèrgica al sistema nerviós central. La segona part d’aquest tesi s’enfoca en el desenvolupament de tècniques per determinar a diferents nivells si el transportador de la serotonina a les plaquetes podria ser un bon biomarcador perifèric de la seva activitat al cervell, i d’aquesta manera veure si el sistema serotonèrgic està implicat en el mecanisme d’acció de la MDMA.

This doctoral thesis describes the evaluation of analytical methodologies to detect human growth hormone (hGH) abuse in sport. Two main strategies are studied and compared. The first (direct method) measures changes in the proportions of hGH variants, expressed as ratios, which are altered after hGH administration. Two versions of the direct method are compared; one using ratios between recombinant and pituitary variants and a second using ratios between only 22 and 20 kDa hGH variants. To fully understand the immunoassays readings, all relevant antibodies were characterised by surface plasmon resonance (SPR). A second strategy (indirect method) measures changes in proteins, other than hGH, provoked by the use of hGH. These bio-markers should have a longer retrospective analytical power. To evaluate the performance of both strategies, two clinical trials with recombinant hGH (rhGH) were carried out with healthy male subjects. The resulting data have been compared and statistically assessed. It is the first time that all available strategies have been applied on a single data set and this allows better understanding of the analytical readings which provides an additional tool in the evaluation of anti-doping analyses. / Esta tesis doctoral describe la evaluación de métodos analíticos para detectar el abuso de hormona de crecimiento humana (hGH) en el deporte. Se han estudiado y comparado dos estrategias. La primera o método directo mide cambios en la proporción de variantes de hGH expresados como ratios, que están alterados después de administrar hGH. Dos versiones del método directo son comparadas; una con ratios entre variantes recombinante e hipofisaria y otra con ratios entre variantes de 22 y de 20 kDa. Para una mejor comprensión, los anticuerpos relevantes utilizados en los inmunoensayos, se caracterizaron por medio de resonancia del plasmon de superficie (SPR). Una segunda estrategia o método indirecto mide cambios en bio-marcadores (proteínas) causados por uso de hGH recombinante (rhGH). Estos bio-marcadores presentan un poder analítico más fuerte y de mejor retrospección en el tiempo. Para evaluar el rendimiento de ambas estrategias se han realizado dos ensayos clínicos con rhGH en varones sanos. Los datos resultantes se han comparado y evaluado estadísticamente. Es la primera vez que ambas estrategias se han aplicado sobre una misma serie de datos y ello permite una mayor comprensión de lecturas analíticas lo que proporciona herramientas adicionales en la evaluación de los análisis anti-dopaje.

La present tesis doctoral desenvolupa una nova metodologia analítica antidopatge. Degut a que actualment la detecció de l'abús d'hormona del creixement recombinant està relativament resolt, es tem que els secretagogs de la hormona del creixement (GHS) siguin el relleu natural ja que es creu provoquen efectes anabòlics semblants. L'objectiu de la tesi és la detecció de secretagogs de l'hormona del creixement (GHS) a partir de mostres d’orina. Els GHS presenten gran diversitat estructural que fa difícil una única determinació química convencional. Per això s'ha optat per utilitzar la seva propietat comú d'interaccionar amb el receptor específic GHS-R1a, mitjançant un mètode basat en un assaig competitiu front un lligand marcat. Monitorant la senyal del lligand marcat al final de l’assaig es pot determinar la presència de qualsevol GHS a la mostra. S'ha determinat per l’assaig un valor de tall de la senyal del lligand marcat per sota de la qual una mostra és considerada sospitosa amb una baixa probabilitat d'obtenir un fals positiu. El mètode desenvolupat ha funcionat amb els 8 GHS estudiats, incloses mostres reals procedents d'un assaig d’administració d’un d’ells. Variables com l'edat, gènere o exercici físic no provoquen interferències en el mètode, que actualment es troba en fase de validació. / The presented doctoral thesis describes de development of a new analytical method in anti-doping. At present, the detection of recombinant growth hormone abuse is relatively settled, and therefore it is anticipated that growth hormone secretagogues (GHS) will replace GH, as they can induce similar anabolic effects. The aim of this thesis is the detection of growth hormone secretagogues (GHS) from urine samples. GHS presents high structural diversity rendering very difficult a single conventional chemical determination for all. Thus, in this approach the single feature shared by all GHS, interaction with the specific receptor GHS-R1a, is targeted using a method based on a competitive assay against a labelled ligand. By monitoring the signal of the labelled ligand at the end of the test, the presence of any GHS in the sample can be determined. A threshold value below which a sample is considered suspicious with low probability of being false positive was set up. The developed methodology was tested with 8 different GHS, and also samples from an administration assay of one of the GHS. Variables such as age, gender or physical exercise do not interfere with the method, which is currently under validation.

Aquesta tesi presenta els estudis realitzat per avaluar el paper de diferents neurotransmisors i neuromoduladors en respostes de tipus emocional, en el control dels efectes reforçants i gratificants de diverses drogues d'abús així com en la modulació de diferents respostes antinociceptives. En concret, vam avaluar el paper del sistema endocannabinoid, opioid i PACAP en aquestes respostes mitjançant l'ús de diferents soques de ratolins modificatsgenèticament (ratolins knockout). Vàrem estudiar el paper del receptor cannabinoid CB1 en respostes de tipus emocional (ansietat i depressió), així com en els efectes reforçants dels opioids i cocaïna, mitjançant l'ús del ratolí CB1 knockout. Per una altra banda, vam investigar el sistema PACAP en la plasticitat sináptica, en el control de respostes emocionals (ansietat) i sobre els efectes farmacològics dels opioids mitjançant l'ús del ratolí PACAP R-type I knockout. Finalment, el paper dels receptors opioids mu, delta i kappa en el control de diferents tipus de respostes antinociceptives va ser avaluat mitjançat l'ús de ratolins knockout per un, dos o tots tres receptors opioids. / The aim of this thesis was to evaluate the involvement of different neuromodulator and neurotransmitter systems in mediating emotional responses, in the control of the rewarding and reinforcing effects of different drugs of abuse as well as in the modulation of several antinociceptive responses. Specifically we studied the role of the endocannabinoid, opioid and PACAP systems in controlling those responses. For this porpoise, different genetically modified mice lines (knockout mice) were used.We evaluated the role of the CB1 cannabinoid receptor in emotional responses anxiety and depression), as well as in mediating the rewarding and reinforcing effects of opioids and psychostimulants by using the CB1 knockout mice.On the other hand, we investigated the involvement of the PACAP system in synaptic plasticity, in controlling emotional behaviour, and in the modulation of some pharmacological effects produced by opioids by using the PACAP R-type I knockout mice. Finally, the specific role of mu, delta and kappa opioid receptor in analgesia was evaluated by using single, double and triple knockout mice for those receptors.

The detection of endogenous anabolic androgenic steroids (EAAS) is one of the most difficult analytical challenges in the doping control field. The main problem for their detection is to distinguish between normally endogenous concentrations and those observed after the exogenous administration of an EAAS. The screening methods for EAAS are currently based on the determination of the steroid profile and the application of the athlete biological passport. The inclusion of new steroid metabolites can improve the screening capabilities of the steroid profile. Thus, the objective of the thesis is to elucidate and characterize new testosterone metabolites that can be implemented to the current steroid profile and to evaluate their usefulness for doping control analysis. Four unreported testosterone metabolites were detected and characterized by using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry approaches. These compounds were demonstrated to come from degradation of cysteine conjugates. The formation of these conjugates implies an addition of a double bond as a phase I metabolism followed by conjugation with glutathione and the subsequent transformation to cysteine conjugates in urine. In order to determinate the usefulness of the cysteinyl compounds for doping control purposes, a quantitative method for the indirect determination of these compounds was developed and validated. Using this method, reference population limits were established by the analysis of 174 urine samples. Additionally, different factors that can potentially influence the excretion of these compounds were evaluated. Finally, the usefulness of these cysteinyl metabolites for the detection of EAAS misuse was evaluated by the analysis of samples collected after different EAAS administration. The use of these metabolites seems to improve in some cases the detection capabilities of the current marker used in routine analysis. / La detecció d’esteroides androgènics anabolitzants endògens (EAAE) és un dels reptes analítics més difícils en la lluita contra el dopatge. El problema més important per a la seva detecció és distingir entre concentracions endògenes i aquelles que s’observen després de l’administració exògena d’un EAAE. Els mètodes de cribatge per a la detecció d’EAAE estan basats en la determinació del perfil esteroïdal i la introducció d’aquest en el passaport biològic de l’atleta. La inclusió de nous metabòlits d’esteroides pot ajudar a millorar les capacitats de cribatge del perfil esteroïdal. Per tant, l’objectiu d’aquesta tesis és detectar i caracteritzar nous metabòlits d’EAAE que puguin implementar-se en l’actual perfil esteroïdal i l’avaluació de la seva utilitat en la lluita contra el dopatge. Quatre metabòlits desconeguts de la testosterona van ser detectats i caracteritzats mitjançant la utilització de la cromatografia líquida acoblada a l’espectrometria de masses en tàndem. L’origen d’aquests compostos es va demostrar que provenia de la degradació de conjugats amb cisteïna. La formació d’aquests conjugats implica l’addició d’un doble enllaç com a reacció metabòlica de fase I acompanyat per la conjugació amb glutationa i la subseqüent degradació d’aquesta a cisteïna en orina. Per tal de poder veure la seva aplicació en el camp del dopatge, es va desenvolupar i validar un mètode per la quantificació indirecta d’aquests compostos en orina. Utilitzant aquest mètode es van establir límits de referència basats en l’anàlisi de 174 mostres de orina. Addicionalment, diferents factors descrits que poden afectar l’excreció en orina d’aquests compostos també van ser estudiats en detall. Finalment, es va avaluar la utilitat d’aquests metabòlits conjugats amb cisteïna per a la detecció de l’abús d’EAAE mitjançant l’ anàlisis de mostres després de l’administració de diferents EAAE. L’ús d’aquests metabòlits va millorar (en alguns casos) els temps de detecció comparant-los amb els actuals marcadors utilitzats en rutina.

La caracterització de diversos fàrmacs capaços d’unir-se a receptors associats a proteïnes G (GPCR)s ha revelat que els seus mecanismes d’acció no eren tan simples com es creia. Primer, l’anàlisi de la seva afinitat d’unió per una sèrie de receptors va revelar que podien unir-se a múltiples dianes. Més tard, l’estudi de la seva eficàcia envers diferents vies de senyalització va revelar que alguns fàrmacs podien promoure selectivitat funcional. En aquesta tesi, s’han construït models a partir de noves dades estructurals i farmacològiques de diversos receptors per determinar les bases de l’afinitat de diferents compostos per múltiples GPCRs i estudiar la seva selectivitat funcional. La informació obtinguda pot permetre obtenir noves eines moleculars que ajudin a analitzar la rellevància de diversos modes d’activació en el tractament de malalties complexes com l’esquizofrènia. Aquesta informació també pot contribuir al disseny racional de nous fàrmacs capaços d’explotar diferents perfils de selectivitat i de discriminar entre efectes terapèutics i secundaris. / Deeper characterization of drugs targeting G protein-coupled receptors (GPCR)s has shown that their mechanisms of action can be more complex than previously thought. On the one hand, binding affinity analyses towards a panel of related receptors have revealed that most drugs have affinity for multiple targets. On the other, characterization of drug efficacy for different receptor pathways has made evident that some ligands can selectively activate particular pathways, thus acting as biased agonists. In this work, we used models derived from new experimental data on receptor 3D structure and pharmacology to rationalize the structural determinants of multi-target affinity and biased agonism for different GPCR ligands. This insight can help obtain new molecular probes to assess the importance of specific affinity and efficacy profiles for the treatment of complex diseases such as schizophrenia. Furthermore, it can set the basis for the rational design of new ligands exploiting different forms of selectivity and capable of separating therapeutic effects from side effects.

Metabolic studies of doping agents have been traditionally performed by using gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). In the last years, liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS) has demonstrated to offer new possibilities to perform metabolic studies. The objective of this thesis was to study the metabolism (phase I and phase II) of different doping agents by LC-MS/MS in order to improve the detection capabilities of the studied substances. For mesocarb, a thermolabile compound, the parent drug 19 metabolites were detected in urine including mono-, di- and tri-hydroxylated metabolites excreted free or conjugated with glucuronic acid and sulphate. For toremifene, an anti-estrogenic drug with poor electron ionization properties, the parent drug and 20 metabolites were detected in urine. The structure of most of the metabolites was proposed. Anabolic androgenic steroids (AAS) metabolites conjugated with sulphate were investigated to improve the retrospectivity of the detection of these compounds. A study of hydrolysis and MS/MS behaviour of sulphate metabolites of AAS was performed, and sulphate conjugated metabolites of boldenone, methyltestosterone and metandienone were studied. Boldenone sulphate and epiboldenone sulphate were identified as boldenone metabolites in humans. They can be used as markers of exogenous boldenone administration. For methyltestosterone, three new sulphate metabolites were detected and structures were proposed. One of them, 17β-methyl-5α-androstan-3α,17α-diol 3α-sulphate was detected in urine up to 21 days after methyltestosterone administration, improving three times the retrospectivity of the detection with respect to other previously reported long-term metabolites. Several new sulphate metabolites were detected after metandienone administration. One of them was characterized as 18-nor-17β-hydroxymethyl-17α-methylandrost-1,4,13-triene-3-one conjugated with sulphate, and it was detected up to 26 days after administration, improving the retrospectivity of the detection with respect to other long-term metabolites described. The usefulness of LC-MS/MS for the detection and characterization of metabolites of doping agents has been demonstrated, especially for the study of new phase II metabolites and for metabolic studies of compounds where GC-MS shows relevant limitations. / Els estudis metabòlics de substàncies dopants han estat tradicionalment realitzats mitjançant l’ús de cromatografia de gasos acoblada a espectrometria de masses (GC-MS). En els últims anys, s’ha demostrat la utilitat de la cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses (LC-MS) per realitzar estudis de metabolisme. L’objectiu d’aquesta tesi va ser estudiar el metabolisme (fase I i fase II) de diferents substàncies dopants mitjançant LC-MS/MS per tal de millorar la capacitat de detecció dels compostos estudiats. Per a mesocarb, compost termolàbil, es van detectar en orina el compost inalterat i 19 metabòlits incloent metabòlits mono-, di- i tri-hidroxilats excretats lliures o conjugats amb àcid glucurònic i sulfat. Per a toremifè, un fàrmac anti-estrogènic amb espectre de masses d’impacte electrònic amb pocs ions diganòstic, es van detectar el compost inalterat i 20 metabòlits en orina. Es va proposar l’estructura de la major part de metabòlits detectats. Per tal de millorar la retrospectivitat de la detecció dels esteroides anabolitzants androgènics (AAS) es van estudiar els metabòlits conjugats amb sulfat. Es va realitzar un estudi de la hidròlisi i del comportament espectromètric dels metabòlits conjugats amb sulfat dels AAS. Es van estudiar els metabòlits conjugats amb sulfat de boldenona, metiltestosterona i metandienona. Es van identificar boldenona sulfat i epiboldenona sulfat com a metabòlits de boldenona en humans. Aquests metabòlits poden ser usats com a marcadors de l’administració exògena de boldenona. Per a metiltestosterona, es van detectar i proposar les estructures de tres nous metabòlits conjugats amb sulfat. Un d’ells, el 17β-metil-5α-androstà-3α,17α-diol 3α-sulfat, va ser detectat en orina fins a 21 dies després de l’administració de metiltestosterona. Es van detectar diversos metabòlits de metandienona conjugats amb sulfat no descrits prèviament. Un d’ells, identificat com a 18-nor-17β-hidroximetil-17α-metilandrost-1,4,13-trien-3-ona conjugat amb sulfat, va ser detectat fins 26 dies després de l’administració. Tant per a metiltestosterone com per a metandienone, els metabòlits conjugats amb sulfat permeten millorar la retrospectivitat de la detecció respecte a altres marcadors descrits anteriorment. S’ha demostrat la utilitat del LC-MS/MS per a la detecció i caracterització de metabòlits de substàncies dopants, especialment per a l’estudi de nous metabòlits de fase II i per a estudis de metabolisme de compostos que mostren limitacions en GC-MS.