Utilizando el cicloheptapéptido stylostatin 1 (cNSLAIPF) como nuestro modelo [1], diseñamos y preparamos una biblioteca de ciclopéptidos con un uso potencial como antibióticos que atacasen directamente la membrana celular procariota siguiendo un mecanismo similar al propuesto por Ganz [2]. Para ello se sintetizaron péptidos con aminoácidos naturales y otros que incluyesen nuestras lactamas de síntesis de conformación restringida, introduciendo cambios en la hidrofobicidad/amfipaticidad, el número de cargas positivas o el tamaño del péptido. En primer lugar se realizó la síntesis de nuestras 3-aminolactamas de conformación restringida. A continuación se abordó la síntesis en fase sólida de nuestra biblioteca de Ψ-stylostatinas siguiendo una metodología de tipo Fmoc/tBu y utilizando para ello una resina de tipo cloruro de 2-clorotritilo. De los 36 péptidos planificados se sintetizaron 11 que incluyen nuestras lactamas y otros 19 formados por aminoácidos naturales, con rendimientos moderados (10-30 %) y purezas superiores al 90 %. Varios de los péptidos que incluyen nuestros “scaffolds” lactámicos se degradaron al intentar desbencilarlos en su posición C-5. Una vez obtenidos los péptidos de nuestra biblioteca se realizaron estudios de dicroísmo circular con los que se observó la posible agregación de varios de nuestros compuestos. Los cálculos de modelización molecular mostraron que diferentes Ψ-stylostatinas presentaban diferentes grados de flexibilidad. En último lugar se realizó la evaluación de nuestras Ψ-stylostatinas como antibióticos y antitumorales. En ninguno de los dos casos se encontró actividad. [1] Forns, P.; Piró, J.; Rubiralta, M.; Cuevas, C.; Diez, A.; J. Med. Chem., 2003, 46, 5825-5833. [2] Ganz, T. Nature, 2001, 412, 392-393. / Using cycloheptapeptide stylostatin 1 (cNSLAIPF) as a model [1], in this PhD a library of Ψ-stylostatins has been prepared. These Ψ-stylostatins have the potential to act as antibiotics directly on the prokaryote cell membrane and thus circumvent mechanisms of bacterial resistance [2]. For this purpose some peptides were synthesized with natural amino acids only, while others were synthesized including our 3-aminolactams as dipeptide constrained surrogates. In both cases we introduced changes in the hydrophobicity/amphipathicity, in the number of positive charges, or in the size of the peptide. First we prepared our chosen 3-aminolactams as dipeptide constrained surrogates. The library of Ψ-stylostatins were prepared by Fmoc/tBu chemistry and using a chlorotrityl resin. We synthesized 11 lactam peptides, and 19 peptides with only natural amino acids, out of the 36 we originally planned. We reached moderate chemical yields (10%-30%) and purities higher than 90%. Molecular modeling calculations show that the different Ψ-stylostatins have different degrees of flexibility. In circular dichroism experiments we observed evidences of self-association in some of our peptides. Finally we evaluated our Ψ-stylostatins as antibiotics and anti-tumor agents. In neither cases activity was found. [1] Forns, P.; Piró, J.; Rubiralta, M.; Cuevas, C.; Diez, A.; J. Med. Chem., 2003, 46, 5825-5833. [2] Ganz, T. Nature, 2001, 412, 392-393.

Los alcaloides oxindólicos de origen monoterpénico se caracterizan por poseer un núcleo 2- oxindólico con fusión espiránica 3,3' con un anillo de pirrolidina que, a su vez, forma parte de un sistema policíclico. Estos alcaloides se han aislado de plantas de las familias Apocynaceae y Rubiaceae, algunas de cuyas especies poseen gran relevancia en la medicina tradicional china. La actividad biológica de algunos miembros pertenecientes a este grupo de los alcaloides oxindólicos es de interés para el desarrollo de nuevos fármacos, por lo que en los últimos años se han incrementado el número de trabajos destinados a explorar sus posibles usos en farmacología clínica. Como una extensión de los trabajos realizados previamente en el grupo de investigación en el campo de la síntesis de productos naturales en forma enantiopura a partir de lactamas quirales derivadas del S)-triptofanol, en la presente Tesis Doctoral se decidió estudiar procedimientos generales para la preparación enantioselectiva de espiro[indolina-1,3'- indolizidinas] y de los correspondientes espirooxindoles. En este contexto, el tratamiento en medio acido, en presencia de hidruro de trietilsilano, de lactamas con estructura de oxazolopiperidona derivadas del N-(arilsulfonil)triptofanol condujo a compuestos espiroindolínicos con excelentes rendimientos y total estereoselectividad, en un proceso que implica la apertura del anillo oxazolidínico, la ciclación de la sal de aciliminio resultante sobre la posición 3 del indol y, finalmente, la reducción in situ de la sal de indoleninio formada. De forma alternativa, las reacciones de espirociclación a partir 2-bromoindoles derivados de lactamas bicíclicas derivadas del N-H triptofanol permitieron la obtención directa de espirooxindoles con buenos rendimientos y elevada estereoselectividad, en un proceso que implica la apertura del anillo oxazolidínico, la ciclación de la sal de aciliminio resultante sobre la posición 3 del indol y, finalmente, la hidrólisis de la agrupación 2-bromoindoleninio formada. Cabe comentar que cuando la lactama inicial se halla sustituida en la posición 8, las anteriores ciclaciones permitieron la obtención de forma satisfactoria de compuestos espiroindolínicos y espirooxindólicos que presentan tres estereocentros contiguos, mientras a partir de una lactama que presenta un metilo en la posición C-8a, se obtuvo un solo isómero del correspondiente espirooxindol con dos centros cuaternarios en posición contigua. La utilidad sintética de las espiroindolinas preparadas se ha puesto de manifiesto con la síntesis enantioselectiva de los alcaloides oxindólicos ent-rincofilina y ent-isorincofilina. En este contexto, en la presente Tesis Doctoral se ha desarrollado una metodología que permite una generación eficiente del sistema oxindólico por oxidación de una indolina con yodosobenzeno, mientras que una reducción quimioselectiva con AlH /NaBH CN permite la 3 3 reducción del carbonilo de la lactama piperidínica sin afectar la función ester ni el carbonilo de amida presente en el oxindol. Por otro lado, a partir del espirooxindol 50a hemos accedido de forma satisfactoria a la lactama insaturada activada 118, que hemos considerado un intermedio clave en la síntesis enantioselectiva de los alcaloides oxindólicos ent-isomitrafilina y ent-isoformosanina.

L’objectiu del present treball ha consistit en l’obtenció i caracterització d’hidrogels i materials porosos d’àcid hialurònic (HA) entrecreuat amb butanediol diglicidil èter (BDDE) per a ser utilitzats com a sistemes d’alliberament controlat de fàrmacs. La selecció de l’HA per a l’obtenció dels materials ha sigut motivada per les propietats fisicoquímiques, la biocompatibilitat i la biodegradibilitat. S’han obtingut hidrogels amb l’entrecreuament en solució de l’HA amb el BDDE, i materials porosos amb una estructura ordenada mitjançant l’entrecreuament de l’HA amb el BDDE en medis compartimentalitzats. Per a l’obtenció dels materials porosos d’HA s’han utilitzat emulsions altament concentrades (HIPEs). S’han preparat hidrogels d’HA amb diferents graus d’entrecreuament. La caracterització d’aquests ha permès conèixer la seva capacitat d’inflament, les seves propietats reològiques, i la seva resistència davant l’enzim hialuronidasa en funció del seu grau d’entrecreuament. S’han estudiat les propietats d’alliberament dels hidrogels d’HA mitjançant la incorporació d’un fàrmac lipòfil model, el ketoprofè (KP, que és un fàrmac antiinflamatori no esteroïdal). Els resultats obtinguts han permès observar i quantificar la influència del grau d’inflament i del grau d’entrecreuament dels hidrogels en l’alliberament del KP. També s’han preparat associacions iòniques amb el KP per tal d’augmentar la solubilitat d’aquest en aigua i afavorir la incorporació a formulacions hidròfiles. S’han preparat líquids iònics mitjançant l’associació del KP amb l’1- butil-3-metilimidazoli, [Bmim][KP], i tensioactius cataniònics mitjançant la seva associació amb tensioactius biocompatibles derivats de sucres, el N-Dodecilamino-1-deoxiglucitol (GHyd ) i el 12 N-Dodecilamino-1-deoxilactitol (LHyd ). Els resultats de l’alliberament obtinguts amb el 12 [Bmim][KP] han mostrat com, malgrat l’augment de solubilitat en aigua, les propietats d’alliberament del KP no es veuen modificades. En canvi, els estudis d’alliberament realitzats amb el tensioactiu cataniònic LHyd /KP han demostrat com l’associació del KP amb el LHyd 12 12 augmenta l’alliberament del KP. Aquest augment es pot atribuir al fort increment en la solubilitat del KP quan aquest forma el tensioactiu cataniònic. A més, els estudis fisicoquímics realitzats amb el tensioactiu cataniònic LHyd /KP han demostrat la formació de vesícules per a 12 concentracions superiors a 1.1mM en aigua. Els estudis d’alliberament realitzats amb les vesícules de LHyd /KP mostren un retard en l’alliberament associat a la grandària de les 12 vesícules que en dificulten la seva difusió. S’han obtingut escumes sòlides d’HA mitjançant la incorporació d’HA i el seu entrecreuament amb el BDDE a la fase contínua de HIPEs obtingudes per un mètode d’alta energia a 25°C amb el sistema aigua/ Cremophor CH 455 / Miglyol 812. Les escumes sòlides obtingudes són 2 principalment macroporoses (pors > 300 nm) amb una superfície específica entre 23-43 m /g. S’han preparat també, partícules d’HA mitjançant la incorporació d’HA i l’entrecreuament amb el BDDE a la fase dispersa de HIPEs obtingudes per un mètode d’alta energia a 25°C amb el sistema aigua/ Cremophor WO 7/ parafina líquida. S’ha observat la coincidència entre la mida de les partícules obtingudes i les gotes de les HIPEs de partida. Finalment, s’han seleccionat les escumes sòlides d’HA per a estudiar l’alliberament del KP i tensioactiu cataniònic LHyd /KP. Aquests estudis han mostrat un alliberament molt més sostingut del KP i del 12 LHyd /KP respecte al perfil farmacocinètic obtingut amb els hidrogels. Aquest fenomen pot ser 12 degut a la presència de pors molt petits a les escumes sòlides que en dificultarien la seva difusió. A més, per a temps superiors a les tres hores s’ha observat una cinètica d’ordre zero. En conclusió, els resultats obtinguts tant en la caracterització com en les propietats d’alliberament dels hidrogels i de les escumes sòlides d’HA mostren que aquests nous materials són adequats per a l’alliberament controlat de fàrmacs i el seu us en implants. / The objectives of the present work were the obtention and characterization of materials based on hyaluronic acid (HA) crosslinked with butanediol diglycidyl ether (BDDE) to be applied as controlled drug delivery systems. The selection of HA to obtain these materials was motivated by their physicochemical properties, biocompatibility and biodegradability. Hydrogels were obtained by crosslinking HA with BDDE in bulk, and porous materials by crosslinking HA with BDDE into compartmentalized media. To obtain the porous materials, highly concentrated emulsions (HIPEs) were used as templates. HA hydrogels with different crosslinking degree were prepared. Their characterization show that swelling capacity, rheological properties and resistance against hyaluronidase depend on crosslinking degree. The release properties of HA hydrogels using a lipophilic model drug, ketoprofen (KP), were studied. The results show the influence of the swelling and the crosslinking degree in the release of KP. To increase the solubility of KP, an ionic liquid, [Bmim][KP], and catanionic surfactants, GHyd12/KP and LHyd12/KP, were prepared. The release of [Bmim][KP] shows no differences regarding to that obtained with KP. However, the studies performed with LHyd12/KP, show an increased release when the catanionic surfactant is in the monomeric form, and a sustained release when vesicles are formed. HA solid foams obtained by crosslinking HA with BDDE in the continuous phase of HIPEs show macroporosity (porous > 300 nm) and a specific surface area between 23- 2 43 m /g. Particles based on HA were obtained by crosslinking HA with BDDE in the dispersed phase of HIPEs. The sizes of the obtained particles are similar to emulsion droplets. The release studies with KP and LHyd12/KP using HA solid foams show a more sustained release regarding to the pharmacokinetic profile obtained with hydrogels. This phenomenon may be due to the presence of small pores in the solid foams that difficult its diffusion. In addition, for periods exceeding three hours, zero- order kinetics were obtained using these materials. In conclusion, the results obtained in the characterization and the release properties of hydrogels and solid foams based on HA show that these new materials are suitable to be used for controlled drug delivery as implants.

Introducció: El rendiment diagnòstic dels leucòcits marcats amb 99m Tc recau, en bona part, en la qualitat del procediment de marcatge i d’obtenció de les imatges. Els controls habitualment establerts no justifiquen, per si sols, la variabilitat dels resultats obtinguts. Objectiu: Verificar a la pràctica diària, els components de la dosi, el seu marcatge i el seu funcionalisme dins del pacient amb nous controls mitjançant metodologies a l’abast del centre, amb mínima pèrdua de la dosi i sense contravenir les normatives en radioprotecció establertes ni perllongar l’estada del pacient. Metodologia Estudi prospectiu, observacional en 320 pacients (159 dones; edat 63,2 ± 23,1 anys) amb malalties inflamatòries i infeccioses diagnosticats mitjançant els seus leucòcits marcats 99m Tc-HMPAO i que han configurat tres grups amb controls diferents. El primer grup (n=87) per a la determinació de l’hemograma i viabilitat cel·lular amb una nova aplicació de la citometria de flux. El grup II (n=101) per verificar la distribució del 99m Tc entre els components de dosi per separació per gradients i al grup III (n=132) localització de la dosi als ossos, vasos i parts toves per determinar el funcionalisme de la dosi administrada. Els resultats s’han agrupat segons el resultat de la gammagrafia i per seguiment clínic de 2 anys. Resultats No han existit diferències significatives per a la majoria de les variables estudiades. En el Grup I es va evidenciar significació en el rendiment del marcatge (p=0,018), cèl·lules totals (p=0,048) i plaquetes (p=0,035) entre les variables estudiades agrupades segons la taxa de resultats verdaders/falsos. Significatius, també en el tercer grup en la captació dels ossos respecte a les parts toves (p<0,001) quan les variables es van agrupar per estudi positiu o negatiu. El mètode va ser poc fiable per diferenciar els neutròfils de les hematies marcades. L’efectivitat clínica global va ser del 86,2%, amb un índex Kappa de 76%, 66,7% i 73 % per a cada grup. Conclusions Els controls establerts van permetre verificar la qualitat del procediment establert per a la majoria de les variables i van permetre identificar les causes de desviament metodològic en l’òptima obtenció dels leucòcits. Es va poder objectivar, la biodistribució “in vivo” de les cèl·lules marcades com indicador de qualitat, tot i que el mètode no va aconseguir controlar de forma precisa la contaminació de les hematies marcades en la dosi administrada. / Introduction: The controversy of the clinical utility of the 99mTc-labeled leucocytes lies in the quality of the procedure performed, given that the usually established controls do not justify all the variables involved by themselves. Objective: Checking in daily practice the components of dose, the 99mTc labeling and its functionalism in the patient with new controls using methodologies to the scope of the centre. All of this with minimal loss of dose, without contravening the regulations on radioprotection and without extending the patient length of stay. Methodology Prospective observational study in 320 patients (159 women; age 63,2 +- 23,1 years) with infectious and inflammatory diseases diagnosed using 99mTc- HMPAO-leukocytes in three different control groups. The first group (n=87) for the determination of the complete blood count and cell viability with a new application of flow cytometry. The group II (n=101) to verify the 99mTc distribution between dose components separated by gradients. And the group III (n=132) for localization of bones dose, vessels and soft tissue in order of determinate the functionalism of the administered dose. The studied variables have been grouped in accordance with the scan result and a clinical follow-up for 2 years. Results: No significant differences were found for most of the studied variables. The first group showed significance in efficiency of the labeling (p = 0,018), in total cells (p = 0,048) and in platelets (p = 0,035) grouping them by clinical criterion. The verification of the labeled erythrocytes was not exact. In the third group it was observed significance on bone capture in relation to soft tissue (p < 0,001) when the variables were grouped by diagnosis. The overall clinical effectiveness was 86,2% with a 76%, 67% and 73% of kappa index for each group, respectively. Conclusions    The established controls allow us to verify the quality of procedure for the majority of variables and identify the causes of the methodological deviation in the optimal obtaining of leukocytes. The method shows a limitation to verify the labeled erythrocytes. The bone capture is a good indicator for the functionalism of the administered leukocytes.

El liofilizado oral es una forma farmacéutica sólida que tiene como objetivo facilitar la administración de un medicamento mediante la disolución instantánea del mismo en la cavidad bucal, con la consiguiente deglución del contenido por vía oral. Dicha forma farmacéutica se obtiene mediante preparación previa de una solución, suspensión o emulsión que contenga el principio activo que se quiere administrar antes de la aplicación de la técnica de liofilización. La liofilización permite generar un producto de tamaño reducido y poroso que se disuelve en segundos cuando se pone en contacto con el agua o con la saliva. En la formulación de un liofilizado oral se utilizan excipientes que auxilian, tanto en la formación de la matriz liofilizada, como en facilitar la correcta disolución del medicamento en la cavidad bucal, añadiéndose componentes que enmascaren el sabor amargo del fármaco y dejen un sabor agradable en la boca. Para efectuar este proyecto se ha escogido como principio activo modelo un antihistamínico de segunda generación no sedante administrado generalmente en comprimidos recubiertos y soluciones orales que promueven el alivio de síntomas relacionados con la rinitis alérgica y la urticaria crónica idiopática. Para el desarrollo de la formulación, se ha puesto a punto previamente un método analítico para el principio activo, seguido de estudios de caracterización del principio activo (Resonancia Magnética Nuclear, Difracción de Rayos X, Espectrofotometría UV-Vis, SeDeM), y estudios de preformulación (con técnicas de Calorimetría Diferencial de Barrido y Microscopía de Liofilización) y formulación, con la consiguiente elaboración de la guía de fabricación y controles de proceso. / Oral lyophilisates are solid oral dosage forms intended to facilitate the administration of a drug by instant dissolution in the oral cavity, thereby swallowing the content orally. The dosage form is obtained by previous preparation of a solution, suspension or emulsion containing the active ingredient that is going to be administered, prior to lyophilisation. Lyophilisation allows generating a reduced size product and at the same time porous, that dissolves in seconds when in contact with water or saliva. In formulating an oral lyophilisate it is necessary to use excipients that both help in the formation of the lyophilized matrix (providing the proper dissolution of the drug in the oral cavity), and to mask bitter taste of a drug, leaving a pleasant taste in the mouth of the patient. To carry out this project it has been chosen as model active ingredient a second-generation antihistamine, usually administered in coated tablets and oral solutions that promote relief related to allergic rhinitis and chronic idiopathic urticarial symptoms. For the formulation development, it has developed previously an analytical method for the active ingredient, followed by characterization studies of the active ingredient (Nuclear Magnetic Resonance, X-ray diffraction, UV-Vis spectrophotometry, SeDeM), and preformulation studies (applying techniques of differential scanning calorimetry and microscopy lyophilisation) and formulation, resulting in a manufacturing batch record with in process controls.

L’ictus és una de les principals causes de discapacitat física en adults. Aquest pot induir dèficits motors severs, generant una disminució progressiva de la condició física que augmenta la discapacitat i el risc cardiovascular. Aquesta discapacitat causa limitacions en la capacitat de caminar, en la realització de les activitats bàsiques de la vida diària (ABVD) i en la qualitat de vida (QdV) de les persones afectades. La capacitat de caminar es veu afectada pels canvis en el control neuromotor, la disminució de la condició física càrdio-respiratòria i l’augment de les demandes energètiques de la marxa hemiplègica. Tot plegat, disminueix la reserva fisiològica de condició física causant una limitació de la capacitat de caminar i la funcionalitat en les ABVD. La velocitat de la marxa es relaciona amb la severitat de la discapacitat i s’ha considerat com a mesura per diferenciar la capacitat de caminar per exteriors o per interiors. També pot predir el destí a l’alta i les necessitats d’assistència de terceres persones. La capacitat de caminar és una de les prioritats en la rehabilitació de les persones amb ictus. Hi ha evidència de que els programes de rehabilitació amb exercicis aeròbics milloren la mobilitat i la QdV. Les recomanacions sobre activitat física per població amb risc cardiovascular elevat, gent gran i supervivents d’ictus proposen alternar l’exercici aeròbic amb el treball muscular de força-resistència, conjuntament amb exercicis d’equilibri i flexibilitat. L’objectiu d’aquesta tesi és avaluar l’efectivitat d’un programa de rehabilitació basat en l’exercici aeròbic, activitats orientades a tasques, exercicis d’equilibri i propiocepció i estiraments en la millora de la velocitat de la marxa, la condició física, la funcionalitat en les ABVD i la QdV. El programa s’ha aplicat a 31 persones ingressades a l’Hospital de Terrassa amb diagnòstic d’ictus isquèmic o hemorràgic, una vegada finalitzat el seu programa de rehabilitació convencional. La periodització del programa consistia en 12 setmanes, amb una freqüència de dues sessions setmanals a dies alterns, d’una hora de duració. Paral·lelament, els participants realitzaven un programa de deambulació progressiva al domicili. Els participants es van valorar a l’inici de la intervenció, al finalitzar i als sis mesos d’haver-la finalitzat. Les variables de l’estudi són la velocitat de deambulació, valorada amb el 10 Meter Walking Test (10MWT), la condició física càrdio-respiratòria amb el 6 minute Walking Test (6MWT), la capacitat de deambulació amb la Functional Ambulation Classification (FAC), la funcionalitat en les ABVD amb l’Índex de Barthel i la QdV amb la SIP30-AI i l’EQ-5D-5L. Finalitzen la intervenció 25 participants. No es va produir cap efecte advers. Per l’anàlisi estadístic s’ha utilitzat l’estadística descriptiva i per la comparació de mitjanes s’han utilitzat les proves no paramètriques de Friedman i Q. de Cochran. La mesura de l’efecte s’ha calculat amb la d de Cohen i la V de Cramer. Es van observar millores significatives en totes les variables analitzades al final i al seguiment als sis mesos (*p≤0,0001): 10MWT* 0,83±0,24 vs 1,06±0,23. 6MWT* 305,75±64,40 vs 359,25±91,31. Tots els participants al finalitzar la intervenció assoleixen una deambulació autònoma en tot tipus de terrenys. En quant a l’Índex de Barthel* 40% independents a l’inici vs 64% independents al seguiment als sis mesos. La millora en la QdV fou significativa en les dues escales utilitzades. A l’inici els participants identifiquen limitacions importants que afecten la seva QdV i al finalitzar la intervenció, els canvis en la funció permeten una millora de la QdV significativa en la SIP30-AI*53,36±18,95 vs 31,94±21,93. En l’EQ-5D-5L* passen d’una percepció inicial de problemes lleus-moderats a una percepció final de cap problema-problemes lleus: 12,2±4,4 vs 8,9±3,4. En l’EVA QdV* obtenen un 15% de millora: 63,25±23,52 vs 72,0±18,31. Els resultats obtinguts demostren que, a partir d’un programa de rehabilitació basat en l’exercici aeròbic, millora la velocitat i l’autonomia en la deambulació, la condició física, la funcionalitat en les ABVD i la QdV de les persones afectades per un ictus. / Stroke is a leading cause of disability in adults. This can lead to severe motor deficits generating a progressive decrease of physical fitness which increases disability and cardiovascular risk. This disability causes limitations in the ability to walk, to carry out basic daily living activities (ADLs) and in the quality of life (QOL) of stroke survivors. Ability to walk is impaired due to the neuromotor control changes, decreasing cardiorespiratory fitness and increasing energy needed for hemiparetic gait. All this, diminishes the physiologic reserve of fitness and limits the ability of walking and performing ADLs. Walking speed is related with the severity of the disability and it has been considered as a measure to differentiate between indoor and outdoor ambulating. It also can predict destination after hospital discharge and support needs. Walking ability is one of the main priorities of stroke survivors. There’s evidence that rehabilitation programs that include aerobic exercise improve mobility and QOL. Physical activity is recommended for persons with high cardiovascular risk, the elderly and stroke survivors suggesting alternating aerobic with strengthening exercises and also balance and stretching exercises. The aim of this thesis is to evaluate the effectiveness of a rehabilitation program based on aerobic exercise, task-based training, balance, proprioception and stretching exercises on improving walking speed, ADLs and QOL. The program has been applied to 31 patients admitted at Hospital de Terrassa diagnose of ischemic or hemorrhagic stroke, once they have finished the conventional rehabilitation program. It consisted on a 12 week intervention, two alternate days a week of one hour duration. In parallel, participants had a progressive ambulation program at home. Participants were evaluated before the intervention, post-intervention and six month later. The outcome measures were, walking speed, evaluated with the Ten Meter Walking Test (10MWT), physical fitness with the Six Minute Walking Test (6MWT), walking ability with the Functional Ambulation Classifications (FAC), ADLs with the Barthel Index and QOL with the SIP30-AI and the EQ-5D-5L. 25 participants finished the intervention. There weren’t any adverse events. A statistical analysis was carried out, along with descriptive and repeated statistical measures, using Friedman’s and Cochran’s Q non-parametric tests. Size effectiveness was calculated using Cohen’s D and Cramer’s V. Improvements were significant in all the outcomes from baseline, post-interventions and six month later (*p≤0,0001): 10MWT* 0,83±0,24 vs 1,06±0,23. 6MWT* 305,75±64,40 vs 359,25±91,31. At the end of the intervention, all the participants achieved independent ambulation both indoors and outdoors. Barthel Index 40% independents before interventions vs. 64% independents six month after. QOL improvements were significant in both scales. Before intervention, participants identified important limitations that affected their QOL and after intervention, the changes in their ADLs function allowed them to improve their QOL significantly. In SIP30-AI*53,36±18,95 vs 31,94±21,93. In EQ-5D-5L* they went from an initial perception of mild/moderate problems to a final perception of mild/no problems 12,2±4,4 vs 8,9±3,4. In the Visual Analogic Scale of QOL* they got a 15% of improvement: 63,25±23,52 vs 72,0±18,31. These results demonstrate that a rehabilitation program based on aerobic exercise, improves walking speed, walking independence, physical fitness, ADLs and QOL of stroke survivors.

El asma es una enfermedad crónica de las vías respiratorias cuyo abordaje terapéutico actual no frena su progresión, y en ocasiones no revierte la sintomatología. El análisis de mecanismos endógenos de protección puede resultar en la identificación de nuevas dianas farmacológicas efectivas. Los estudios preclínicos realizados hasta ahora en nuestro laboratorio junto con evidencia clínica y básica de otros grupos, sugirieron la hipótesis de que la activación selectiva del receptor prostanoide EP2 de le la PGE2 inhibe la actividad mastocitaria, y consecuentemente reduce el proceso patológico respiratorio inducido en ratones por exposición a aeroalérgenos, lo cual puede suponer una estrategia terapéutica antiasmática sinérgica a la del bloqueo mastocitario por otros mecanismos. Con el fin de verificarla, se planteó el primer objetivo: evaluar la función selectiva del receptor prostanoide EP2 en la modulación de la actividad mastocitaria, y en la reactividad respiratoria a aeroalérgenos. Se observó en poblaciones mastocitarias fenotípicamente diversas la inhibición de los mastocitos mediante dos agonistas EP2 químicamente distintos. Inhibición que también se demostró in vivo en un modelo de asma en ratón expuesto a aeroalérgenos de ácaros del polvo. El efecto inhibitorio sobre los mastocitos se acompañó de la prevención de la hiperreactividad bronquial, y apuntaba hacia un posible control del proceso inflamatorio broncovascular. La naturaleza protectora del agonismo EP2 se confirmó al administrar antagonistas en modelos in vitro e in vivo. Estos desencadenaron una sobreactividad de los mastocitos que agravó la alteración respiratoria. Todo ello sugiere que el efecto beneficioso de la PGE2 descrito en estudios clínicos experimentales, es consecuencia de la mediación del receptor EP2 mastocitario. El segundo objetivo planteado fue el desarrollo de un ratón transgénico que sobreexpresase el receptor EP2 específicamente en los mastocitos con el fin de disponer de una herramienta experimental para evaluar la relevancia relativa del receptor EP2 en la protección inducida por PGE2. Se logró con éxito insertar el gen de EP2 y sobreexpresarlo, demostrándose en algunos ensayos in vitro que los mastocitos aislados de los ratones transgénicos EP2 respondían con un incremento en el bloqueo. Sin embargo no se pudo confirmar in vivo el efecto beneficioso atribuible a la presencia de un mayor número de receptores EP2, probablemente debido a las fluctuaciones compensatorias en la expresión de otros genes relacionados. El desarrollo de la colonia transgénica de EP2 requiere de una caracterización más exhaustiva para investigar la importancia del EP2 mastocitario en la prevención de la alteración respiratoria. Finalmente, en un tercer objetivo se planteó evaluar comparativamente la efectividad preclínica de la inhibición mastocitaria mediante agonismo EP2 y bloqueo de la IgE con anticuerpos monoclonales, en modelos de alergia in vivo e in vitro. Se demostró en un modelo de anafilaxia cutánea in vivo y en poblaciones mastocitarias in vitro que el agonismo EP2 y la neutralización de la IgE ejercen un bloqueo de los mastocitos cuantitativamente equiparable. Para posteriores estudios de la potencial sinergia o complementariedad terapéutica entre ambos mecanismos en las vías respiratorias de ratones sensibilizados, se desarrolló con éxito un innovador modelo de anafilaxia respiratoria pasiva (PRA) en ratones transgénicos que expresaban el receptor humano de la IgE. Los resultados obtenidos en esta tesis permiten concluir que la activación del eje “PGE2 - EP2 mastocitario – asma” supone un mecanismo endógeno de protección frente a la disfunción de las vías respiratorias inducida por aeroalérgenos. Los nuevos modelos experimentales in vivo desarrollados en este proyecto permitirán caracterizar el mecanismo antiasmático, y confirmar la condición de diana terapéutica del receptor EP2, o de otras moléculas que formen parte de ese eje. / Asthma is a chronic disease of the airways whose therapeutic approach does stop progression, and occasionally does not revert the symptoms. Studying endogenous protective mechanisms may lead to the identification of newly effective pharmacological targets. Preclinical studies carried out in our laboratory together with clinical and basic evidence from other groups, suggested the following hypothesis: selective activation of the EP2 prostanoid receptor of PGE2 inhibits mast cell activity, and consequently reduces the pathological respiratory process induced in mice exposed to aeroallergens, and this may arise as an antiasthmatic therapeutic strategy synergic to mast cell blockade through other mechanisms. In order to check it, the first objective was to assess the selective function of the EP2 prostanoid receptor as a mast cell activity and aeroallergen-induced airways reactivity modulator. Phenotypically distinct mast cell populations were shown to be inhibited by means of chemically different agonists. Such inhibition was also seen in vivo in the asthma murine model induced through exposure to house dust mite aeroallergens. Mast cells inhibition was paralleled by a prevention of the airway hyperreactivity, and possibly a control of the bronchovascular inflammatory process. The protective nature of EP2 agonism was confirmed through the administration of antagonists in in vitro and in vivo models, where mast cells hyperreleasability and worsening of airways disorder were observed. All in all, this suggested that the described benefit of PGE2 in clinical experimental settings is mediated by the mast cells EP2 receptor. The second objective was to develop a transgenic mouse overexpressing the EP2 receptor specifically on the mast cells surface as an experimental tool to evaluate the relative relevance of EP2 in PGE2-driven protection. The EP2 gene was successfully inserted and overexpressed, owing to an increased blockade of the activity of mast cells isolated from transgenic mice. However, the beneficial effect attributable to a higher number of EP2 receptors could not be seen in vivo, possibly due to the compensatory fluctuation of related genes. The developed EP2 transgenic mice require a further characterization in order to investigate the role of mast cell EP2 in prevention of the respiratory dysfunction. Finally, the third objective was to compare the preclinical effectiveness of EP2 agonism versus anti-IgE using monoclonal antibodies, in allergy models in vivo and in vitro. Both, EP2 agonism and IgE neutralization exerted a quantitatively similar effect on mast cells population in vitro and in a model of cutaneous anaphylaxis in vivo. In order to further study the synergy or therapeutic complementarity between both mechanisms, an innovative model of passive respiratory anaphylaxis (PRA) was successfully established in transgenic mice expressing the human IgE receptor. The results of this thesis brought us to conclude that the “PGE2- mast cell EP2-asthma” axis is an endogenous protective mechanism against the airway dysfunction caused by aeroallergens. The new in vivo experimental models developed in this project, will allow to characterize the antiasthmatic mechanism, and confirm the EP2, or other molecules along the axis, as therapeutic targets.

El metotrexato (MTX) es el fármaco de elección en primera línea de tratamiento para pacientes con artritis reumatoide. En las últimas décadas ha habido un gran interés para identificar marcadores biológicos que puedan predecir con exactitud y fiabilidad la eficacia y toxicidad del MTX. Los polimorfismos (SNPs, Single Nucleotide Polymorphism) en los genes que participan de forma directa o indirecta en la vía metabólica del MTX y en su transporte y activación (poliglutamación) celular, pueden ser predictores de respuesta y toxicidad del MTX. El objetivo del trabajo es valorar la utilidad de diferentes marcadores farmacogenéticos en relación a la respuesta y/o toxicidad de pacientes con artritis reumatoide tratados con MTX en monoterapia. El trabajo se ha dividido en dos partes: La primera parte se basa en el estudio de 27 polimorfismos de genes que tienen que ver con el mecanismo de acción del MTX (DHFR, TYMS, MTHFR, ATIC y CCND1) y, la segunda, en el estudio de 34 polimorfismos de genes que participan en el transporte celular del MTX y en su activación e inactivación través de la poliglutamación (SLC19A1 / RFC1, ABCB1, FPGS y GGH). En relación a los genes que participan en el mecanismo de acción del MTX los resultados muestran una asociación entre dos SNPs en el gen MTHFR, rs17421511 y rs1476413, y uno en el gen DHFR, rs1643650, y la respuesta al tratamiento con MTX en pacientes con artritis reumatoide. Asimismo, también se ha encontrado que dos SNPs en el gen ATIC, rs16853826 y rs10197559, se asocian con toxicidad. En relación a los genes que participan en el transporte celular del MTX y en su activación e inactivación a través de la poliglutamación los resultados obtenidos en este trabajo muestran una asociación entre dos SNPs en el gen FPGS, rs10987742 y rs10106, y la respuesta al tratamiento con MTX. El SNP rs10106 también está asociado con la presencia de eventos adversos y el tiempo de supervivencia del fármaco. Los resultados también muestran que tres SNPs en el gen ABCB1, rs868755, rs10280623 y rs1858923, están asociados con la toxicidad al MTX, y que dos de los SNPs del mismo gen, rs10264990 y rs868755, también se asocian con el tiempo de supervivencia del MTX. En conclusión, determinadas variantes genéticas en los genes que participan en la vía metabólica del MTX y en su transporte y activación celular, podrían ser consideradas como marcadores farmacogenéticos de respuesta y toxicidad en pacientes con artritis reumatoide tratados con MTX en monoterapia. / Methotrexate (MTX) is the first-line treatment option for rheumatoid arthritis (RA) patients. Recently, the interest of identifying biomarkers that can predict the efficacy and toxicity of MTX has been grown. Polymorphisms (SNPs, Single Nucleotide Polymorphism) in genes involved directly or indirectly in the metabolic pathway of MTX and in the transport and activation (polyglutamation) of MTX inside the cell can be predictors of response and toxicity of MTX. The objective of this study is to evaluate the usefulness of different pharmacogenetics markers in relation to the response and / or toxicity of rheumatoid arthritis patients treated with MTX in monotherapy. The investigation has been divided into two parts. The first part is based on the study of 27 polymorphisms of 5 genes that are involved with the mechanism of action of MTX (DHFR, TYMS, MTHFR, ATIC and CCND1). The second part is based on the study of 34 polymorphisms of 4 genes involved in the cellular transport of MTX and in its activation and inactivation through polyglutamation (SLC19A1 / RFC1, ABCB1, FPGS and GGH). Regarding genes involved in the mechanism of MTX’ action the results show an association between three SNPs and the response to treatment with MTX in patients with rheumatoid arthritis. The involved SNPs are rs17421511 and rs1476413 of MTHFR gene and the SNP rs1643650 of the DHFR gene. Besides, the two SNPs rs16853826 and rs10197559 of ATIC gene are associated with toxicity. Concerning genes involved in cellular transport of MTX and in their activation/inactivation through polyglutamation the results obtained in this study show an association between two SNPs and the treatment response of MTX. In this case, the involved SNPs are rs10987742 and rs10106 of FPGS gene. The SNP rs10106 is also associated with the presence of adverse events and the survival time of the drug. The results also show that three SNPs rs868755, rs10280623 and rs1858923 of ABCB1 gene are associated with MTX toxicity; and two SNPs rs868755 and rs10264990 of the same gene are also associated with the survival time of MTX. In conclusion, certain genetic variants in genes involved in the metabolic pathway of MTX and in its transportation and cellular activation could be considered as pharmacogenetics markers for response and toxicity in rheumatoid arthritis’ patients treated with MTX in monotherapy.

Los ansiolíticos han sido y continúan siendo uno de los grupos farmacológicos más prescritos en los países desarrollados y concretamente en España, no ha hecho más que aumentar su consumo desde los años 90 agudizándose con la crisis económica. En el presente trabajo, se exponen los resultados obtenidos en un ensayo clínico farmacocinético y farmacodinámico tras la administración de uno de los fármacos ansiolíticos más prescritos, el diazepam. Dieciséis voluntarios jóvenes sanos de ambos sexos fueron incluídos y recibieron 4 condiciones de tratamiento: diazepam 30 mg (DZ) como dosis oral única en dos ocasiones (en dos sesiones experimentales); desmetildiazepam (DMDZ), su metabolito activo, como dosis oral única de 30 mg; y placebo. De forma previa y a diferentes tiempos postmedicación se cuantificaron las concentraciones plasmáticas de DZ y DMDZ. Además, se realizaron las siguientes evaluaciones: registros electroencefalográficos (EEG), test de rendimiento psicomotor (test de cancelacion d2) y evaluaciones subjetivas de sedación [escalas analógicas visuales (VAS) de somnolencia y pasividad] así como evaluaciones de tolerabilidad (registros de constantes vitales y de acontecimientos adversos). Los resultados muestran que la cinética de DZ y DMDZ es lineal a la dosis empleada, y no depende de la edad, sexo, peso, altura o raza. La relación concentración-efecto de DMDZ se describió mediante un modelo de Emax reparametrizado. El modelo que describe el efecto observado tras la administración de DZ asume una interacción aditiva entre DZ y DMDZ siendo el modelo de DZ lineal y el de DMDZ de Emax reparametrizado. El modelo indica que DMDZ contribuye de manera activa en el efecto observado tras administrar 30 mg de DZ y que también lo haría en la posología de DZ utilizada habitualmente en la clínica. Los resultados de EEG muestran que tanto DZ como DMDZ disminuyen el poder relativo alfa e incrementan el poder relativo. Los resultados obtenidos en el test de cancelación “d2” evidenciaron un descenso en la velocidad de procesamiento y en la cantidad y precisión de trabajo que puede desarrollar un sujeto, asociado a un incremento de la somnolencia y de la pasividad, todo ello de forma reproducible entre las dos administraciones de DZ. Las dosis empleadas (30 mg) de diazepam y desmetildiazepam no utilizadas en la práctica clínica habitual han demostrado ser seguras, sin mostrar cambios relevantes en las constantes vitales evaluadas y sin la aparición de ningún acontecimiento adverso no esperado ni grave. / The anxiolytics have been and are still one of the most pharmacological groups prescribed in developed countries and, particularly, in Spain, increasing its consumption from the 90s and, especially, with the economic crisis. In this work are exposed the results obtained in a pharmacokinetic and pharmacodynamic clinical study carried out with one of the most prescribed anxiolytic drugs, diazepam. Sixteen healthy young volunteers of both sexes were included and they received four treatments conditions: diazepam 30 mg (DZ) as single oral dose in two ocassions (two separated experimental sessions); desmetildiazepam (DMDZ), its active metabolite, as single oral dose of 30 mg; and placebo. Plasma concentrations of DZ and DMDZ were quantified before and several times after drug administration. Moreover, the following evaluations were performed: electroencephalographic recordings (EEG), psychomotor performance (“d2” cancellation test) and subjective sedation [visual analogue scales (VAS), evaluating drowsiness and passivity] evaluations as well as tolerability assessments (vital signs records and adverse events monitoring). Pharmacokinetic results for DZ and DMDZ showed a lineal dose-concentration relationship, without differences attributable to the age, sex, corporal weight, height or race. For DMDZ, the concentration-effect relationship was described by mean of a reparametrized Emax model. For DZ, the concentration-effect relationship was described by mean a model which assumes an additive interaction between DZ and DMDZ, being lineal for DZ and Emax re-parametrized for DMDZ. This model indicates that DMDZ contribute in active way in the effect of DZ after 30 mg single dose and that also would contribute in the effect of DZ used in clinical practice. EEG results showed that DZ and DMDZ induced a decrement of the relative alpha power and an increment of the relative beta power. The results obtained in the “d2” cancellation test evidenced a decrement in the speed of information processing as well as in the total and correct number of symbols cancelled and an increase of the subjective perception of drowsiness and passivity in all active treatment conditions. In addition, these results shows reproducibility in both treatment conditions with DZ. It is also important to note that the safety of high doses (30 mg) of DZ or DMDZ, not used in the habitual clinical practice, have proven to be safe, without relevant changes in the evaluated vital signs and without neither unexpeted nor serious adverse event.

Objetivos: Análisis de la investigación no comercial en ensayos clínicos con medicamentos realizada en el Hospital Universitari Vall d’Hebron (HUVH) tras la aplicación de la Directiva europea 2001/20/CE, y de las principales diferencias entre este tipo de investigación y la promovida por la industria farmacéutica. Método: Estudio descriptivo observacional retrospectivo, que analiza todos los ensayos clínicos con medicamentos presentados al Comité Ético de Investigación Clínica (CEIC) del HUVH desde mayo de 2004 (fecha de entrada en vigor del RD 223/2004 que regula los ensayos clínicos con medicamentos que suponía la trasposición de la Directiva europea) hasta mayo de 2009. Se recogen y analizan de forma descriptiva variables de las características de los ensayos clínicos, así como datos sobre las etapas de puesta en marcha, ejecución, finalización y difusión de sus resultados. Resultados: Del total de ensayos clínicos con medicamentos presentados al CEIC del HUVH (832), tan sólo el 16,3% fueron de promotor no comercial. El porcentaje de ensayos que obtuvieron un dictamen desfavorable fue del 3,8%, sin observarse diferencias en función del tipo de promotor. Se aprobaron un total de 778 ensayos. La mediana del tiempo desde la solicitud de evaluación al CEIC del HUVH hasta su aprobación cumplió con el tiempo establecido en la Directiva europea (inferior a 60 días), sin diferencias según el tipo de promotor. El tiempo desde la obtención del dictamen favorable del CEIC de referencia hasta la aprobación de la AEMPS fue superior para los ensayos clínicos de promotor no comercial respecto a los de promotor comercial. Los ensayos clínicos aprobados por el CEIC del HUVH de promotor no comercial en el período de estudio fueron principalmente de fase IV, ámbito multicéntrico nacional, diseño controlado paralelo y no enmascarados, en comparación con los ensayos de promotor comercial que fueron principalmente de fase III, de ámbito multicéntrico internacional, diseño controlado paralelo y enmascarados a doble ciego. Los ensayos clínicos realizados exclusivamente en población pediátrica fueron una minoría (menos del 5%), independientemente del tipo de promotor, y el uso de placebo como control del ensayo fue menos frecuente en los ensayos de promotor no comercial. En el 90% de los ensayos de promotor no comercial se evaluaron medicamentos comercializados, en comparación con los de promotor comercial, en los cuales se evaluaron en menos de una tercera parte. En cuanto a la etapa de ejecución, el tiempo desde la aprobación de la AEMPS hasta el inicio del ensayo y desde el inicio hasta la finalización fue superior en los ensayos de promotor no comercial. Los ensayos de promotor comercial fueron registrados con mayor frecuencia en el registro público ClinicalTrials.gov, y la actualización de la información sobre el seguimiento y el estado de los ensayos en los diferentes registros públicos fue inferior para los ensayos de promotor no comercial. De los ensayos aprobados por el CEIC del HUVH en el periodo del estudio, se han publicado en revistas científicas de revisión por pares el 60% de los ensayos que se encontraban finalizados, finalizados anticipadamente o en activo (63,8% de los ensayos de promotor comercial y 39,4% de los de promotor no comercial). En el 54,5% de los resúmenes de los ensayos clínicos controlados publicados se mostraron resultados positivos y en el 45,5% resultados negativos o no concluyentes, sin mostrarse diferencias según el tipo de promotor. / Objectives: Analysis of non-commercial research in clinical trials with drugs conducted in Vall d'Hebron University Hospital (HUVH) following the implementation of European Directive 2001/20/EC, and the main differences between this research and the pharmaceutical industry sponsored research. Methods: Retrospective observational descriptive study, that has analysed all clinical trials with drugs submitted to the Ethics Committee of the HUVH (CEIC) from May 2004 (date of entry into force of the RD 223/2004 which regulates clinical trials and with it the transposition of the EU Directive) to May 2009. Descriptive variables of the characteristics of clinical trials were collected and analysed, as well as data on the stages of start-up, implementation, conclusion and dissemination of results. Results: Of all the clinical trials with drugs submitted to the CEIC of HUVH (832), only 16.3% were from a non-commercial sponsor. The percentage of the trials that obtained an unfavourable opinion was 3.8%, and there were no differences regarding the sponsor. A total of 778 trials were approved. The median time from the submission until the CEIC approval was within the time limit established in European Directive (less than 60 days), and there were no differences regarding the sponsor. The time from the reference CEIC approval until the Competent Authority approval was higher for non-commercial clinical trials than for commercial clinical trials. The non-commercial clinical trials approved by the CEIC of HUVH in the study period were mainly in phase IV, multicenter national level, parallel controlled design, and non masked, compared to commercial clinical trials that were mainly in phase III, multicenter international, parallel design, and double blind masked. Clinical trials in paediatric population were only a minority (less than 5%), regardless of the sponsor, and the use of placebo control was less common in non-commercial clinical trials. In 90% of non-commercial clinical trials marketed drugs were evaluated, compared to commercial clinical trials, where marketed drugs were evaluated in less than one third of them. In the implementation phase, the time from the approval of the Competent Authority until start-up, and from the start-up to the end was higher in non-commercial clinical trials. Commercial clinical trials were registered more often in the public registry ClinicalTrials.gov, and the update of the follow-up information and the state of the clinical trials in the different public registers was lower for the non-commercial clinical trials. Of the approved clinical trials by the CEIC HUVH in the study period taking into account those completed, prematurely ended and ongoing clinical trials, 60% have been published in peer-review scientific journals (63.8% of commercial clinical trials and 39.4% of non-commercial clinical trials). In 54.5% of the abstracts of published controlled clinical trials positive results can be observed and in 45.5% of them there were negative or inconclusive results. Differences were not observed regardless of the type of sponsor.