Com o objetivo de estudar a potencialidade do emprego de termolisina como catalisador nas reações de incorporação de N-acil-asparagina a ésteres de aminoácidos e peptídeos, foram sintetizados os seguintes di- e tripeptídeos: Boc-Asn-Ile-OBzl, Z-Asn-Ile-OBzl, Moz-Asn-Ile-OBzl, Boc-Asn-Leu- OBzl, Z-Asn-Leu-OBzl, Moz-Asn-Leu-OBzl, Z-Asn-Leu-OEt, Boc-Asn-Phe-OBzl, Z-Asn-Phe-OBzl, Moz-Asn-Phe-OBzl, Z-Asn-Phe- OEt, Z-Asn-Val-OBzl, Moz-Asp-Val-OBzl, Moz-Asn-Ile-Gly-OBzl, Moz-Asn-Ile-Ala-OBzl, Moz-Asn-Ile-Leu-OBzl e Moz-Asn- Ile-Phe-OBzl. Todos os peptídeos foram obtidos na forma pura, com bom rendimento e foram analisados e caracterizados por cromatografia em camada delgada, ponto de fusão, análise elementar, análise de aminoácidos e ressonância magnética protônica. Entre os grupos protetores de asparagina, benziloxicarbonil e p-metoxibenziloxicarbonil permitiram a obtenção dos dipeptídeos com excelentes rendimentos. Foi observado que os tripeptídeos requerem para a sua síntese menores concentração de enzima e tempo de reação em relação aos dipeptídeos. Não foi possível estabelecer a especificidade secundária da termolisina para o resíduo P\'2 pois os rendimentos dos tripeptídeos sintetizados não apresentaram diferença significativa. Foi também realizado um estudo metodológico para determinar as condições ótimas de síntese de Boc-Asn-Ile-OBzl, que consistiu em analisar a influência do pH, concentração de enzima, concentraçao e volume da solução de acetato de sódio, proporção entre os componentes carboxílico e amínico, temperatura e adição de solvente orgânico ao meio de reação. / With de objective of studying the potential for the use of thermolysin as a catalyst in reactions of incorporation of N-acyl-asparagine into esters of aminoacids and peptides, the following di- and tripeptides were synthesized: Boc-Asn-Ile-OBzl, Z-Asn-Ile-OBzl, Moz-Asn-Ile-OBzl, Boc-Asn-Leu-OBzl, Z-Asn-Leu-OBzI, Moz-Asn-Leu-OBzl, Z-Asn-Leu-OEt, Boc-Asn-Phe-OBzl,Z-Asn-Phe-OBzl, Moz-Asn-Phe-OBzl, Z-Z-Asn-Phe-OEt, Z-Asn-Val-OEt, Moz-Asn-Val-OBzl, Moz-Asn-Ile-Gly-OBzl, Moz-Asn-Ile-Ala-OBzl, Moz-Asn-Ile-Leu-OBzl e Moz-Asn-Ile-Phe-OBzl. All of these peptides were obtained in pure form in good yield and analyzed and characterized by thin layer chromatography, melting point, elemental analysis, aminoacid analysis and proton magnetic resonance. Among the protecting groups of asparagine, benzyloxycarbonyl and p-methoxybenzyloxycarbonyl gave excellent yields of the dipeptides. Relative to the dipeptides, the synthesis of the tripeptides was found to require lower enzyme concentrations and temperatures. Since the yields of the tripeptides failed to exhibit significant differences, it was not possible to establish the existence of a secondary specificity of thermolysin for the residue P\' 2 . A methodological study was also performed to determine the optimum conditions for synthesis of Boc-Asn-Ile-OBzl. This study consisted of an analysis of the influence of pH, enzyme concentration, concentration and volume of the solution of sodium acetate, relative proportions of the carboxyl and amino components, temperature, and addition of organic solvent to the reaction medium.

Visando dar continuidade ao estudo de incorporação de N-acil-asparagina a derivados de aminoácidos e a peptídeos mediante catálise por termolisina, foi estudada a viabilidade de síntese dos peptídeos Z-Asn-Cys(S-Bzl)-OBut e Moz-Asn-Cys(S-Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH2. Durante a síntese do pentapeptídeo Moz-Asn-Cys(S-Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH2 foi constatada a formação de um subproduto cuja estrutura foi elucidada a partir da comparação ao padrão autêntico Moz-Asn-Leu-Gly-NH2. Para a obtenção deste padrão, sintetizamos o tripeptídeo Moz-Asn-Leu-Gly-OEt a partir de Moz-Asn-OH e H-Leu-Gly-OEt na presença de termolisina. A recristalização deste peptídeo em MeOH/H2 O levou à transformação do mesmo em Moz-Asn-Leu-Gly-OMe, confirmada pelo isolamento e caracterização do produto por espectrometria de massa e ressonância magnética protônica, análise elementar e de aminoácidos e por determinação do tempo de retenção por HPLC. Estudos posteriores demonstraram o envolvimento do íon Ca(II) no processo e nos permitiram sugerir um modelo da ligação deste íon ao peptídeo e da sequência de reação da transesterificação estudada. Também foi investigada a possibilidade de diversos ésteres de peptídeos e de peptidilresinas de Merrifield sofrerem transesterificação quando incubados em metanol na presença de Ca(II). Para tanto, os tripeptídeos Z-Asn-Leu-Gly-OEt, Boc-Asn-Leu-Gly-OEt, Moz-Asn-Leu-Gly-OBzl, Moz-Asn-Leu-Gly-OBu Moz-Gln-Leu-Gly-OEt, Moz-Asn-Ile-Gly-OEt e Moz-Asn-Leu-Ala-OEt foram sintetizados mediante catálise por termolisina. Também foram testados vários outros peptídeos disponíveis no laboratório e Boc-Leu-Gly-Res e Moz-Asn-Leu-Gly-Res. Com exceção dos ésteres terc-butílicos, todos sofreram transesterificação em soluções metanólicas de acetato de cálcio. / The main obJective was the study of thermolysin catalyzed incorporation of N-acyl-asparagine into amino acid and peptide derivatives. Both Z-Asn-Cys(S-Bzl)-OBut and Moz-Asn-Cys(S-Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH2 syntheses have been studied. The formation of a by-product occurred during the synthesis of the later pentapeptide. By comparison with an authentic standard this by-product was identified as Moz-Asn-Leu-Gly-NH2. The standard Moz-Asn-Leu-Gly-NH2 was obtained by aminolYSlS of Moz-Asn-Leu-Gly-OEt. This peptide was synthesized by coupling Moz-Asn-OH with H-Leu-Gly-OEt using thermolysin as catalyst. During the recrystallization in MeOH/H2O, the transformation of Moz-Asn-Leu-Gly-OEt to its methyl-ester was obtained. This observation has been confirmed by purification and caracterization of the peptide by: Mass Spectroscopy, Nuclear Magnetic Ressonance, Amino Acid and Elemental Analysis and HPLC. Later studies have shown that the Ca(II) ion participates in the process. A model for the binding of this ion to the peptide and for the transesterification reaction has been suggested. Further studies have been performed with (1) the newly synthesized peptides Z-Asn-Leu-Gly-OEt, Boc-Asn-Leu-Gly-OEt, Moz-Asn-Leu-Gly-OBzl, Moz-Asn-Leu-Gly-OBut, Moz-Gln-Leu-Gly-OEt, Moz- Asn-Ile-Gly-OEt and Moz-Asn-Leu-Ala-OEt; (2) several other peptides available in our laboratory; and (3) Boc-Leu-Gly-Res and Moz-Asn-Leu-Gly-Res. With the exception of t-butyl-esters, all peptides tested have transesterified in methanolic calcium acetate solutions.

Com o objetivo de estudar a potencialidade do emprego de termolisina como catalisador nas reações de incorporação de N-acil-asparagina a ésteres de aminoácidos e peptídeos, foram sintetizados os seguintes di- e tripeptídeos: Boc-Asn-Ile-OBzl, Z-Asn-Ile-OBzl, Moz-Asn-Ile-OBzl, Boc-Asn-Leu- OBzl, Z-Asn-Leu-OBzl, Moz-Asn-Leu-OBzl, Z-Asn-Leu-OEt, Boc-Asn-Phe-OBzl, Z-Asn-Phe-OBzl, Moz-Asn-Phe-OBzl, Z-Asn-Phe- OEt, Z-Asn-Val-OBzl, Moz-Asp-Val-OBzl, Moz-Asn-Ile-Gly-OBzl, Moz-Asn-Ile-Ala-OBzl, Moz-Asn-Ile-Leu-OBzl e Moz-Asn- Ile-Phe-OBzl. Todos os peptídeos foram obtidos na forma pura, com bom rendimento e foram analisados e caracterizados por cromatografia em camada delgada, ponto de fusão, análise elementar, análise de aminoácidos e ressonância magnética protônica. Entre os grupos protetores de asparagina, benziloxicarbonil e p-metoxibenziloxicarbonil permitiram a obtenção dos dipeptídeos com excelentes rendimentos. Foi observado que os tripeptídeos requerem para a sua síntese menores concentração de enzima e tempo de reação em relação aos dipeptídeos. Não foi possível estabelecer a especificidade secundária da termolisina para o resíduo P\'2 pois os rendimentos dos tripeptídeos sintetizados não apresentaram diferença significativa. Foi também realizado um estudo metodológico para determinar as condições ótimas de síntese de Boc-Asn-Ile-OBzl, que consistiu em analisar a influência do pH, concentração de enzima, concentraçao e volume da solução de acetato de sódio, proporção entre os componentes carboxílico e amínico, temperatura e adição de solvente orgânico ao meio de reação. / With de objective of studying the potential for the use of thermolysin as a catalyst in reactions of incorporation of N-acyl-asparagine into esters of aminoacids and peptides, the following di- and tripeptides were synthesized: Boc-Asn-Ile-OBzl, Z-Asn-Ile-OBzl, Moz-Asn-Ile-OBzl, Boc-Asn-Leu-OBzl, Z-Asn-Leu-OBzI, Moz-Asn-Leu-OBzl, Z-Asn-Leu-OEt, Boc-Asn-Phe-OBzl,Z-Asn-Phe-OBzl, Moz-Asn-Phe-OBzl, Z-Z-Asn-Phe-OEt, Z-Asn-Val-OEt, Moz-Asn-Val-OBzl, Moz-Asn-Ile-Gly-OBzl, Moz-Asn-Ile-Ala-OBzl, Moz-Asn-Ile-Leu-OBzl e Moz-Asn-Ile-Phe-OBzl. All of these peptides were obtained in pure form in good yield and analyzed and characterized by thin layer chromatography, melting point, elemental analysis, aminoacid analysis and proton magnetic resonance. Among the protecting groups of asparagine, benzyloxycarbonyl and p-methoxybenzyloxycarbonyl gave excellent yields of the dipeptides. Relative to the dipeptides, the synthesis of the tripeptides was found to require lower enzyme concentrations and temperatures. Since the yields of the tripeptides failed to exhibit significant differences, it was not possible to establish the existence of a secondary specificity of thermolysin for the residue P\' 2 . A methodological study was also performed to determine the optimum conditions for synthesis of Boc-Asn-Ile-OBzl. This study consisted of an analysis of the influence of pH, enzyme concentration, concentration and volume of the solution of sodium acetate, relative proportions of the carboxyl and amino components, temperature, and addition of organic solvent to the reaction medium.

Visando dar continuidade ao estudo de incorporação de N-acil-asparagina a derivados de aminoácidos e a peptídeos mediante catálise por termolisina, foi estudada a viabilidade de síntese dos peptídeos Z-Asn-Cys(S-Bzl)-OBut e Moz-Asn-Cys(S-Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH2. Durante a síntese do pentapeptídeo Moz-Asn-Cys(S-Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH2 foi constatada a formação de um subproduto cuja estrutura foi elucidada a partir da comparação ao padrão autêntico Moz-Asn-Leu-Gly-NH2. Para a obtenção deste padrão, sintetizamos o tripeptídeo Moz-Asn-Leu-Gly-OEt a partir de Moz-Asn-OH e H-Leu-Gly-OEt na presença de termolisina. A recristalização deste peptídeo em MeOH/H2 O levou à transformação do mesmo em Moz-Asn-Leu-Gly-OMe, confirmada pelo isolamento e caracterização do produto por espectrometria de massa e ressonância magnética protônica, análise elementar e de aminoácidos e por determinação do tempo de retenção por HPLC. Estudos posteriores demonstraram o envolvimento do íon Ca(II) no processo e nos permitiram sugerir um modelo da ligação deste íon ao peptídeo e da sequência de reação da transesterificação estudada. Também foi investigada a possibilidade de diversos ésteres de peptídeos e de peptidilresinas de Merrifield sofrerem transesterificação quando incubados em metanol na presença de Ca(II). Para tanto, os tripeptídeos Z-Asn-Leu-Gly-OEt, Boc-Asn-Leu-Gly-OEt, Moz-Asn-Leu-Gly-OBzl, Moz-Asn-Leu-Gly-OBu Moz-Gln-Leu-Gly-OEt, Moz-Asn-Ile-Gly-OEt e Moz-Asn-Leu-Ala-OEt foram sintetizados mediante catálise por termolisina. Também foram testados vários outros peptídeos disponíveis no laboratório e Boc-Leu-Gly-Res e Moz-Asn-Leu-Gly-Res. Com exceção dos ésteres terc-butílicos, todos sofreram transesterificação em soluções metanólicas de acetato de cálcio. / The main obJective was the study of thermolysin catalyzed incorporation of N-acyl-asparagine into amino acid and peptide derivatives. Both Z-Asn-Cys(S-Bzl)-OBut and Moz-Asn-Cys(S-Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH2 syntheses have been studied. The formation of a by-product occurred during the synthesis of the later pentapeptide. By comparison with an authentic standard this by-product was identified as Moz-Asn-Leu-Gly-NH2. The standard Moz-Asn-Leu-Gly-NH2 was obtained by aminolYSlS of Moz-Asn-Leu-Gly-OEt. This peptide was synthesized by coupling Moz-Asn-OH with H-Leu-Gly-OEt using thermolysin as catalyst. During the recrystallization in MeOH/H2O, the transformation of Moz-Asn-Leu-Gly-OEt to its methyl-ester was obtained. This observation has been confirmed by purification and caracterization of the peptide by: Mass Spectroscopy, Nuclear Magnetic Ressonance, Amino Acid and Elemental Analysis and HPLC. Later studies have shown that the Ca(II) ion participates in the process. A model for the binding of this ion to the peptide and for the transesterification reaction has been suggested. Further studies have been performed with (1) the newly synthesized peptides Z-Asn-Leu-Gly-OEt, Boc-Asn-Leu-Gly-OEt, Moz-Asn-Leu-Gly-OBzl, Moz-Asn-Leu-Gly-OBut, Moz-Gln-Leu-Gly-OEt, Moz- Asn-Ile-Gly-OEt and Moz-Asn-Leu-Ala-OEt; (2) several other peptides available in our laboratory; and (3) Boc-Leu-Gly-Res and Moz-Asn-Leu-Gly-Res. With the exception of t-butyl-esters, all peptides tested have transesterified in methanolic calcium acetate solutions.