Foi investigado o valor diagnóstico da resposta alérgica cutânea à tuberculina e do ELISA indireto, com antígeno recombinante MPB 70, em leitões experimentalmente sensibilizados, pela via intramuscular, com suspensões oleosas de M. bovis ou M. avium inativados. Foram utilizados 91 animais divididos em quatro grupos. Os grupos A e B, cada um com 25 indivíduos, grupos C e D com 21 e 20 indivíduos respectivamente, balanceando-se as características de raça, linhagem, faixa etária e sexo. Aos 21 dias de idade, todos os animais foram submetidos a uma triagem com a aplicação de tuberculina PPD de M. bovis, pela via intradérmica na base da orelha e não houve qualquer tipo de reação. Decorridos 60 dias do teste tuberculínico de triagem, o grupo A, recebeu injeção intramuscular de 0,5 mL de uma suspensão oleosa de M. avium estirpe D4; o grupo B, recebeu 0,5 mL de uma suspensão oleosa de M. bovis estirpe AN5; o grupo C (controle I), recebeu 0,5 mL do adjuvante oleoso e o grupo D (controle II), recebeu 0,5 mL de solução fisiológica. Foi realizado o exame histopatológico de biopsias das reações cutâneas e a colheita de sangue para o teste de ELISA de captura. Após 30 dias da sensibilização, foi efetuada a prova de tuberculinização comparativa com reação medida pela variação da espessura da pele com paquímetro às 0h, 24h, 48h e 72h, após a aplicação das tuberculinas. No teste comparativo, lido às 72 horas, a reação foi considerada negativa quando a diferença das reações entre o PPD bovino e o PPD aviário foi menor que 6,7 mm; suspeito ou inconclusivo quando a diferença se situou na faixa de 6,7 a 7,5 mm; e positiva para o tipo de PPD, considerando-se tuberculose para PPD M. bovis e micobacteriose para PPD M. avium, quando a diferença da reação foi superior a 7,5 mm. Nos exames histopatológicos, foi observado intenso infiltrado inflamatório linfocitário no local das reações intradérmicas dos animais testados com o PPD homologo ao tipo de micobactéria utilizada na suspensão oleosa sensibilizante. O ensaio de ELISA com antígeno, MPB 70 recombinante, foi capaz de revelar a presença de anticorpos contra o M. bovis, porém não revelou anticorpos para M. avium. / The diagnostic value of the cutaneous allergic response to tuberculin and Indirect ELISA test was investigated using MPB 70 recombinant antigen, in piglets experimentally sensitized intramuscularly with the oily suspensions of inactivated M. bovis or M. avium. The ninety-one animals used were divided into four groups. The groups A and B were formed each with 25 individuals, and groups C and D, with 21 and 20 individuals, respectively, balancing the characteristics of race, ancestry, age and sex. At the age of 21 days, all the animals were submitted to the screening test with the use of M. bovis PPD, by the intradermal route at the base of the ear and no reaction was detected. Sixty days after the screening tuberculin test, animals of the group A were injected intramuscularly with 0.5 mL of oily suspension of M. avium D4 strain; animals of group B received 0.5 mL of an oily suspension of M. bovis, AN5 strain; and the members of group C (control I) received 0.5 mL of an oily adjuvant and the individuals of group D (control II) received 0.5 mL of saline solution. Histological examinations of biopsies of skin reactions were carried out and blood collections made for capture ELISA. Following 30 days of sensitization, comparative skin reactions were measured by the variation in skin thickness with a caliper at 0h, 24h, 48h an 72h after applications of tuberculins. In the comparative test measured at 72h, the reaction was considered negative when the difference of the reactions between bovine PPD and avian PPD was less than 6.7 mm; suspected or inconclusive, when the difference stood in the range of 6.7 to 7.5 mm; and positive according to the type of PPD, considering tuberculosis the M. bovis PPD and mycobacteriosis the M. avium PPD, when the difference of the reaction was greater than 7.5 mm. In histopathological examinations, intense lymphocytic inflammatory infiltrate were observed at the site of intradermal reactions of the animals tested with PPD homologous to the type of mycobacteria used in sensitizing oil suspension. The ELISA assay with MPB 70 recombinant antigen was able to reveal the presence of antibodies against M. bovis, but did not reveal antibodies to M. avium.

Foi investigado o valor diagnóstico da resposta alérgica cutânea à tuberculina e do ELISA indireto, com antígeno recombinante MPB 70, em leitões experimentalmente sensibilizados, pela via intramuscular, com suspensões oleosas de M. bovis ou M. avium inativados. Foram utilizados 91 animais divididos em quatro grupos. Os grupos A e B, cada um com 25 indivíduos, grupos C e D com 21 e 20 indivíduos respectivamente, balanceando-se as características de raça, linhagem, faixa etária e sexo. Aos 21 dias de idade, todos os animais foram submetidos a uma triagem com a aplicação de tuberculina PPD de M. bovis, pela via intradérmica na base da orelha e não houve qualquer tipo de reação. Decorridos 60 dias do teste tuberculínico de triagem, o grupo A, recebeu injeção intramuscular de 0,5 mL de uma suspensão oleosa de M. avium estirpe D4; o grupo B, recebeu 0,5 mL de uma suspensão oleosa de M. bovis estirpe AN5; o grupo C (controle I), recebeu 0,5 mL do adjuvante oleoso e o grupo D (controle II), recebeu 0,5 mL de solução fisiológica. Foi realizado o exame histopatológico de biopsias das reações cutâneas e a colheita de sangue para o teste de ELISA de captura. Após 30 dias da sensibilização, foi efetuada a prova de tuberculinização comparativa com reação medida pela variação da espessura da pele com paquímetro às 0h, 24h, 48h e 72h, após a aplicação das tuberculinas. No teste comparativo, lido às 72 horas, a reação foi considerada negativa quando a diferença das reações entre o PPD bovino e o PPD aviário foi menor que 6,7 mm; suspeito ou inconclusivo quando a diferença se situou na faixa de 6,7 a 7,5 mm; e positiva para o tipo de PPD, considerando-se tuberculose para PPD M. bovis e micobacteriose para PPD M. avium, quando a diferença da reação foi superior a 7,5 mm. Nos exames histopatológicos, foi observado intenso infiltrado inflamatório linfocitário no local das reações intradérmicas dos animais testados com o PPD homologo ao tipo de micobactéria utilizada na suspensão oleosa sensibilizante. O ensaio de ELISA com antígeno, MPB 70 recombinante, foi capaz de revelar a presença de anticorpos contra o M. bovis, porém não revelou anticorpos para M. avium. / The diagnostic value of the cutaneous allergic response to tuberculin and Indirect ELISA test was investigated using MPB 70 recombinant antigen, in piglets experimentally sensitized intramuscularly with the oily suspensions of inactivated M. bovis or M. avium. The ninety-one animals used were divided into four groups. The groups A and B were formed each with 25 individuals, and groups C and D, with 21 and 20 individuals, respectively, balancing the characteristics of race, ancestry, age and sex. At the age of 21 days, all the animals were submitted to the screening test with the use of M. bovis PPD, by the intradermal route at the base of the ear and no reaction was detected. Sixty days after the screening tuberculin test, animals of the group A were injected intramuscularly with 0.5 mL of oily suspension of M. avium D4 strain; animals of group B received 0.5 mL of an oily suspension of M. bovis, AN5 strain; and the members of group C (control I) received 0.5 mL of an oily adjuvant and the individuals of group D (control II) received 0.5 mL of saline solution. Histological examinations of biopsies of skin reactions were carried out and blood collections made for capture ELISA. Following 30 days of sensitization, comparative skin reactions were measured by the variation in skin thickness with a caliper at 0h, 24h, 48h an 72h after applications of tuberculins. In the comparative test measured at 72h, the reaction was considered negative when the difference of the reactions between bovine PPD and avian PPD was less than 6.7 mm; suspected or inconclusive, when the difference stood in the range of 6.7 to 7.5 mm; and positive according to the type of PPD, considering tuberculosis the M. bovis PPD and mycobacteriosis the M. avium PPD, when the difference of the reaction was greater than 7.5 mm. In histopathological examinations, intense lymphocytic inflammatory infiltrate were observed at the site of intradermal reactions of the animals tested with PPD homologous to the type of mycobacteria used in sensitizing oil suspension. The ELISA assay with MPB 70 recombinant antigen was able to reveal the presence of antibodies against M. bovis, but did not reveal antibodies to M. avium.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:30:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSSERTACAO CRISTINA.pdf: 3986017 bytes, checksum: add734135c93af474b22c106a3a51d41 (MD5) Previous issue date: 2007-02-23 / Tuberculosis (TB) caused by the Mycobacterium tuberculosis is responsible for more than 2 million deaths annually in the world. Although one third of the world population carries the bacilli, only 5% of the infected people develop active disease. 80% of TB cases are concentrated among 21 countries and Brazil is one of them. Due to the flaws existent inherent to the TB diagnostic, many works try to discover TB antigens to be used on an ELISA assay to detect active TB in underdeveloped countries, endemic for other mycobacterias such as leprosy (L). Several researches are identifying bacilli proteins obtained under nutritional culture stress, in order to mimic the intracellular milieu. It has been selected the immunodominant ones as a disease marker. The objective of this work was to characterize the humoral immune response among TB patients to rMPT-51 and rGlcB using an ELISA indirect test. It was included voluntaries that were HIV negative and the ones without pregnancy, chronic disease or under immunosuppressant treatment. Serum IgM and IgG against MPT-51 and GlcB recombinant antigen from 49 patients with active tuberculosis were measured by indirect ELISA, paired by sex and age with: healthy PPD negative individuals (controls) and lepromatous leprosy patients (LL). Patients with TB (0.810±0.319) showed higher levels of IgM against rMPT-51 than both LL individuals (0.454±0.195) and control (0.448±0.162) with statistical significant, p= 0.001 and p<0.001) respectively. These test showed 96.9% specificity and 67.3% sensitivity. Conversely, tuberculosis, controls, and LL individuals showed lower of MPT-51 IgG levels, which could not be distinguished among the groups. rGlcB antigen was able to distinguished TB patients from controls for IgM levels (specificity, 95.9 % and sensitivity, 8.2% ) and IgG levels (specificity, 99% and sensitivity, 18.2%). In order to evaluate the profiles of IgM and IgG against rMPT-51 and rGlcB before and after chemotherapy, the sera from 11 patients was collected and paired according to the treatment status (before or after). IgM and IgG against MPT-51 remained with the same profile levels before and after the treatment. The levels of serum IgG against rGlcB clearly diminished after the chemotherapy (p<0.01). Our results suggest that serum IgM levels against recombinant MPT-51 could to be useful to distinguish between active TB, controls and LL individuals. In addition, after TB treatment the IgG response to rGlcB diminished suggesting that it could be used to follow up of the TB treatment / A tuberculose (TB) causada pelo Mycobacterium tuberculosis, resulta em mais de dois milhões de óbitos anualmente. Segundo dados da OMS cerca de 30% da população mundial está infectada com o bacilo e 5% desses infectados desenvolvem a doença ativa. O Brasil juntamente com outros 21 países albergam 80% de todos os casos de TB no mundo. Devido às falhas existentes nos diagnósticos atuais, muitos estudos tentam descobrir antígenos do Mycobacterium tuberculosis que podem ser usados no ensaio ELISA, um teste de baixo custo. Esse teste seria de grande valia na identificação da tuberculose, principalmente em países em desenvolvimento endêmicos também para outras micobactérias como M. leprae, causador da hanseníase. Várias pesquisas têm identificado componentes do bacilo, como as proteínas secretadas pelas micobactérias em cultura, sob condições de estresse nutricional, mimetizando a situação vivida pelo bacilo no meio intracelular. Dessas proteínas são selecionadas aquelas imunodominantes que podem ser usadas como marcadores da doença. O objetivo desse trabalho foi avaliar o reconhecimento de duas dessas proteínas: os antígenos recombinantes MPT-51 e GlcB do M. tuberculosis, por anticorpos séricos da classe IgM e IgG de pacientes com tuberculose ativa, pelo método imunoenzimático indireto (ELISA). Foram adotados como critério de inclusão aqueles indivíduos de qualquer grupo que fossem HIV negativos, sem doenças crônicas ou uso de medicamentos imunossupressores e mulheres não gestantes. Quarenta e nove pacientes com tuberculose ativa foram selecionados e comparados com os grupos: controles saudáveis PPD não reatores e pacientes hansenianos portadores da forma Virchoviana, pareados por sexo e idade. Os pacientes com TB (0,810±0,319) mostraram maiores concentrações de IgM anti-MPT-51 que os seus respectivos controles: pacientes com hanseníase 0,454±0,195) e controles saudáveis (0,448±0,162), com diferença estatística, p=0,001 e p<0,001 respectivamente. Os ensaios de ELISA nas dosagens de IgM e IgG anti-MPT-51 mostraram especificidade de 96,9% e 98,0% e sensibilidade 67,3% e 4,1% respectivamente. Para o antígeno GlcB, os ensaios de ELISA na dosagem de IgM e IgG mostraram especificidade de 95,9% e 99% e sensibilidade 8,2% e 18,2%. Onze pacientes com TB foram monitorados durante o tratamento, com realização de dosagens dos níveis de anticorpos IgM e IgG específicos ao rMPT-51 e rGlcB antes e após a terapia. Os níveis de anticorpos IgM e IgG anti-MPT-51 antes e após a terapia não sofreram alterações significativas. Entretanto, os níveis de IgG anti-GlcB diminuíram após a terapia (p<0,01). Nossos resultados sugerem que o rMPT-51 pode ser usado como marcador da tuberculose, quando mensuradas as concentrações de IgM específicos, pois foram capazes de discriminar pacientes TB, de controles e hansenianos. Apesar do ELISA ter demonstrado baixa sensibilidade quando o antígeno rGlcB foi utilizado, os níveis séricos dos anticorpos da classe IgG diminuíram após o tratamento da tuberculose (p<0,01) sugerindo que essa técnica poderia ser utilizada para o acompanhamento da terapêutica