Les cancers tête et cou ou des voies aérodifestives supéreiures (VADS) représentent le sixième cancer le plus fréquent dans le monde entier. Le traitement des stades avancés de ces tumeurs est basé sur le traitement chirurgical combinée à la radiothérapie +/- à la chimiothérapie. Toutefois , la survie à 5 ans reste faible et le développement de nouvelles thérapies ciblées est nécessaire. Le F14512 combine un noyau épipodophyllotoxine de ciblage de la topoisomérase II avec un groupement spermine introduit afin de permettre de véhiculer la molécule par le STP. Ce groupement spermine facilite la captation sélective par les cellules tumorales par l'intermédiaire du système de transport de polyamine (STP) suractivé dans les cellules tumorales. Nous rapportons ici l'évaluation du F14512 sur des lignées cellulaires cancéreuses des VADS.Quatre lignées cellulaires représentatives de l'anatomie de la tête et du cou ont été utilisés : Il s'agissait des lignées Fadu ( pharynx ), SQ20B ( larynx ), CAL33 et CAL27 ( base de la langue ). L'activité du STP et la spécificité ont été évaluées par la cytométrie en flux et la microscopie confocale en utilisant une sonde fluorescente le F17073 contenant le même fragment spermine que le F14512. La cytotoxicité, seule ou en association avec des agents chimiothérapeutiques standards (cisplatine, 5FU), et les effets de radio-sensibilisation ont été étudiés par MTS et par des tests clonogéniques. L'activité du STP et l'efficacité du F14512 ont également été mesurés dans des conditions hypoxiques (1 % O2).Dans les quatre lignées testées, un STP actif a été mis en évidence permettant un transfert rapide et spécifique au noyau des composés couplés à un groupement spermine. Fait intéressant, le F14512 présente un effet cytotoxique 1,6 à 11 fois plus élevé que l'étoposide composé de référence (dépourvu de la chaîne de spermine). Il apparaît également plus cytotoxique que le 5FU et le cisplatine dans toutes les lignées cellulaires. Des expériences de compétition avec la spermine ont confirmé le rôle essentiel du STP dans la vectorisation et la cytotoxicité du F14512. Les conditions d'hypoxie n'avait presque pas d'impact sur la cytotoxicité des molécules. La combinaison du F14512 avec le cisplatine, mais pas le 5FU, s'est révélée être synergique et pour la première fois nous avons démontré le potentiel radio-sensibilisant significatif du F14512.Le groupement spermine du F14512 confère une action ciblée et une meilleure efficacité que l'étoposide sur des lignées cancéreuses des VADS. L'effet synergique observé en association avec le cisplatine et la radiothérapie apparait intéressant pour le développement potentiel de F14512 en cancérologie des VADS. / Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC) is the sixth most common cancer worldwide. The treatment of advanced stages HNSCC is based on surgical treatment combined with radiotherapy and chemotherapy or concomitant chemo-radiotherapy. However, the 5-year survival remains poor for advanced stages HNSCC and the development of new targeted therapies is eagerly awaited. F14512 combines an epipodophyllotoxin core-targeting topoisomerase II with a spermine moiety introduced as a cell delivery vector. This spermine moiety facilitates selective uptake by tumor cells via the Polyamine Transport System (PTS) and reinforces topoisomerase II poisoning. Here we report the evaluation of F14512 toward HNSCC.Four cell lines representative of head and neck cancer localizations were used: Fadu (pharynx), SQ20B (larynx), CAL33 and CAL27 (base of the tongue). PTS activity and specificity were evaluated by confocal microscopy and flow cytometry using the fluorescent probe F17073 which contains the same spermine moiety as F14512. Cytotoxicity, alone or in association with standard chemotherapeutic agents (cisplatin, 5FU), and radio-sensitizing effects were investigated using MTS and clonogenic assays, respectively. F14512 efficiency and PTS activity were also measured under hypoxic conditions (1% O2).In all 4 tested HNSCC lines, an active PTS was evidenced providing a specific and rapid transfer of spermine-coupled compounds into cell nuclei. Interestingly, F14512 presents a 1.6 to 11 fold higher cytotoxic effect than the reference compound etoposide (lacking the spermine chain). It appears also more cytotoxic than 5FU and cisplatin in all cell lines. Competition experiments with spermine confirmed the essential role of the PTS in the cell uptake and cytotoxicity of F14512. Hypoxia had almost no impact on the drug cytotoxicity. The combination of F14512 with cisplatin, but not 5FU, was found to be synergistic and, for the first time, we demonstrated the significant radio-sensitizing potential of F14512. The spermine moiety of F14512 confers a targeted effect and a much better efficacy than etoposide in HNSCC lines. The synergistic effect observed in association with cisplatin and radiotherapy augurs well for the potential development of F14512 in HNSCC.

Les mastocytes (MCs) sont issus des cellules hématopoïétiques multipotentes non engagées, CD34+, et jouent un rôle important dans l’initiation de la réponse immunitaire innée et adaptative, ainsi que dans les réactions allergiques IgE-dépendantes. Les mastocytoses sont des néoplasies myéloïdes caractérisées par une accumulation anormale et l'activation fréquente de mastocytes dans divers organes. Les organes généralement atteints sont la moelle osseuse, la peau, le foie et le tractus gastro-intestinal. Elles sont caractérisées dans l’immense majorité des cas par la présence de mutations acquises de la structure du récepteur KIT (plus particulièrement KIT D816V) qui induisent l’activation constitutive de ce récepteur à activité tyrosine kinase intrinsèque. Le traitement actuel de ces pathologies est décevant car la mutation KIT D816V résiste à la plupart des inhibiteurs de tyrosine kinases (ITKs).Dès le début de ma thèse, nous avons pu établir, à partir de cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon humain normal cultivées à long terme en présence de stem cell factor (SCF), une nouvelle lignée mastocytaire humaine stable, dénommée ROSA KIT WT, restant strictement dépendante pour sa survie et sa prolifération du SCF, exprimant le récepteur de haute affinité aux IgE (FcεRI), et présentant un récepteur KIT de structure normale. Cette lignée, facile à cultiver en grandes quantités, permet d’envisager l’étude approfondie des évènements intracellulaires menant à l’activation mastocytaire IgE-dépendante et la mise au point de tests de criblage à haut débit dans le domaine de la thérapeutique anti-allergique et/ou anti-inflammatoire.Par ailleurs, afin de pouvoir étudier le rôle transformant des mutants de KIT retrouvés au cours des mastocytoses, nous avons transfecté les cellules ROSA KIT WT par des vecteurs lentiviraux apportant une construction codant pour le KIT muté en D816V ou le KIT muté Delta 417-419 insY. Nous avons ainsi obtenu deux nouvelles lignées mastocytaires humaines SCF-indépendantes, ROSA KIT D816V et ROSA KIT Delta 417-419 insY, pour lesquelles nous avons montré qu’il existe une activation constitutive de KIT, mais aussi de STAT5 et d’AKT. Ces deux lignées de pourront être utilisées soit pour étudier l’impact des mutations de KIT sur la signalisation intracellulaire, soit pour le criblage molécules à activité antiproliférative potentielle dirigées soit contre KIT muté, soit contre l'une ou l’autre des molécules intracellulaires impliquées dans la transduction du signal KIT muté / Mast cells are cells with ubiquitous tissue distribution, derived from CD34 + multipotent hematopoietic cells. These cells play a fundamental role in the initiation of innate and adaptive immune response and in IgE-dependent allergic reactions or in various inflammatory reactions.Mastocytosis is defined as a myeloproliferative neoplastic disorder, caused by an abnormal accumulation of mast cells in one or more organ systems. Mastocytosis presents in cutaneous and systemic forms. In patients with systemic mastocytosis, the most frequent point mutation is KIT D816V, whereas in pediatric patients, where the disease is usually restricted to the skin, different KIT defects have been detected, mostly in the extracellular portion of KIT.In a primary culture of mast cells made from precursors of one cord blood, we have successfully isolated a new human mast cell line called ROSA KIT WT with a phenotype and reactivity comparable to those of normal mast cells. This cell line is dependent on SCF for growth and expresses the KIT receptor wild. It is easy to grow in large quantities, to freeze and to activate by IgE-anti IgE couple or a couple of allergen and corresponding specific IgE. This cell line can be used to study pathophysiologic mechanisms of allergy and to develop and use high-throughput screening tests of molecules in search of anti-allergic properties.In addition, we transfected these cells by lentiviral vectors providing constructs encoding the mutated KIT D816V or the mutated KIT Delta 417-419 insY, two KIT abnormalities encountered in the course of mastocytosis. This allowed us to establish two new cell lines independent of SCF for proliferation, ROSA KIT D816V and ROSA KIT Delta417-419 insY, which are particularly easy to grow in large quantities, and whose phenotype is similar to that of abnormal mast cells during mastocytosis. These two cell lines can be used for pathophysiologic studies on mastocytosis and for high throughput screening of molecules in search of antiproliferative effects specifically directed against the mutated KIT or against one or other of the intracellular molecules involved in signal transduction induced by mutant KIT.

Les mastocytes (MCs) sont issus des cellules hématopoïétiques multipotentes non engagées, CD34+, et jouent un rôle important dans l'initiation de la réponse immunitaire innée et adaptative, ainsi que dans les réactions allergiques IgE-dépendantes. Les mastocytoses sont des néoplasies myéloïdes caractérisées par une accumulation anormale et l'activation fréquente de mastocytes dans divers organes. Les organes généralement atteints sont la moelle osseuse, la peau, le foie et le tractus gastro-intestinal. Elles sont caractérisées dans l'immense majorité des cas par la présence de mutations acquises de la structure du récepteur KIT (plus particulièrement KIT D816V) qui induisent l'activation constitutive de ce récepteur à activité tyrosine kinase intrinsèque. Le traitement actuel de ces pathologies est décevant car la mutation KIT D816V résiste à la plupart des inhibiteurs de tyrosine kinases (ITKs).Dès le début de ma thèse, nous avons pu établir, à partir de cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon humain normal cultivées à long terme en présence de stem cell factor (SCF), une nouvelle lignée mastocytaire humaine stable, dénommée ROSA KIT WT, restant strictement dépendante pour sa survie et sa prolifération du SCF, exprimant le récepteur de haute affinité aux IgE (FcεRI), et présentant un récepteur KIT de structure normale. Cette lignée, facile à cultiver en grandes quantités, permet d'envisager l'étude approfondie des évènements intracellulaires menant à l'activation mastocytaire IgE-dépendante et la mise au point de tests de criblage à haut débit dans le domaine de la thérapeutique anti-allergique et/ou anti-inflammatoire.Par ailleurs, afin de pouvoir étudier le rôle transformant des mutants de KIT retrouvés au cours des mastocytoses, nous avons transfecté les cellules ROSA KIT WT par des vecteurs lentiviraux apportant une construction codant pour le KIT muté en D816V ou le KIT muté Delta 417-419 insY. Nous avons ainsi obtenu deux nouvelles lignées mastocytaires humaines SCF-indépendantes, ROSA KIT D816V et ROSA KIT Delta 417-419 insY, pour lesquelles nous avons montré qu'il existe une activation constitutive de KIT, mais aussi de STAT5 et d'AKT. Ces deux lignées de pourront être utilisées soit pour étudier l'impact des mutations de KIT sur la signalisation intracellulaire, soit pour le criblage molécules à activité antiproliférative potentielle dirigées soit contre KIT muté, soit contre l'une ou l'autre des molécules intracellulaires impliquées dans la transduction du signal KIT muté