La mastocytose est une maladie hétérogène, caractérisée par une accumulation de mastocytes dans l'organisme. Les enfants et les adultes ont des mutations différentes de c-Kit. Dans un premier travail, nous avons montré que seules les formes adultes sont associées à la réactivation de la télomérase, alors que les formes pédiatriques ne sont pas. Cela semble être lié aux différences de mutations de c-Kit observées entre adultes et enfants et pourrait expliquer pourquoi seules les formes pédiatriques de mastocytose régressent spontanément et non les formes adultes. Ces résultats aident à mieux comprendre la physiopathologie de la mastocytose. Dans un second travail, nous a étudié le lien entre la longueur des télomères et les troubles psychologiques des adultes atteints de mastocytose. Nous avons montré que réactions émotionnelles négatives sont corrélées au raccourcissement de la longueur des télomères des leucocytes et que l'érosion télomérique est fortement prédite par les défauts de régulation des émotions. Nous émettons l'hypothèse qu'au cours des troubles neuropsychologiques, le mastocyte pourrait être impliqué dans le raccourcissement de la longueur des télomères en périphérie.

La peau est un « avant poste » fascinant du système immunitaire. Elle forme une barrière entre l'environnement extérieur et l’organisme. Elle est aussi le point d'entrée pour les agents pathogènes, contre lesquels le système immunitaire organise des réponses adaptatives. Les acteurs de l'immunité innée de la peau contrôlent l'invasion des pathogènes et perçoivent également des changements environnementaux physiques et chimiques directs. Plusieurs composants du système immunitaire, tels que des cellules dendritiques (DCs), les macrophages (MΦ) et les mastocytes (MCs), participent à l'éradication des pathogènes et à l'initiation des réponses mémoires adaptatives. Ce qui permet une mobilisation rapide des cellules T effectrices ainsi que la sécrétion des anticorps par les cellules B à la suite d’une seconde exposition aux agents pathogènes. Les MCs qui sont des cellules résidentes du derme, jouent un rôle déterminant dans la libération de signaux d’alertes et sont classiquement considérés comme des cellules effectrices de la réaction allergique cutanée liée à l'IgE. Plusieurs observations récentes indiquent que les MCs seraient aussi impliqués dans les processus immunorégulateurs lors de l'initiation des réponses immunitaires adaptatives, dans le maintien de la tolérance périphérique aux composants de la peau et dans la régénération de la peau au cours des processus de cicatrisation. Cependant, les interactions entre les MCs et d'autres cellules immunitaires innées et adaptatives recrutées dans des conditions inflammatoires cutanées n'ont pas été élucidées en détail. Dans ce travail, nous décrivons l'utilisation d'une nouvelle souris possédant des MCs fluorescents (RMB), dans laquelle nous avons marqué les MCs FcεRI+ avec un marqueur fluorescent rouge tomato (TdT) et avec un système d'ablation conditionnelle basé sur l'expression concurrente du récepteur de la toxine diphtérique (DTR). Avec ces souris RMB, nous avons visualisé la dynamique des MCs et nous avons suivi les interactions entre les MCs et les lymphocytes T régulateurs (Tregs) après l'activation des MCs par l'IgE, dans une réaction inflammatoire typique de l'anaphylaxie cutanée passive (PCA). Dans un second volet d’étude, nous avons évalué le rôle des MCs lors d'un modèle expérimental de la greffe de peau de l'oreille, afin de révéler leur influence dans la cinétique de rejet ou prise de greffe du transplant. Nous avons constaté que 1) l'activation et la dégranulation des MCs induites par le pontage du récepteur FcεRI via des IgE couplées à un antigène multivalent sont les seules responsables de la réaction de PCA, et induisent le recrutement de Tregs ayant une grande motilité sur le site de l'inflammation. Nous avons constaté dans ces conditions, que les MCs restent immobiles, et que les Tregs établissent des contacts dynamiques avec les MCs dans le derme. 2) En outre, nous avons mis en place un modèle pour identifier les paramètres moléculaires de l'interaction MC-Treg et avons constaté que le complexe de l'antigène avec l'IgE peut être présenté aux Tregs en association avec les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II, permettant la formation des contacts stables MC-Treg. 3) En utilisant un modèle de transplantation de la peau in vivo, nous avons montré que l'ablation conditionnelle des MCs conduit à une accélération du rejet du greffon dans le cas d'une transplantation en présence d’une disparité d’antigènes d’histocompatibilité mineurs depuis une souris mâle sur une souris femelle. Nous avons également constaté un impact inattendu de l'ablation des MCs dans la greffe de peau en l’absence de disparité antigénique d'une souris femelle sur une souris femelle, conduisant à un rejet rapide. Les MCs semblent donc être essentiels pour la cicatrisation et la régénération tissulaire après greffe. (...) / The skin is a fascinating outpost of the immune system. It performs a barrier function between the outside environment and the inner body and is also a port of entry for pathogens against which the immune system mounts adapted responses. The skin innate immune defenses control pathogen invasion and perceive also direct physical and chemical environmental changes. Several component of the immune system such as dendritic cells (DC), macrophages (MΦ) and mast cells (MC) participate in initial pathogen clearance and in initiating adaptive memory responses, allowing rapid mobilization of effector T cells and secretion of B cellderived antibodies after secondary pathogen challenge. MCs residing in the dermis exert a determinant alert function through the liberation of various factors and are classically considered as effector cells in the IgE-mediated cutaneous allergic reaction. As emerging now, MC are also involved in immunoregulatory processes during the initiation of adaptive immune responses, the maintenance of peripheral tolerance to skin components and skin regeneration during wound healing. Yet, the crosstalks between MCs and other innate and adaptive immune cells recruited during cutaneous inflammatory conditions have not been elucidated in detail. Here, we report the use of a novel Mast cell fluorescent reporter mouse (RMB), in which we tagged FcεRI+ MCs, with red fluorescence marker tomato (Tdt) and with a conditional ablation system based on concurrent diphtheria toxin receptor (DTR) expression. Using these RMB mice, we visualized MC dynamics and monitored MC interactions with regulatory T lymphocytes (Tregs) after IgE-mediated activation of MCs, in a typical passive cutaneous anaphylaxis (PCA) inflammatory reaction. Using another setting, we further assessed the role of MC during experimental ear skin grafting to reveal their potential influence in skin grafting and rejection. We found that 1) the activation and degranulation of MCs induced by FcεRI crosslinking by multivalent IgE is solely responsible for the PCA reaction and induces the recruitment of highly motile regulatory T cells (Tregs) to the site of inflammation. In these conditions, we found that MC remain sessile and Tregs establish dynamic contacts with MC in the dermis. 2) Further we set up a model system to reveal the molecular requirement for MC-Treg interaction and found that antigen complexed with IgE were able to be presented to Treg in association with major histocompatibility complex class II molecules allowing the formation of stable MC-Treg contacts. 3) Using in vivo skin transplantation model, we showed that conditional ablation of MCs leads to an acceleration of skin transplant rejection in sex-mismatched model (male skin transplant to female). We also found an unexpected impact of MC conditional ablation in sex-matched skin graft (female skin transplant to female) leading to rapid rejection, implying that MCs are essential for the wound healing reaction and the regeneration of tissue continuity after grafting. The aforementioned results point out to an important immunoregulatory role of MC beyond their classically described activator functions in inflamed tissues. The fact that MC constantly interact with Treg during inflammatory processes suggest that MCs could participate in skin homeostasis by exerting tolerogenic functions. These functions remain to be elucidated at the molecular level as presented in the discussion.

La peau est un « avant poste » fascinant du système immunitaire. Elle forme une barrière entre l'environnement extérieur et l’organisme. Elle est aussi le point d'entrée pour les agents pathogènes, contre lesquels le système immunitaire organise des réponses adaptatives. Les acteurs de l'immunité innée de la peau contrôlent l'invasion des pathogènes et perçoivent également des changements environnementaux physiques et chimiques directs. Plusieurs composants du système immunitaire, tels que des cellules dendritiques (DCs), les macrophages (MΦ) et les mastocytes (MCs), participent à l'éradication des pathogènes et à l'initiation des réponses mémoires adaptatives. Ce qui permet une mobilisation rapide des cellules T effectrices ainsi que la sécrétion des anticorps par les cellules B à la suite d’une seconde exposition aux agents pathogènes. Les MCs qui sont des cellules résidentes du derme, jouent un rôle déterminant dans la libération de signaux d’alertes et sont classiquement considérés comme des cellules effectrices de la réaction allergique cutanée liée à l'IgE. Plusieurs observations récentes indiquent que les MCs seraient aussi impliqués dans les processus immunorégulateurs lors de l'initiation des réponses immunitaires adaptatives, dans le maintien de la tolérance périphérique aux composants de la peau et dans la régénération de la peau au cours des processus de cicatrisation. Cependant, les interactions entre les MCs et d'autres cellules immunitaires innées et adaptatives recrutées dans des conditions inflammatoires cutanées n'ont pas été élucidées en détail. Dans ce travail, nous décrivons l'utilisation d'une nouvelle souris possédant des MCs fluorescents (RMB), dans laquelle nous avons marqué les MCs FcεRI+ avec un marqueur fluorescent rouge tomato (TdT) et avec un système d'ablation conditionnelle basé sur l'expression concurrente du récepteur de la toxine diphtérique (DTR). Avec ces souris RMB, nous avons visualisé la dynamique des MCs et nous avons suivi les interactions entre les MCs et les lymphocytes T régulateurs (Tregs) après l'activation des MCs par l'IgE, dans une réaction inflammatoire typique de l'anaphylaxie cutanée passive (PCA). Dans un second volet d’étude, nous avons évalué le rôle des MCs lors d'un modèle expérimental de la greffe de peau de l'oreille, afin de révéler leur influence dans la cinétique de rejet ou prise de greffe du transplant. Nous avons constaté que 1) l'activation et la dégranulation des MCs induites par le pontage du récepteur FcεRI via des IgE couplées à un antigène multivalent sont les seules responsables de la réaction de PCA, et induisent le recrutement de Tregs ayant une grande motilité sur le site de l'inflammation. Nous avons constaté dans ces conditions, que les MCs restent immobiles, et que les Tregs établissent des contacts dynamiques avec les MCs dans le derme. 2) En outre, nous avons mis en place un modèle pour identifier les paramètres moléculaires de l'interaction MC-Treg et avons constaté que le complexe de l'antigène avec l'IgE peut être présenté aux Tregs en association avec les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II, permettant la formation des contacts stables MC-Treg. 3) En utilisant un modèle de transplantation de la peau in vivo, nous avons montré que l'ablation conditionnelle des MCs conduit à une accélération du rejet du greffon dans le cas d'une transplantation en présence d’une disparité d’antigènes d’histocompatibilité mineurs depuis une souris mâle sur une souris femelle. Nous avons également constaté un impact inattendu de l'ablation des MCs dans la greffe de peau en l’absence de disparité antigénique d'une souris femelle sur une souris femelle, conduisant à un rejet rapide. Les MCs semblent donc être essentiels pour la cicatrisation et la régénération tissulaire après greffe. (...) / The skin is a fascinating outpost of the immune system. It performs a barrier function between the outside environment and the inner body and is also a port of entry for pathogens against which the immune system mounts adapted responses. The skin innate immune defenses control pathogen invasion and perceive also direct physical and chemical environmental changes. Several component of the immune system such as dendritic cells (DC), macrophages (MΦ) and mast cells (MC) participate in initial pathogen clearance and in initiating adaptive memory responses, allowing rapid mobilization of effector T cells and secretion of B cellderived antibodies after secondary pathogen challenge. MCs residing in the dermis exert a determinant alert function through the liberation of various factors and are classically considered as effector cells in the IgE-mediated cutaneous allergic reaction. As emerging now, MC are also involved in immunoregulatory processes during the initiation of adaptive immune responses, the maintenance of peripheral tolerance to skin components and skin regeneration during wound healing. Yet, the crosstalks between MCs and other innate and adaptive immune cells recruited during cutaneous inflammatory conditions have not been elucidated in detail. Here, we report the use of a novel Mast cell fluorescent reporter mouse (RMB), in which we tagged FcεRI+ MCs, with red fluorescence marker tomato (Tdt) and with a conditional ablation system based on concurrent diphtheria toxin receptor (DTR) expression. Using these RMB mice, we visualized MC dynamics and monitored MC interactions with regulatory T lymphocytes (Tregs) after IgE-mediated activation of MCs, in a typical passive cutaneous anaphylaxis (PCA) inflammatory reaction. Using another setting, we further assessed the role of MC during experimental ear skin grafting to reveal their potential influence in skin grafting and rejection. We found that 1) the activation and degranulation of MCs induced by FcεRI crosslinking by multivalent IgE is solely responsible for the PCA reaction and induces the recruitment of highly motile regulatory T cells (Tregs) to the site of inflammation. In these conditions, we found that MC remain sessile and Tregs establish dynamic contacts with MC in the dermis. 2) Further we set up a model system to reveal the molecular requirement for MC-Treg interaction and found that antigen complexed with IgE were able to be presented to Treg in association with major histocompatibility complex class II molecules allowing the formation of stable MC-Treg contacts. 3) Using in vivo skin transplantation model, we showed that conditional ablation of MCs leads to an acceleration of skin transplant rejection in sex-mismatched model (male skin transplant to female). We also found an unexpected impact of MC conditional ablation in sex-matched skin graft (female skin transplant to female) leading to rapid rejection, implying that MCs are essential for the wound healing reaction and the regeneration of tissue continuity after grafting. The aforementioned results point out to an important immunoregulatory role of MC beyond their classically described activator functions in inflamed tissues. The fact that MC constantly interact with Treg during inflammatory processes suggest that MCs could participate in skin homeostasis by exerting tolerogenic functions. These functions remain to be elucidated at the molecular level as presented in the discussion.

La mastocytose est une maladie hétérogène, caractérisée par une accumulation de mastocytes dans l’organisme. Les enfants et les adultes ont des mutations différentes de c-Kit. Dans un premier travail, nous avons montré que seules les formes adultes sont associées à la réactivation de la télomérase, alors que les formes pédiatriques ne sont pas. Cela semble être lié aux différences de mutations de c-Kit observées entre adultes et enfants et pourrait expliquer pourquoi seules les formes pédiatriques de mastocytose régressent spontanément et non les formes adultes. Ces résultats aident à mieux comprendre la physiopathologie de la mastocytose. Dans un second travail, nous a étudié le lien entre la longueur des télomères et les troubles psychologiques des adultes atteints de mastocytose. Nous avons montré que réactions émotionnelles négatives sont corrélées au raccourcissement de la longueur des télomères des leucocytes et que l’érosion télomérique est fortement prédite par les défauts de régulation des émotions. Nous émettons l'hypothèse qu’au cours des troubles neuropsychologiques, le mastocyte pourrait être impliqué dans le raccourcissement de la longueur des télomères en périphérie. / Mastocytosis is a heterogeneous disease characterized by an accumulation of mast cells. Children and adults hold different c-Kit mutations. In a first work, we showed that only adult forms are associated with reactivation of telomerase whereas pediatric forms are not. This seems to be linked to the differential c-Kit mutations observed between adults and children and could explain why only pediatric mastocytosis spontaneously regress in comparison with adult forms. These results help to better elucidate the pathophysiology of mastocytosis. In a second work, we studied the link between the telomere length and the psychological features of adults with mastocytosis and showed that negative emotionality correlated negatively to telomere length and that telomere shortening was strongly predicted by emotion regulation deficits. We hypothesize that in psychological disorders, mast cell may represent the link between brain and periphery and induce telomere shortening.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-27Bitstream added on 2014-06-13T19:53:38Z : No. of bitstreams: 1 franzolin_sob_dr_botfm.pdf: 13568270 bytes, checksum: ab0d2603aa19ee4cc3e2bfe09256c8d8 (MD5) / A erupção dos dentes decíduos e permanentes é um processo fisiológico que acompanha o desenvolvimento do ser humano por aproximadamente duas décadas. Vários mecanismos biológicos controlam a odontogênese, erupção e esfoliação fisiológica dos decíduos até o estabelecimento dos dentes permanentes na arcada. A fim de elucidar aspectos anatômicos e fisiológicos relacionados à erupção dentária, sua sintomatologia e outros sinais clínicos, decidiu-se investigar a presença de mastócito nos tecidos pericoronários na fase intra-óssea (Grupo 1) e submucosa (Grupo 2), comparando-os entre si e com a mucosa bucal (Grupo3). Em cada grupo, 14 espécimes foram analisados microscopicamente em cortes corados com hematoxilina e eosina e imunocitoquimicamente marcados com ckit e triptase. A partir dos resultados obtidos concluiu-se que a quantidade/densidade dos mastócitos é diferente nos tecidos foliculares de acordo com a fase de erupção (P<0,05). Na fase intra-óssea da erupção, os tecidos conjuntivos foliculares não revelam pela imunocitoquimicamente uma marcante presença de mastócitos. Na fase submucosa, o número de mastócitos está significantemente elevado quando comparado com a fase intra-óssea da erupção dentária (P<0,05). Nos tecidos conjuntivos foliculares, na fase submucosa de erupção, os mastócitos aumentam sua concentração quando comparados à quantidade/densidade detectada na submucosa da mucosa bucal normal não relacionada aos dentes (P<0,05). / The eruption of deciduous and permanent teeth is a physiologic process that takes place during approximately two decades of human development. Several biological mechanisms control odontogenesis, eruption and physiological exfoliation of deciduous leading to the establishment of permanent teeth in the jaw. With the aim to investigate anatomical and physiological aspects related to eruption of tooth, symptoms and other clinical sign, it has been decided to investigate the presence of mastocytes in the pericoronary tissue in the intra-osteo (group 1) and submucous (group 2), inter comparing them and with the oral mucous (Group 3). In each group, 14 samples were microscopically analysed in slides stained with hematoxilin and eosin immunocytochemistry marked with ckit and triptase. Results showed that the quantity/density of mastocytes is different in the follicular tissues according to the eruption stage (P<0.05). Intra osteo stage of eruption, follicular conjuctive tissues have not shown immunecytochemistry marker for mastocyte. Follicular conjunctive tissues, in the follicular conjuctive tissues, in submucous eruption stage, mastocytes concentration was increased when compared to quantity, density in the submucous from normal oral mucous non related to teeth (P<0.05).

Resumo: A erupção dos dentes decíduos e permanentes é um processo fisiológico que acompanha o desenvolvimento do ser humano por aproximadamente duas décadas. Vários mecanismos biológicos controlam a odontogênese, erupção e esfoliação fisiológica dos decíduos até o estabelecimento dos dentes permanentes na arcada. A fim de elucidar aspectos anatômicos e fisiológicos relacionados à erupção dentária, sua sintomatologia e outros sinais clínicos, decidiu-se investigar a presença de mastócito nos tecidos pericoronários na fase intra-óssea (Grupo 1) e submucosa (Grupo 2), comparando-os entre si e com a mucosa bucal (Grupo3). Em cada grupo, 14 espécimes foram analisados microscopicamente em cortes corados com hematoxilina e eosina e imunocitoquimicamente marcados com ckit e triptase. A partir dos resultados obtidos concluiu-se que a quantidade/densidade dos mastócitos é diferente nos tecidos foliculares de acordo com a fase de erupção (P<0,05). Na fase intra-óssea da erupção, os tecidos conjuntivos foliculares não revelam pela imunocitoquimicamente uma marcante presença de mastócitos. Na fase submucosa, o número de mastócitos está significantemente elevado quando comparado com a fase intra-óssea da erupção dentária (P<0,05). Nos tecidos conjuntivos foliculares, na fase submucosa de erupção, os mastócitos aumentam sua concentração quando comparados à quantidade/densidade detectada na submucosa da mucosa bucal normal não relacionada aos dentes (P<0,05). / Abstract: The eruption of deciduous and permanent teeth is a physiologic process that takes place during approximately two decades of human development. Several biological mechanisms control odontogenesis, eruption and physiological exfoliation of deciduous leading to the establishment of permanent teeth in the jaw. With the aim to investigate anatomical and physiological aspects related to eruption of tooth, symptoms and other clinical sign, it has been decided to investigate the presence of mastocytes in the pericoronary tissue in the intra-osteo (group 1) and submucous (group 2), inter comparing them and with the oral mucous (Group 3). In each group, 14 samples were microscopically analysed in slides stained with hematoxilin and eosin immunocytochemistry marked with ckit and triptase. Results showed that the quantity/density of mastocytes is different in the follicular tissues according to the eruption stage (P<0.05). Intra osteo stage of eruption, follicular conjuctive tissues have not shown immunecytochemistry marker for mastocyte. Follicular conjunctive tissues, in the follicular conjuctive tissues, in submucous eruption stage, mastocytes concentration was increased when compared to quantity, density in the submucous from normal oral mucous non related to teeth (P<0.05). / Orientador: Maria Inês M. C. Pardini / Coorientador: Alberto Consolaro / Banca: Elenice Deffune / Banca: Hilton Coimbra Borgo / Banca: Leda A. Francischone / Mestre

La peau est un « avant poste » fascinant du système immunitaire. Elle forme une barrière entre l'environnement extérieur et l’organisme. Elle est aussi le point d'entrée pour les agents pathogènes, contre lesquels le système immunitaire organise des réponses adaptatives. Les acteurs de l'immunité innée de la peau contrôlent l'invasion des pathogènes et perçoivent également des changements environnementaux physiques et chimiques directs. Plusieurs composants du système immunitaire, tels que des cellules dendritiques (DCs), les macrophages (MΦ) et les mastocytes (MCs), participent à l'éradication des pathogènes et à l'initiation des réponses mémoires adaptatives. Ce qui permet une mobilisation rapide des cellules T effectrices ainsi que la sécrétion des anticorps par les cellules B à la suite d’une seconde exposition aux agents pathogènes. Les MCs qui sont des cellules résidentes du derme, jouent un rôle déterminant dans la libération de signaux d’alertes et sont classiquement considérés comme des cellules effectrices de la réaction allergique cutanée liée à l'IgE. Plusieurs observations récentes indiquent que les MCs seraient aussi impliqués dans les processus immunorégulateurs lors de l'initiation des réponses immunitaires adaptatives, dans le maintien de la tolérance périphérique aux composants de la peau et dans la régénération de la peau au cours des processus de cicatrisation. Cependant, les interactions entre les MCs et d'autres cellules immunitaires innées et adaptatives recrutées dans des conditions inflammatoires cutanées n'ont pas été élucidées en détail. Dans ce travail, nous décrivons l'utilisation d'une nouvelle souris possédant des MCs fluorescents (RMB), dans laquelle nous avons marqué les MCs FcεRI+ avec un marqueur fluorescent rouge tomato (TdT) et avec un système d'ablation conditionnelle basé sur l'expression concurrente du récepteur de la toxine diphtérique (DTR). Avec ces souris RMB, nous avons visualisé la dynamique des MCs et nous avons suivi les interactions entre les MCs et les lymphocytes T régulateurs (Tregs) après l'activation des MCs par l'IgE, dans une réaction inflammatoire typique de l'anaphylaxie cutanée passive (PCA). Dans un second volet d’étude, nous avons évalué le rôle des MCs lors d'un modèle expérimental de la greffe de peau de l'oreille, afin de révéler leur influence dans la cinétique de rejet ou prise de greffe du transplant. Nous avons constaté que 1) l'activation et la dégranulation des MCs induites par le pontage du récepteur FcεRI via des IgE couplées à un antigène multivalent sont les seules responsables de la réaction de PCA, et induisent le recrutement de Tregs ayant une grande motilité sur le site de l'inflammation. Nous avons constaté dans ces conditions, que les MCs restent immobiles, et que les Tregs établissent des contacts dynamiques avec les MCs dans le derme. 2) En outre, nous avons mis en place un modèle pour identifier les paramètres moléculaires de l'interaction MC-Treg et avons constaté que le complexe de l'antigène avec l'IgE peut être présenté aux Tregs en association avec les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II, permettant la formation des contacts stables MC-Treg. 3) En utilisant un modèle de transplantation de la peau in vivo, nous avons montré que l'ablation conditionnelle des MCs conduit à une accélération du rejet du greffon dans le cas d'une transplantation en présence d’une disparité d’antigènes d’histocompatibilité mineurs depuis une souris mâle sur une souris femelle. Nous avons également constaté un impact inattendu de l'ablation des MCs dans la greffe de peau en l’absence de disparité antigénique d'une souris femelle sur une souris femelle, conduisant à un rejet rapide. Les MCs semblent donc être essentiels pour la cicatrisation et la régénération tissulaire après greffe. (...) / The skin is a fascinating outpost of the immune system. It performs a barrier function between the outside environment and the inner body and is also a port of entry for pathogens against which the immune system mounts adapted responses. The skin innate immune defenses control pathogen invasion and perceive also direct physical and chemical environmental changes. Several component of the immune system such as dendritic cells (DC), macrophages (MΦ) and mast cells (MC) participate in initial pathogen clearance and in initiating adaptive memory responses, allowing rapid mobilization of effector T cells and secretion of B cellderived antibodies after secondary pathogen challenge. MCs residing in the dermis exert a determinant alert function through the liberation of various factors and are classically considered as effector cells in the IgE-mediated cutaneous allergic reaction. As emerging now, MC are also involved in immunoregulatory processes during the initiation of adaptive immune responses, the maintenance of peripheral tolerance to skin components and skin regeneration during wound healing. Yet, the crosstalks between MCs and other innate and adaptive immune cells recruited during cutaneous inflammatory conditions have not been elucidated in detail. Here, we report the use of a novel Mast cell fluorescent reporter mouse (RMB), in which we tagged FcεRI+ MCs, with red fluorescence marker tomato (Tdt) and with a conditional ablation system based on concurrent diphtheria toxin receptor (DTR) expression. Using these RMB mice, we visualized MC dynamics and monitored MC interactions with regulatory T lymphocytes (Tregs) after IgE-mediated activation of MCs, in a typical passive cutaneous anaphylaxis (PCA) inflammatory reaction. Using another setting, we further assessed the role of MC during experimental ear skin grafting to reveal their potential influence in skin grafting and rejection. We found that 1) the activation and degranulation of MCs induced by FcεRI crosslinking by multivalent IgE is solely responsible for the PCA reaction and induces the recruitment of highly motile regulatory T cells (Tregs) to the site of inflammation. In these conditions, we found that MC remain sessile and Tregs establish dynamic contacts with MC in the dermis. 2) Further we set up a model system to reveal the molecular requirement for MC-Treg interaction and found that antigen complexed with IgE were able to be presented to Treg in association with major histocompatibility complex class II molecules allowing the formation of stable MC-Treg contacts. 3) Using in vivo skin transplantation model, we showed that conditional ablation of MCs leads to an acceleration of skin transplant rejection in sex-mismatched model (male skin transplant to female). We also found an unexpected impact of MC conditional ablation in sex-matched skin graft (female skin transplant to female) leading to rapid rejection, implying that MCs are essential for the wound healing reaction and the regeneration of tissue continuity after grafting. The aforementioned results point out to an important immunoregulatory role of MC beyond their classically described activator functions in inflamed tissues. The fact that MC constantly interact with Treg during inflammatory processes suggest that MCs could participate in skin homeostasis by exerting tolerogenic functions. These functions remain to be elucidated at the molecular level as presented in the discussion.

Les mastocytes (MCs) sont issus des cellules hématopoïétiques multipotentes non engagées, CD34+, et jouent un rôle important dans l’initiation de la réponse immunitaire innée et adaptative, ainsi que dans les réactions allergiques IgE-dépendantes. Les mastocytoses sont des néoplasies myéloïdes caractérisées par une accumulation anormale et l'activation fréquente de mastocytes dans divers organes. Les organes généralement atteints sont la moelle osseuse, la peau, le foie et le tractus gastro-intestinal. Elles sont caractérisées dans l’immense majorité des cas par la présence de mutations acquises de la structure du récepteur KIT (plus particulièrement KIT D816V) qui induisent l’activation constitutive de ce récepteur à activité tyrosine kinase intrinsèque. Le traitement actuel de ces pathologies est décevant car la mutation KIT D816V résiste à la plupart des inhibiteurs de tyrosine kinases (ITKs).Dès le début de ma thèse, nous avons pu établir, à partir de cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon humain normal cultivées à long terme en présence de stem cell factor (SCF), une nouvelle lignée mastocytaire humaine stable, dénommée ROSA KIT WT, restant strictement dépendante pour sa survie et sa prolifération du SCF, exprimant le récepteur de haute affinité aux IgE (FcεRI), et présentant un récepteur KIT de structure normale. Cette lignée, facile à cultiver en grandes quantités, permet d’envisager l’étude approfondie des évènements intracellulaires menant à l’activation mastocytaire IgE-dépendante et la mise au point de tests de criblage à haut débit dans le domaine de la thérapeutique anti-allergique et/ou anti-inflammatoire.Par ailleurs, afin de pouvoir étudier le rôle transformant des mutants de KIT retrouvés au cours des mastocytoses, nous avons transfecté les cellules ROSA KIT WT par des vecteurs lentiviraux apportant une construction codant pour le KIT muté en D816V ou le KIT muté Delta 417-419 insY. Nous avons ainsi obtenu deux nouvelles lignées mastocytaires humaines SCF-indépendantes, ROSA KIT D816V et ROSA KIT Delta 417-419 insY, pour lesquelles nous avons montré qu’il existe une activation constitutive de KIT, mais aussi de STAT5 et d’AKT. Ces deux lignées de pourront être utilisées soit pour étudier l’impact des mutations de KIT sur la signalisation intracellulaire, soit pour le criblage molécules à activité antiproliférative potentielle dirigées soit contre KIT muté, soit contre l'une ou l’autre des molécules intracellulaires impliquées dans la transduction du signal KIT muté / Mast cells are cells with ubiquitous tissue distribution, derived from CD34 + multipotent hematopoietic cells. These cells play a fundamental role in the initiation of innate and adaptive immune response and in IgE-dependent allergic reactions or in various inflammatory reactions.Mastocytosis is defined as a myeloproliferative neoplastic disorder, caused by an abnormal accumulation of mast cells in one or more organ systems. Mastocytosis presents in cutaneous and systemic forms. In patients with systemic mastocytosis, the most frequent point mutation is KIT D816V, whereas in pediatric patients, where the disease is usually restricted to the skin, different KIT defects have been detected, mostly in the extracellular portion of KIT.In a primary culture of mast cells made from precursors of one cord blood, we have successfully isolated a new human mast cell line called ROSA KIT WT with a phenotype and reactivity comparable to those of normal mast cells. This cell line is dependent on SCF for growth and expresses the KIT receptor wild. It is easy to grow in large quantities, to freeze and to activate by IgE-anti IgE couple or a couple of allergen and corresponding specific IgE. This cell line can be used to study pathophysiologic mechanisms of allergy and to develop and use high-throughput screening tests of molecules in search of anti-allergic properties.In addition, we transfected these cells by lentiviral vectors providing constructs encoding the mutated KIT D816V or the mutated KIT Delta 417-419 insY, two KIT abnormalities encountered in the course of mastocytosis. This allowed us to establish two new cell lines independent of SCF for proliferation, ROSA KIT D816V and ROSA KIT Delta417-419 insY, which are particularly easy to grow in large quantities, and whose phenotype is similar to that of abnormal mast cells during mastocytosis. These two cell lines can be used for pathophysiologic studies on mastocytosis and for high throughput screening of molecules in search of antiproliferative effects specifically directed against the mutated KIT or against one or other of the intracellular molecules involved in signal transduction induced by mutant KIT.

Les mastocytes (MCs) sont issus des cellules hématopoïétiques multipotentes non engagées, CD34+, et jouent un rôle important dans l'initiation de la réponse immunitaire innée et adaptative, ainsi que dans les réactions allergiques IgE-dépendantes. Les mastocytoses sont des néoplasies myéloïdes caractérisées par une accumulation anormale et l'activation fréquente de mastocytes dans divers organes. Les organes généralement atteints sont la moelle osseuse, la peau, le foie et le tractus gastro-intestinal. Elles sont caractérisées dans l'immense majorité des cas par la présence de mutations acquises de la structure du récepteur KIT (plus particulièrement KIT D816V) qui induisent l'activation constitutive de ce récepteur à activité tyrosine kinase intrinsèque. Le traitement actuel de ces pathologies est décevant car la mutation KIT D816V résiste à la plupart des inhibiteurs de tyrosine kinases (ITKs).Dès le début de ma thèse, nous avons pu établir, à partir de cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon humain normal cultivées à long terme en présence de stem cell factor (SCF), une nouvelle lignée mastocytaire humaine stable, dénommée ROSA KIT WT, restant strictement dépendante pour sa survie et sa prolifération du SCF, exprimant le récepteur de haute affinité aux IgE (FcεRI), et présentant un récepteur KIT de structure normale. Cette lignée, facile à cultiver en grandes quantités, permet d'envisager l'étude approfondie des évènements intracellulaires menant à l'activation mastocytaire IgE-dépendante et la mise au point de tests de criblage à haut débit dans le domaine de la thérapeutique anti-allergique et/ou anti-inflammatoire.Par ailleurs, afin de pouvoir étudier le rôle transformant des mutants de KIT retrouvés au cours des mastocytoses, nous avons transfecté les cellules ROSA KIT WT par des vecteurs lentiviraux apportant une construction codant pour le KIT muté en D816V ou le KIT muté Delta 417-419 insY. Nous avons ainsi obtenu deux nouvelles lignées mastocytaires humaines SCF-indépendantes, ROSA KIT D816V et ROSA KIT Delta 417-419 insY, pour lesquelles nous avons montré qu'il existe une activation constitutive de KIT, mais aussi de STAT5 et d'AKT. Ces deux lignées de pourront être utilisées soit pour étudier l'impact des mutations de KIT sur la signalisation intracellulaire, soit pour le criblage molécules à activité antiproliférative potentielle dirigées soit contre KIT muté, soit contre l'une ou l'autre des molécules intracellulaires impliquées dans la transduction du signal KIT muté

Les mastocytes sont des cellules immunitaires présentes dans tous les tissus de l'organisme. Ils ont été depuis longtemps associés aux réponses allergiques, mais ces cellules sont aussi des acteurs majeurs de la réponse inflammatoire. La dégranulation des mastocytes, ou exocytose des granules sécrétoires, est un mécanisme d'action important de ces cellules. Au laboratoire, nous avons mis au point une méthode innovante qui nous permet de suivre en temps réel la dynamique de cette dégranulation. Cette méthode repose sur l'utilisation de l'avidine couplé à un fluorochrome qui se lie spécifiquement à la matrice des granules. Nous avons recherché les modalités de la dégranulation lorsque les mastocytes sont activés par un ligand cellulaire comme des cellules cibles recouvertes d'anticorps. Nous avons pu mettre en évidence, de façon surprenante, que les mastocytes dégranulent de manière polarisée contre une cellule cible opsonisée avec des anticorps de type IgE ou IgG en mettant en place un nouveau mécanisme que nous avons nommé ADDS (Antibody Dependent Degranulatory Synapse). L'ADDS est caractérisée par une signalisation du récepteur RFc et une dépolymérisation du cytosquelette cortical d'actine locales. De plus, cette synapse peut aussi avoir lieu lorsque le mastocyte est au contact d'un parasite opsonisé comme Toxoplasma Gondii, et induit la mort du parasite et la libération de cytokines et chimiokines pro-inflammatoires. Nous avons ensuite analysé la dynamique de la dégranulation à l'échelle " single cell " et sa régulation par des facteurs inflammatoires. Grâce à une approche de " cell barcoding " et de cytométrie en flux en temps réel, nous avons pu mettre en évidence que la dégranulation induite par l'agrégation des RFc?I était contrôlée par deux mécanismes : un premier qui règle le nombre de mastocytes qui dégranulent et un second qui régule l'intensité de la dégranulation. L'interleukine 33 peut finement potentialiser ces deux mécanismes en augmentant le pourcentage de mastocytes qui dégranulent et l'intensité de la dégranulation. L'IL-33 induit ainsi l'émergence de cellules hautement inflammatoires. Dans un second axe de recherche, nous avons étudié quel pouvait être l'impact des prostaglandines dans le dialogue entre mastocytes et lymphocytes T CD4+ Helper (TH). Nos résultats indiquent un rôle insoupçonné de la prostaglandine D2 et la prostaglandine E2 comme des acteurs importants pour la production d'interleukine 17 par les LTH. En conclusion, mon travail de thèse nous a permis de révéler l'existence de la synapse dégranulatoire des mastocytes, de nouveaux mécanismes contrôlant la dégranulation et d'identifier les mastocytes comme une source importante de prostaglandines impliquées dans la polarisation des LTH. / Mast cells are tissue-resident immune cells particularly enriched in regions exposed to the external environment. They have been associated, for a long time, with allergic disorders but these cells are also major effectors of inflammatory response. The degranulation process, or granule exocytosis, is one of the main effector functions of mast cells and it has been implicated in various biological processes. In our laboratory, we have developed a new method to monitor live mast cell degranulatory response. This approach is based on fluorescent avidin that binds selectively mast cell granule matrix. Thanks to this method, we have investigated the degranulatory response following mast cell activation by cell bound antigens. We have shown that mast cells can undergo polarized degranulation toward IgE- or IgG-opsonized cells in a new mechanism we named ADDS (Antibody Dependent Degranulatory Synapse). The ADDS is characterized by a local signaling of FcR receptors and cortical actin depolymerisation. Moreover, this synapse takes place when mast cells are triggered by opsonized parasite Toxoplasma Gondii. It leads to the death of the parasite and the release of pro-inflammatory cytokines and chemokines. We next analyzed the mast cell degranulatory response dynamics at the single cell level and its regulation by alarmin IL-33. Using cutting-edge "cell barcoding" approach and live flow cytometry, we showed that Fc?RI mediated degranulatory response is controlled by two mechanisms: a first one that sets the frequency of degranulated mast cells and a second one that regulates the magnitude of the degranulation. The IL-33 fine tunes these two mechanisms by augmenting both the frequency of degranulated mast cells and the extent of individual mast cell degranulation. Our results indicate that interleukin 33 induces the emergence of high inflammatory mast cells. In a second axis of research, we analysed the influence of prostaglandins during the cooperation between mast cells and CD4+ T helper cells. Our results indicate that prostaglandin D2 and E2 produced by mast cells are important inducers of interleukin 17 by CD4+ T helper cells. Taken together, my thesis work revealed that mast cells can form degranulatory synapses, new mechanisms that control the degranulatory response and identified mast cells as a source of pro-IL-17 prostaglandins during their cooperation with CD4+ T helper cells.