La dyskératose congénitale (DC) est une pathologie principalement caractérisée par une triade de phénotypes mucocutanés. Bien que les symptômes mucocutanés soit présents chez la majorité des sujets atteints, une multitude d'autres désordres qui varient d'un individu à l'autre peuvent également être observés. D'après la fonction des six gènes contenant des mutations associées à la DC identifiées à ce jour, il est considéré que la pathologie et les désordres qu'elle peut engendrer sont principalement causés par un défaut dans la biologie des télomères qui constituent les extrémités des chromosomes chez les eucaryotes. Cinq des six gènes identifiés codent pour des composantes de la télomérase (TERT, TERC, dyskérine, NOP10 et NHP2), une ribonucléoprotéine responsable du maintien de la longueur des télomères. La composante ARN de la télomérase (TERC, aussi nommé hTR pour «human telomerase RNA»), et les protéines dyskérine, NOP10 et NHP2 ont cependant un autre lien qui les unit. Chez les vertébrés, la moitié 3’ de l'ARN de la télomérase adopte une structure similaire aux petits ARN nucléolaires (snoRNA) et aux petits ARN des corps de Cajal (scaRNA) de la famille H/ACA. Il y a des évidences que la dyskérine (une pseudouridyne synthase), NOP10, NHP2 et le facteur d'assemblage nucléaire 1 (NAF1) forment un tétramère protéique qui est assemblé avec les transcrits H/ACA naissants de façon co-transcriptionelle pour former des ribonucléoprotéines H/ACA précoces (pré-RNP) non-fonctionnelles. Suite à leurs maturations selon un mécanisme encore inconnu, ces particules sont principalement impliquées dans la pseudouridylation d'ARN ribosomique précurseurs (pré-rRNA) et de petits ARN nucléaires (snRNA) du spliceosome. Bien qu'aucune cible de pseudouridylation n'ait été découverte pour hTR, son domaine H/ACA est essentiel à son accumulation in vivo. Nous avons tout d'abord mis au point un système in vitro de reconstitution et d'analyse de pré-RNP H/ACA. Ce système nous a permis d'analyser l'effet de mutations localisées dans le domaine H/ACA de hTR, dont certaines sont associées à la DC, ainsi que des mutations reliées à la DC qui sont localisées dans les protéines dyskérine, NHP2 et NOP10, sur la formation de pré-RNP H/ACA. Nous démontrons que NAF1 requiert la présence du trimère dyskérine-NOP10-NHP2 afin d'être efficacement incorporé aux pré-RNP H/ACA en général, à l'exception de U17, le seul ARN H/ACA impliqué dans le clivage d'ARN ribosomique (rRNA). Nous démontrons que la mutation C408G et la délétion Δ378-451 associées à la DC dans le domaine H/ACA de hTR, ainsi que des mutations des boîtes H et ACA abrogent la formation de pré-RNP, ce qui engendre probablement la dégradation des transcrits de hTR non assemblés in vivo. Nous mettons également en évidence un défaut d'assemblage spécifique du domaine H/ACA de hTR en pré-RNP causé par la mutation la plus prévalente dans la dyskérine (A353V). Les mutations V126M et Y139H dans NHP2 causent quant à elles, une perte d'association entre NHP2 et NOP10, ce qui engendre par conséquent l'abrogation de la formation de pré-RNP avec le domaine H/ACA de hTR ainsi qu'avec les autres ARN H/ACA en général. La mutation R34W dans NOP10 n'a aucun effet sur l'assemblage du tétramère protéique, mais abroge également l'assemblage de pré-RNP avec le domaine H/ACA de hTR et les autres ARN H/ACA en général à l’exception de ceux qui encodent des miRNA. Ces résultats indiquent qu'en plus d'affecter la biogenèse de hTR, la biogenèse de différentes populations de RNP H/ACA pourraient êtres affectées par des mutations dans la dyskérine, NHP2 ou NOP10. Ceci suggère que certains désordres de la DC pourraient êtres engendrés via les voies de biogenèse des rRNA, des snRNA, et même de certains miRNA chez des individus hébergeant certaines mutations dans ces trois protéines. Nous démontrons finalement par 3’ RLM-RACE que certains transcrits de hTR qui sont presque entièrement matures à l'extrémité 3’ sont assujettis à une oligoadénylation in vivo. Les bases moléculaires et les implications d'une telle oligoadénylation demeurent cependant inconnues. Il pourrait s'agir d'un élément requis pour la maturation finale de l'extrémité de hTR, ou bien d'un signal de dégradation de transcrits inadéquatement maturés. Nos résultats de 3’ RLM-RACE suggèrent également la présence d'élément(s) nécessaire(s) à une maturation efficace de l'extrémité 3’ de hTR localisé(s) en aval de 500 pb dans la séquence 3’ flanquante de hTR dans le génome. Enfin, des transcrits matures de hTR dont la boîte ACA fut mutée ne purent être observés par RLM-RACE, ce qui supporte l'hypothèse qu'en absence de formation de pré-RNP, les transcrits H/ACA naissants sont rapidement dégradés in vivo. Finalement notre système in vitro de reconstitution et d'analyse de pré-RNP H/ACA rend maintenant possible le criblage de petites molécules qui auraient comme effet de restaurer la formation de pré-RNP H/ACA qui affectées par les mutations reliées à la DC dans le domaine H/ACA de hTR et dans les protéines dyskérine, NOP10 et NHP2. Cela permettrait d'aboutir à une thérapie personnalisée afin de traiter des sujets atteints de DC. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Dyskératose congénitale, Télomérase, ribonucléoprotéines H/ACA, hTR, ARN H/ACA

Les télomères, une structure spécialisée retrouvée à l'extrémité des chromosomes, protègent le matériel génétique et permettent, entre autres, la réplication complète du génome. Par ses fonctions essentielles, le télomère est protégé par un capuchon composé de différentes protéines ayant chacune un rôle particulier à jouer. Parmi ces protéines se retrouve Cdc13p, une protéine essentielle, se liant à la toute fin du télomère. Cdc13p protège le télomère contre la dégradation par des exonucléases. Il est connu qu'en absence de Cdc13p, la cellule va subir une dégradation du brin télomérique C-riche, engendrant une accumulation d'ADN simple brin. Par contre, il n'est pas encore connu si cette dégradation est associée à une phase particulière du cycle cellulaire ou si elle se déroule tout-au-long de celui-ci. Pour répondre à cette interrogation, une analyse de l'accumulation d'ADN simple brin au télomère en fonction du cycle cellulaire a été effectuée à l'aide d'un allèle thermosensible du gène CDC13, l'allèle cdc13-1 [exposant] ts, en conditions restrictives. Les résultats obtenus suggèrent que la dégradation engendrée par la perte de fonction de protection de la protéine Cdc13p nécessite un premier passage dans la phase S du cycle cellulaire et qu'elle s'effectue lors du passage en phase G2/M. En parallèle, une vérification de la présence de la protéine Cdc13-1p en comparaison à Cdc13p, à température restrictive, a été effectuée par immunobuvardage de type Western afin de s'assurer que les phénotypes observés étaient réellement attribuable à une perte de fonction de la protéine et non à une dégradation de celle-ci via le système de contrôle de qualité associé à la protéine San1p. En plus de protéger le télomère, Cdc13p participe aussi au recrutement de la télomérase, l'enzyme responsable de la synthèse des télomères chez les eucaryotes. Cette ribonucléoprotéine est composée d'une transcriptase inverse, Est2p, de protéines accessoires et d'une composante ARN, TLC1 chez la levure, qui dicte l'ajout de séquence nucléotidique télomérique. Des recherches ont démontré que la liaison de l'ARN de la télomérase à l'holoenzyme ne nécessite pas une séquence spécifique, mais plutôt une structure particulière dans l'ARN. Plus particulièrement, la présence d'un pseudonoeud dans la région de liaison à Est2p a dernièrement été suggérée chez Saccharomyces cervisiae. Sachant que la présence d'une telle structure a aussi été suggérée chez d'autres organismes, tel Tetrahymena thermophila et l'humain, et qu'elle s'avère normalement nécessaire à l'obtention d'activité télomérase, il a été hypothétisé qu'elle pourrait être commune à tous les ARNs de la télomérase. Dès lors, des études biochimiques et structurales à l'aide de différentes constructions ont été entreprises afin de tenter de déterminer la présence ainsi que la structure d'un potentiel pseudonoeud dans l'ARN TLC1. Bien que les résultats obtenus ne puissent prouver directement la présence d'une telle structure chez TLC1, ils tendent tous à démontrer sa présence. De plus, un profil télomérique caractéristique d'un survivant de type I a été observé pour une souche de levure ¨rad52[delta], suggérant l'existence d'une voie, permettant à une cellule de devenir un survivant, indépendante de la protéine Rad52p. Cette situation avait, jusqu'à présent, seulement été observée en absence de la protéine Exo1p, la principale exonucléase active au télomère.

Les extrémités des chromosomes eucaryotes, appelées les télomères, sont composées de protéines et de courtes séquences de nucléotides répétées en tandem. Chez la majorité des organismes, le brin d'ADN se terminant à l'extrémité du chromosome en 3' est un brin contenant plusieurs bases guanine (G-riche), alors que le brin complémentaire est toujours le brin riche en cytosine. Un des rôles importants que jouent les télomères dans la cellule est qu'ils protègent les chromosomes contre la dégradation et les évènements de fusion des extrémités des chromosomes. Dans le but d'identifier des facteurs importants dans le maintien des télomères, nous avons tout d'abord identifié un complexe protéique s'associant aux télomères de la levure Saccharomyces cerevisiae, appelé yKu70 et yKu80. Cet hétérodimère était connu comme étant un joueur important pour la réparation des cassures d'ADN double-brin (db) via un mécanisme de réparation par jonction d'extrémités d'ADN non-homologues (NHEJ). La présence du complexe yKu aux télomères est surprenante du fait qu'il doit jouer un rôle antagoniste aux extrémités des chromosomes (empêcher les fusions télomère-télomère) par rapport aux cassures d'ADN db (permettre la fusion des bouts d'ADN sectionnés). De plus, nous avons démontré que le complexe yKu est important pour protéger la structure normale des télomères. En effet, les télomères des souches mutantes possèdent de longues extensions 3' télomériques. Par ailleurs, il avait été démontré que les télomères de levure acquièrent de longues extensions 3' simple-brin (sb) de plus de 25 bases à la fin de la phase S. Cependant, pour le reste du cycle cellulaire, la structure terminale n'était pas connue. Nous avons démontré dans un deuxième manuscrit que la levure possède des extensions 3' télomériques à l'extérieur de la phase S, soit en phase G 1 du cycle cellulaire. Ces extensions du brin G-riche ont une taille de 12 à 14 bases pour des cellules de type sauvage (Wt). De plus, nous avons démontré que le complexe Mre11/Rad50/Xrs2 est important pour former et/ou maintenir ces extensions. En effet, une délétion de l'un ou l'autre de ces gènes provoque une structure terminale différente par rapport à des cellules Wt. Ces mutants ont de courtes extensions 3' télomériques, la majorité étant moins de 8 bases, suggérant que ce complexe est important mais pas essentiel pour créer une structure terminale normale. En absence de la télomérase, un faible pourcentage des cellules réussissent à survivre après 50-80 générations, préservant alors leurs séquences télomériques par des mécanismes de recombinaison. Deux types de survivants ont été décrits, soit les survivants de type I et de type II. Nous avons démontré que les deux types de survivants possèdent des cercles d'ADN extra-chromosomiques différents : les survivants de type I possèdent majoritairement des cercles d'ADN db contenant une ou deux répétitions de l'élément sous-télomérique Y', alors que les survivants de type II possèdent des cercles d'ADN partiellement sb du brin G-riche. Ces cercles d'ADN extra-chromosomiques pourraient servir de réservoir afin de maintenir les télomères par des mécanismes de recombinaison. Nous avons aussi démontré que des cellules qui maintiennent alternativement leurs télomères peuvent survivre en absence de Cdc13p, une protéine normalement essentielle chez la levure et qui joue un rôle de protection aux télomères. Ces survivants indépendants de Cdc13p possèdent des cercles d'ADN extra-chromosomiques, démontrent des extrémités anormales des chromosomes et semblent avoir un système de surveillance ("checkpoint") aboli. Cependant, la réintroduction de Cdc13p dans ces cellules renverse certains phénotypes, suggérant ainsi que les cellules se sont adaptées à l'absence d'une protection conventionnelle des télomères et que Cdc13p aurait un rôle important à jouer au niveau d'un mécanisme"anti-checkpoint" aux extrémités des chromosomes.

Des cellules de levures dont les chromosomes se finissent par des répétitions télomériques humaines, peuvent être conçues en remplaçant simplement la séquence matrice ARN originale de la télomérase (TLC1) par une séquence matrice humaine (tlc1h). Dans ces levures dites « humanisées », les télomères sont courts mais stables avec une extension télomérique humaine 3' simple brin. Néanmoins, ces séquences humaines inhabituelles au niveau des télomères de Saccharomyces cerevisiae engendrent différentes réponses cellulaires. Après la substitution initiale de la séquence matrice de TLC1, les répétitions télomériques levures sont graduellement remplacées par les répétitions humaines qui sont reconnues comme un dommage par la cellule : la protéine Rad53p est phosphorylée. Cette activation de Rad53p est synonyme d'activation des points de contrôle du cycle cellulaire et en effet un délai en phase G2/M du cycle cellulaire est observé. L'accumulation en G2/M augmente avec le degré d'humanisation des télomères, et le phénotype terminal observé aux générations les plus avancées est un réarrangement chromosomique suite aux fusions entre télomères. La réintroduction d'une copie originale de TLC1 comme unique matrice ARN dans une levure qui était précédemment humanisée montrerait que le bloc télomérique humain distal, et plus précisément le simple brin télomérique humain T[indice inférieur 2]AG[indice inférieur 3], serait le signal responsable de la phosphorylation de Rad53p, tandis qu'un bloc [T[indice inférieur 2]AG[indice inférieur 3]/C[indice inférieur 3]TA[indice inférieur 2]] à un site interne ne déclenche ni l'activation de Rad53p, ni les points de contrôle du cycle cellulaire. Tandis que les phénotypes associés à l'activation des points de contrôles du cycle cellulaire n'apparaissent seulement qu'aux générations avancées, la télomérase devient essentielle aussitôt que la cellule de levure contient tlc1h comme matrice ARN unique. L'abolition de l'expression de tlc1h ou l'expression d'un mutant catalytique de la télomérase mène à une perte immédiate de la viabilité sans sénescence. Cela suggère une augmentation dramatique de la fréquence des évènements de raccourcissements critiques des télomères qui doivent être surmontés par une télomérase active. Nous nous sommes dès lors demandé si les répétitions télomériques humaines causaient des problèmes pour la machinerie de réplication de l'ADN chez la levure. En effet, les analyses de gel à deux dimensions ont révélé des intermédiaires de réplication non conventionnels indiquant qu'un télomère humanisé cause une pause au niveau de la fourche de réplication. En accord avec cette observation, la mutation de certains gènes impliqués dans la stabilité ou la progression des fourches cause une augmentation de la sensibilité des levures humanisées aux agents endommageant l'ADN. Ces derniers résultats expliqueraient le rôle obligatoire de la télomérase chez la levure humanisée qui viendrait compenser la perte des répétitions télomériques suite à la pause voire l'écroulement de la fourche de réplication.

La télomérase est une ribonucléoprotéine, constituée d’un composant ARN (hTR) qui sert dematrice à l’addition des séquences télomériques aux extrémités des chromosomes et d’un composantprotéique catalytique à activité de transcriptase inverse (hTERT). La réactivation de la télomérasedans 90% des cancers compense le raccourcissement des télomères, permettant ainsil’immortalisation et la survie des cellules tumorales. Ce rôle canonique de la télomérase estaujourd’hui bien documenté. Cependant des travaux récents suggèrent que la télomérase pourraitavoir d'autres fonctions indépendantes de son rôle sur le maintien de la longueur des télomères dansla tumorigénèse et/ou la progression tumorale.Dans les neuroblastomes (NB), l’augmentation du niveau d’activité télomérase (AT) estassociée à un stade avancé de la maladie et à un mauvais pronostic. En effet, plusieurs études ontmontré que les neuroblastomes agressifs ont un niveau élevé d’AT alors que les tumeurs de bonpronostic, ont peu ou pas d’AT. En effet, les NB de stade 4S ayant la capacité de régresserspontanément ont un très faible niveau d'AT. Ces observations suggèrent que la télomérase peutjouer un rôle crucial dans le développement des NB.Afin de mieux comprendre l’implication de la télomérase dans le phénotype agressif desneuroblastes malins et dans la chimiorésistance, nous avons caractérisé les modificationsphénotypiques et génotypiques induites par l’inhibition de la télomérase via l’expression ectopiqued’un mutant dominant négatif catalytiquement inactif (DN-hTERT) dans la lignée IGR-N-91 induit unedifférenciation cellulaire de type stromale et une sensibilisation à l’apoptose en réponse à trois agentscytotoxiques (cisplatine, staurosporine, TRAIL). Cette chimiosensibilisation n’est pas la conséquenced’un raccourcissement des télomères mais probablement celui d’une modulation de l’expression decertains gènes impliqués dans la réponse apoptotique (ré-expression de la caspase 8 et de p53sauvage), suggérant une fonction non canonique de la télomérase. De plus, nous avons montréqu’hTERT régule activement l’expression de N-Myc. En effet, l’expression ectopique du mutanthTERT-DN entraîne une perte des copies surnuméraires de N-Myc conduisant à l’extinction del'expression de la protéine alors que la surexpression d’hTERT sauvage augmente au contraire lenombre de copies du gène. Cette élimination de la protéine N-Myc pourrait être le signe d’une pertedu caractère agressif des cellules tumorales comme en témoigne la diminution de l’expression de laNSE (marqueur de mauvais pronostique des NB) et l’induction du CD44 dans les cellules hTERT-DN.L’ensemble de nos résultats démontre donc un nouveau rôle majeur de la télomérase,indépendant de sa fonction canonique d’élongation des télomères, dans l’acquisition du phénotypemalin et dans la chimiorésistance des NB. Ces résultats sont importants en termes de connaissancede la biologie du NB et des possibilités thérapeutiques. En effet, ces résultats suggèrent quel’inhibition de la télomérase comme stratégie anti-cancéreuse est une approche qui présente un intérêttout particulier dans les cas de NB de stade 4 dans lesquels le taux de survie des patients reste trèsinsuffisant malgré les thérapeutiques les plus intensives. / Telomerase is a ribonucleoprotein consisting of an RNA component (hTR) that serves as atemplate for the addition of telomeric sequences at the ends of chromosomes and a proteincomponent catalytic activity of reverse transcriptase (hTERT). The reactivation of telomerase in 90%of cancers compensates the shortening of telomeres, allowing the immortalization and survival oftumor cells. This canonical role of telomerase is now well documented. However recent studiessuggest that telomerase may have other functions beyond its role in maintaining telomere length intumorigenesis and / or tumor progression.In neuroblastoma (NB), increased levels of telomerase activity (TA) is associated withadvanced disease and poor prognosis. Indeed, several studies have shown that aggressiveneuroblastomas have a high level of TA while favourable tumors, have little or no TA. Therefore, lowtelomerase activity appears to be linked with regression or maturation of NB as it can be seen in theparticular group of 4S stage neuroblastoma. These observations suggest that telomerase may play acrucial role in the development of NB.To better understand the involvement of telomerase in the aggressive phenotype of malignantneuroblasts and drug resistance, we characterized the phenotypic and genotypic changes induced byinhibition of telomerase via ectopic expression of a mutant dominant negative catalytically inactive(DN-hTERT) in a metastatic chemoresistant NB cell line IGR-N-9. Our results show that theexpression of this mutant induces a stromal-type cell differentiation a sensitization to apoptosis inresponse to three cytotoxic agents (cisplatin, staurosporine, TRAIL). The chemosensitization is not theresult of telomere shortening but probably f a modulation of the expression of certain genes involved inthe apoptotic response (re-expression of caspase 8 and wild-type p53), suggesting a noncanonicalfunction of telomerase Furthermore, we showed that hTERT actively regulates the expression ofMYCN. Indeed, ectopic expression of the inactive mutant causes a loss of supernumerary copies ofMYCN leads to the extinction of the expression of the protein, whereas overexpression of wild hTERTincreases the number of copies of the MYCN gene. The elimination of MYCN protein could be a signof a loss of the aggressiveness of the tumor cells as evidenced by the decreased expression of NSE(a marker of poor prognosis of NB) and induction of CD44 in DN-hTERT cells.Overall, our findings thus demonstrate a new role of telomerase independent of its canonicalfunction of telomere elongation in the acquisition of the malignant phenotype and drug resistance inNB. These results are important in terms of knowledge of the biology of NB and therapeuticpossibilities. Indeed, our data suggest that inhibition of telomerase as an anticancer strategy is anapproach that has a particular interest in cases of stage 4 NB in which the survival rate of patientsremains very inadequate despite the therapeutic more intensive.

La mastocytose est une maladie hétérogène, caractérisée par une accumulation de mastocytes dans l'organisme. Les enfants et les adultes ont des mutations différentes de c-Kit. Dans un premier travail, nous avons montré que seules les formes adultes sont associées à la réactivation de la télomérase, alors que les formes pédiatriques ne sont pas. Cela semble être lié aux différences de mutations de c-Kit observées entre adultes et enfants et pourrait expliquer pourquoi seules les formes pédiatriques de mastocytose régressent spontanément et non les formes adultes. Ces résultats aident à mieux comprendre la physiopathologie de la mastocytose. Dans un second travail, nous a étudié le lien entre la longueur des télomères et les troubles psychologiques des adultes atteints de mastocytose. Nous avons montré que réactions émotionnelles négatives sont corrélées au raccourcissement de la longueur des télomères des leucocytes et que l'érosion télomérique est fortement prédite par les défauts de régulation des émotions. Nous émettons l'hypothèse qu'au cours des troubles neuropsychologiques, le mastocyte pourrait être impliqué dans le raccourcissement de la longueur des télomères en périphérie.

Les télomères sont des structures nucléoprotéiques formées de séquences d’ADN répétées associées à des protéines spécialisées assurant la protection des extrémités des chromosomes eucaryotes et leur réplication complète. La télomérase est une ribonucléoprotéine catalysant l’ajout de répétitions télomérique pour contrer la perte de séquences inhérente à la réplication des extrémités des chromosomes linéaires. Plusieurs facteurs jouent des rôles importants dans le maintien de l’intégrité des télomères. Le champ d’étude de la biologie des télomères est toujours en expansion, étant donné les liens étroits entre les télomères, le cancer et le vieillissement. Les travaux présentés dans cette Thèse se divisent en trois parties. Les deux premières utilisent la levure Saccharomyces cerevisiae pour explorer les liens entre le complexe Smc5/6 et le maintien des télomères, ainsi que les mécanismes de terminaison de transcription de la composante ARN de la télomérase (T1c1). La troisième partie est une étude épidémiologique préliminaire examinant la taille des télomères de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (PR). Premièrement, les protéines SMC (structural maintenance of chromosomes) forment 3 complexes conservés requis pour la transmission des chromosomes lors des divisions cellulaires. Le complexe Smc5/6 a été impliqué dans la réparation de l’ADN et le maintien des télomères. Les rôles des complexes SMC, en particulier Smc5/6, dans la biologie des télomères ont donc été investigués. Les résultats montrent que les complexes SMC sont importants pour la survie pendant la sénescence en absence de télomérase. Les données obtenues pour Smc5/6 supportent un modèle dans lequel le complexe est requis pour la réplication complète et la réparation adéquate des chromosomes. De fréquentes cassures d’ADN au niveau des répétitions télomériques sont observées en absence du complexe, illustrant l’importance particulière de Smc5/6 pour la séparation des régions télomériques. Deuxièmement, il est établi que l’abondance de la télomérase est critique pour l’homéostasie des télomères. Mais le contrôle de l’expression de l’ARN T1c1 est encore obscur. L’analyse des séquences en 3' du gène TLC1 révèle des signaux reconnus par les 2 voies de terminaison de transcription par l’ARN polymérase II. Les résultats indiquent que la formation de T1c1 est contrôlée par la voie de terminaison des petits ARNs noncodants Nrd1/Nab3. T1c1 existe sous 2 formes, une majeure, non polyadénylée, présente dans la télomérase active, et une mineure, polyadénylée, dont le rôle est inconnu. Les données montrent que la synThèse et la fonction de l’ARN T1c1 mature ne nécessitent pas la forme polyA+ comme précurseur. La terminaison dépendante de la polyadénylation pourrait être un mécanisme de sûreté pour arrêter la transcription. Troisièmement, plusieurs maladies sont associées à des défauts dans le maintien des télomères. La PR est une maladie auto-immune causant une inflammation chronique et une destruction graduelle des articulations. Des études suggèrent que les lymphocytes de patients atteints de PR auraient des télomères anormalement courts. Ensuite, des marqueurs pronostiques fiables identifiant les patients qui développeront une arthrite persistante et sévère font actuellement défaut, mais seraient utiles afin d’élaborer des traitements plus efficaces. Une étude épidémiologique a donc été amorcée pour analyser l’érosion des télomères des lymphocytes dans une cohorte de patients avec arthrite débutante et évaluer de potentielles corrélations avec la progression et la sévérité de la maladie. Les résultats préliminaires obtenus par 3 techniques de mesure de la taille des télomères (TRF, STELA et qPCR) sont incomplets, mais semblent indiquer un défaut dans le maintien des télomères chez les patients. Les observations illustrent aussi les limites des études épidémiologiques longitudinales analysant la taille des télomères.

La télomérase est essentielle pour le maintien des télomères. Elle compense le problème de réplication de l’ADN télomérique par l’ajout de séquences d’ADN aux extrémités des chromosomes. Chez l’humain, elle est très active dans les premiers stades du développement (embryon, fœtus). Puis, son activité est réprimée pour devenir indétectable dans la plupart des cellules. Ceci conduit au raccourcissement de l’ADN télomérique, à la déprotection de l’ADN et à un arrêt de division cellulaire, appelé senescence. Par contre, dans 90% des cellules de type cancéreux, elle est suractivée. Elle contribue donc à une capacité continue de la prolifération de ces cellules et à leur immortalisation. Notre organisme d’étude est la levure bourgeonnante, Saccharomyces cerevisiae. En plus de ses nombreux avantages d’utilisation, chez cette levure, la télomérase est exprimée constitutivement, ce qui signifie qu’elle nous rapproche le plus du contexte de cellule cancéreuse. Mon projet de maîtrise vise à étudier un des composants de la télomérase chez la levure S. cerevisiae, c’est-à-dire la sous-unité ARN, appelée Tlc1, et plus particulièrement une sous-partie de cet ARN, formant une jonction à trois branches (« Three Way Junction »). Jusqu’à présent, cette structure a été considérée comme étant non essentielle. Pourtant, cette structure très conservée a été démontrée comme étant essentielle à l’assemblage de la télomérase et à son activité, chez une grande variété d’espèces. Avec ce projet, j’ai tenté de déterminer si cette structure à trois branches a un quelconque rôle à jouer que ce soit dans l’assemblage ou dans l’activité de la télomérase. J’ai exploré cette structure en y réalisant des mutations et en analysant leurs effets sur la croissance cellulaire et sur la longueur des télomères. Parmi tous les mutants, la simple substitution d’un nucléotide spécifique, l’adénine 119, conduit à des télomères plus courts qui demeurent stables au fil des générations et les levures sont viables. De plus, ce raccourcissement est de l’ordre de la centaine de paires de bases lorsque la délétion d’une partie ou de la structure au complet est réalisée. C’est donc un raccourcissement significatif, représentant près d’un tiers de la longueur normale des télomères. Par ailleurs, sur des cellules présentant des télomères anormalement courts, l’ajout de ces mutations de la TWJ de TLC1 crée un phénotype létal. / Abstract : Telomerase is essential for telomere maintenance. It compensates for the End-replication problem by adding DNA sequences to the ends of chromosomes. In humans, telomerase is very active in the early stages of development (embryos, foetus). Later, its activity is repressed, and in most cells its activity becomes undetectable. This leads to telomere shortening, a deprotection of chromosome ends and to an arrest of cellular divisions, a highly regulated process also called cellular senescence. However, in cancer cells of 90% of all subtypes, telomerase is up-regulated. Hence, this enzyme promotes the proliferative capacity of cancer cells and their immortalization. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae is our organism of study. In addition to its ease of access, telomerase is constitutively expressed in this yeast, which makes it a useful and inexpensive model of cancer cells. My master’s project aims at studying one of the telomerase components in S. cerevisiae, namely the RNA subunit Tlc1, and more specifically a part of this RNA, forming a Three-Way Junction (TWJ). So far, this structure was considered as non-essential for cell viability. However, this structure is highly conserved among species, and in diverse species it was shown to be crucial for telomerase assembly and activity. My project hence consisted in trying to determine whether or not this structure plays a role in telomerase assembly or activity. The requirements on this structure were explored by creating mutations and by analyzing their effects on cell growth and telomere length. Of all the mutants, a specific nucleotide substitution, Adenine 119 in the TWJ, leads to shortened telomeres, and this shortening is stable during further outgrowth. Furthermore, a telomere shortening of up to 100 base pairs is observed when a part or the complete TWJ structure is deleted. This shortening is quite significant as it represents about one third of the normal length of telomeres. Moreover, expressing these mutants of the TWJ in cells with short telomeres creates a synthetic lethal effect.

Les extrémités des chromosomes eucaryotes ressemblent à une cassure double brin et, en tant que telles, peuvent conduire à l'activation indésirable de la réponse aux dommages de l'ADN. Les télomères sont une structure ribonucléoprotéique qui coiffe les extrémités des chromosomes et les protège contre l'activation indésirable de la réparation des dommages à l'ADN. Après chaque division cellulaire, on observe un raccourcissement progressif des télomères, ce qui limite leur potentiel prolifératif. Une enzyme spécialisée, la télomérase, reconstitue les télomères pour contrebalancer leur érosion. La télomérase est régulée à la baisse dans la plupart des cellules somatiques. Cependant, l'activité de la télomérase est détectée dans la plupart des cellules souches adultes, bien qu'à de faibles niveaux. Le déficit en télomérase a été associé à un groupe de "troubles de la biologie des télomères" (ou téloméropathies), englobant des maladies de vieillissement prématuré, des syndromes d'insuffisance de la moelle osseuse, des fibroses pulmonaires et des maladies du foie. À l'inverse, dans le cancer, environ 85 % des types de tumeurs sont positifs à la télomérase. Par conséquent, l'inhibition de la télomérase est depuis longtemps considérée comme une cible attrayante pour le traitement du cancer. Dans la présente étude, nous avons cherché à découvrir les facteurs qui affectent la fonction de la télomérase humaine et d'autres protéines associées aux télomères ou à la télomérase. Tout d'abord, nous nous sommes concentrés sur l'identification de nouveaux inhibiteurs de la télomérase à partir de composés naturels. Une nouvelle catéchine a été identifiée dans les extraits végétaux de Burkea africana. Les catéchines sont une classe de molécules que l'on trouve couramment dans le thé vert. La catéchine isolée a inhibé la télomérase humaine recombinante in vitro avec un IC50 de 16,19 μM. Dans un deuxième chapitre, nous avons utilisé un criblage d'édition de bases CRISPR dans une lignée cellulaire humaine pour étudier des mutations cliniquement pertinentes dans 22 gènes importants pour l'homéostasie des télomères. Nous avons identifié des variantes qui affectent négativement l'aptitude cellulaire, y compris certaines variantes précédemment annotées comme variantes de signification incertaine. Nous avons également détecté pour la première fois des variantes hTERT qui confèrent une résistance à la petite molécule BIBR1532, un inhibiteur de la télomérase. Nous avons montré que ces allèles résistants aux médicaments permettent l'immortalisation cellulaire et ont un potentiel tumorigène accru. L'ensemble de ces études souligne l'importance de la télomérase humaine pour le maintien des télomères et la santé cellulaire, contribuant ainsi à une meilleure compréhension du rôle de la télomérase dans le cancer et les troubles de la biologie des télomères. / The extremities of eukaryotic chromosomes resemble a double-stranded break and, as such, can lead to the unwanted activation of the DNA damage response. Telomeres are a ribonucleoprotein structure that caps the ends of the chromosomes and protects them from the unwanted activation of DNA damage recognition and repair processes. After each cellular division, progressive telomere shortening is observed, limiting cellular proliferative potential. A specialized enzyme called telomerase replenishes telomeres to counterbalance telomere erosion. Telomerase is downregulated in most somatic cells. However, telomerase activity is detected in most adult stem cells, although at low levels. Telomerase deficiency has been linked to a group of “Telomere Biology Disorders” (or telomeropathies), encompassing premature aging diseases, bone marrow failure syndromes, pulmonary fibrosis and liver diseases. Conversely, in cancer, around 85% of tumour types are telomerase-positive. Therefore, telomerase inhibition has long been considered an attractive target for cancer therapy. In the present study, we aimed to uncover factors that affect the function of human telomerase and other telomere or telomerase-associated proteins. Firstly, we focused on identifying new telomerase inhibitors from natural compounds. A new catechin was identified in the plant extracts from Burkea africana. Catechins are a class of molecules commonly found in green tea. The isolated catechin inhibited recombinant human telomerase in vitro with an IC50 of 16.19 μM. In the second chapter, we employed a CRISPR base editing screen in a human cell line to investigate clinically-relevant mutations in 22 genes important for telomere homeostasis. We identified variants that negatively affected cell fitness, including some variants previously annotated as variants of uncertain significance. Also, we uncovered hTERT variants that confer resistance to the small molecule BIBR1532, a telomerase inhibitor. We showed that these drug-resistant alleles permit cellular immortalization and exhibit tumorigenic potential at levels comparable to wild-type telomerase. Combined, these studies highlight the importance of human telomerase for telomere maintenance and cell fitness, thereby furthering our understanding of the role of telomerase in cancer and telomere biology disorders.

Toute l'information génétique octroyant l'existence à une cellule est encodée par les milliards de paires de bases d'ADN retrouvées principalement à l'intérieur du noyau. Toutefois, pour des raisons d'espace et d'accessibilité, tout cet ADN est soumis à de nombreuses étapes de compaction en plus d'être fractionné dans le but de former ultimement les chromosomes. Malgré que l'extrême compaction de l'ADN permette la protection des acides nucléiques contre la dégradation, certaines structures demeurent vulnérables et nécessitent une protection toute particulière. C'est le cas de séquences se retrouvant à l'extrémité des chromosomes, les télomères. Les télomères sont constitués de répétitions en tandem d'ADN non codant associées avec de nombreuses protéines spécialisées permettant une protection efficace contre la perte d'informations génétiques dû à la dégradation enzymatique ou à l'érosion naturelle. Ces structures télomériques sont normalement maintenues par une machinerie spécialisée, la télomérase, qui composée d'une sous unité ARN et de partenaires protéiques permet l'ajout de séquences télomériques spécifiquement aux extrémités. Cette enzyme essentielle est régulée par de nombreuses protéines et parmi celles-ci, de nombreuses observations font état du rôle essentiel joué par deux protéines kinases, les protéines Tel1p et Mec1p. Ces kinases occupent une double fonction; elles sont importantes pour la régulation de la taille des télomères, mais sont également au coeur de la réponse cellulaire face aux dommages à l'ADN. Étant donné la nature des télomères, soit des extrémités d'ADN libres, ceux-ci sont identiques en de nombreux points aux cassures double brins d'ADN expliquant probablement la double implication de ces protéines. Durant mes études, je me suis particulièrement intéressé à la double fonction jouée par les kinases Tel1p et Mec1p au niveau des télomères et du processus de réponse aux dommages à l'ADN. Dans un premier temps, avec l'aide d'un collègue j'ai pu démontrer l'étendue des fonctions télomériques et de réponses aux dommages à l'ADN jouées par Tel1p via l'isolation et la caractérisation d'un allèle de séparation de fonctions. Dans un deuxième temps, en poursuivant mes analyses génétiques sur la kinase Tel1p, j'ai pu déterminer que cette protéine possédait des fonctions indépendantes à celles octroyées par son domaine kinase, observation allant à l'encontre de l'idée générale que Tel1p sans fonction kinase opérationnelle simulait un allèle nul. Dans la même ligne de pensée, mes études ont permis d'identifier un nouveau mécanisme de régulation de la télomérase essentiel joué par les kinases Mec1p et Tel1p. En parallèle, je me suis intéressé aux mécanismes cellulaires permettant une régulation de l'enroulement global de l'ADN permettant son accessibilité à toutes les machineries cellulaires de transcription, de réparation et de réplication de l'ADN. Mes travaux ont permis d'identifier qu'une modification des histones, protéines critiques dans le processus de compaction de l'ADN, était extrêmement importante dans le processus de réponse aux dommages à l'ADN. En effet la triméthylation de l'histone H3 sur sa lysine 4 permet à la cellule de pouvoir efficacement réparer les dommages via la réparation de bout non-homologue et permettait de stabiliser les fourches de réplications soumises à un stress cellulaire. Globalement mes résultats m'ont permis de mieux comprendre deux moyens distincts utilisés par les cellules pour maintenir l'intégrité de leur génome : les rôles joués par les kinases Tel1p et Mec1p aux télomères et dans la réparation des dommages à l'ADN, ainsi que l'implication de la modification d'histone H3K4me3 dans le processus de réponse aux dommages à l'ADN.