Toute l'information génétique octroyant l'existence à une cellule est encodée par les milliards de paires de bases d'ADN retrouvées principalement à l'intérieur du noyau. Toutefois, pour des raisons d'espace et d'accessibilité, tout cet ADN est soumis à de nombreuses étapes de compaction en plus d'être fractionné dans le but de former ultimement les chromosomes. Malgré que l'extrême compaction de l'ADN permette la protection des acides nucléiques contre la dégradation, certaines structures demeurent vulnérables et nécessitent une protection toute particulière. C'est le cas de séquences se retrouvant à l'extrémité des chromosomes, les télomères. Les télomères sont constitués de répétitions en tandem d'ADN non codant associées avec de nombreuses protéines spécialisées permettant une protection efficace contre la perte d'informations génétiques dû à la dégradation enzymatique ou à l'érosion naturelle. Ces structures télomériques sont normalement maintenues par une machinerie spécialisée, la télomérase, qui composée d'une sous unité ARN et de partenaires protéiques permet l'ajout de séquences télomériques spécifiquement aux extrémités. Cette enzyme essentielle est régulée par de nombreuses protéines et parmi celles-ci, de nombreuses observations font état du rôle essentiel joué par deux protéines kinases, les protéines Tel1p et Mec1p. Ces kinases occupent une double fonction; elles sont importantes pour la régulation de la taille des télomères, mais sont également au coeur de la réponse cellulaire face aux dommages à l'ADN. Étant donné la nature des télomères, soit des extrémités d'ADN libres, ceux-ci sont identiques en de nombreux points aux cassures double brins d'ADN expliquant probablement la double implication de ces protéines. Durant mes études, je me suis particulièrement intéressé à la double fonction jouée par les kinases Tel1p et Mec1p au niveau des télomères et du processus de réponse aux dommages à l'ADN. Dans un premier temps, avec l'aide d'un collègue j'ai pu démontrer l'étendue des fonctions télomériques et de réponses aux dommages à l'ADN jouées par Tel1p via l'isolation et la caractérisation d'un allèle de séparation de fonctions. Dans un deuxième temps, en poursuivant mes analyses génétiques sur la kinase Tel1p, j'ai pu déterminer que cette protéine possédait des fonctions indépendantes à celles octroyées par son domaine kinase, observation allant à l'encontre de l'idée générale que Tel1p sans fonction kinase opérationnelle simulait un allèle nul. Dans la même ligne de pensée, mes études ont permis d'identifier un nouveau mécanisme de régulation de la télomérase essentiel joué par les kinases Mec1p et Tel1p. En parallèle, je me suis intéressé aux mécanismes cellulaires permettant une régulation de l'enroulement global de l'ADN permettant son accessibilité à toutes les machineries cellulaires de transcription, de réparation et de réplication de l'ADN. Mes travaux ont permis d'identifier qu'une modification des histones, protéines critiques dans le processus de compaction de l'ADN, était extrêmement importante dans le processus de réponse aux dommages à l'ADN. En effet la triméthylation de l'histone H3 sur sa lysine 4 permet à la cellule de pouvoir efficacement réparer les dommages via la réparation de bout non-homologue et permettait de stabiliser les fourches de réplications soumises à un stress cellulaire. Globalement mes résultats m'ont permis de mieux comprendre deux moyens distincts utilisés par les cellules pour maintenir l'intégrité de leur génome : les rôles joués par les kinases Tel1p et Mec1p aux télomères et dans la réparation des dommages à l'ADN, ainsi que l'implication de la modification d'histone H3K4me3 dans le processus de réponse aux dommages à l'ADN.

Au cours de la méiose, des centaines de cassures doubles brins (CDB) sont générées et réparées par recombinaison homologue. Ces CDB peuvent être réparés par deux voies différentes donnant lieu à des crossing-overs (CO) ou des non crossing-overs (NCO). Le choix entre les deux voies est finement régulé pour assurer un nombre suffisant de CO; les facteurs influençant ce choix n’ont pas encore été bien caractérisés. L’environnement chromatinien pourrait jouer un rôle important dans ce processus.Peu d’études ont été réalisées sur l’influence de la chromatine sur la recombinaison méiotique. Le but de ma thèse a été de caractériser les facteurs chromatiniens nécessaires au remaniement de la chromatine pendant la recombinaison méiotique chez Saccharomyces cerevisiae.J’ai pu montrer que CAF-1 (Chromatin Assembly Factor 1) et Hir (Histone Regulator), deux protéines chaperons capables de réassembler les histones, s’associent aux sites de cassures doubles brins méiotiques lors de la recombinaison. L’absence de CAF-1 et Hir n’a pas d’effet sur la progression et la formation de CO. Cependant, par des études de recombinaison sur l’ensemble du génome, j’ai pu observer que l’absence de CAF-1 tend à réduire l’interférence des CO. Ce résultat suggère que CAF-1 pourrait être un des facteurs régulant la réparation au cours de la recombinaison méiotique. Pour finir, je me suis aussi intéressée à un troisième chaperon d’histone H3/H4, Asf1. J’ai aussi pu montrer que la délétion d’un autre chaperon Asf1 (Anti-silencing Function 1) entraîne des défauts de progression méiotique et de formation des spores.Ce travail aide à mieux comprendre l'impact de la chromatine sur la réparation de la méiose et le rôle des facteurs d'assemblage de la chromatine. / During meiosis, hundreds of programmed double strand breaks (DSB) are generated and repaired by homologous recombination. Meiotic DSB can be repaired by two major alternative pathways, which generate either crossing-over (CO) or non-crossing-over (NCO) products. The choice between the two repair pathways is tightly controlled to ensure sufficient and accurate CO formation. The chromatin environment could play a crucial role in this process that has not been elucidated yet. Little information is available about the importance of chromatin factors for meiotic recombination. The aim of my PhD was to study chromatin factors necessary for chromatin dynamic during meiotic recombination. I have shown that CAF-1 (Chromatin Assembly Factor 1) and Hir (Histone Regulator), two chaperone proteins that are able to incorporate histones into chromatin, associate with DSB sites during meiotic recombination. CAF-1 and Hir deletion have no effect on the outcome of meiosis and CO formation. However, by genome-wide recombination studies, I have observed that the absence of CAF-1 histone chaperone results in a slight decrease in CO interference. The result suggests that CAF-1 could be one of the factors regulating DNA repair during meiotic recombination. Finally, I have also studied another H3/H4 chaperone, Asf1 (Anti-silencing Function1). Asf1 deletion gives rise to a defect in meiotic progression and spore formation. This work helps to better understand the impact of chromatin on meiotic repair and the role of chromatin assembly factors.

Les télomères sont des structures nucléoprotéiques particulières conférant une stabilité aux extrémités de chromosomes. La plupart des mécanismes télomériques sont conservée chez les eucaryotes supérieurs notamment chez l'homme. Parmi les fonctions exercées, les télomères développent des stratégies visant à limiter la recombinaison impropre aux télomères afin de préserver l'intégrité chromosomique. Au cours de ma thèse, j'ai étudié les mécanismes de maintenance et de protection des télomères chez l'homme, et plus particulièrement le rôle de la recombinaison homologue et recombinaison illégitime. Je me suis plus particulièrement intéressé au rôle de P53 dans le maintien des télomères, à travers sa fonction dans la recombinaison. Bien que son rôle soit établi dans la maintenance des télomères des cellules ALT, sa fonction est en revanche moins bien décrite dans les cellules présentant une activité télomérase. Dans cette perspective, nous avons établi des clones télomèrase (+) exprimant de manière stable le transgène P53R175H, décrit comme stimulant la RH. Cependant, la surexpression de P53R175H ne modifie pas le profil télomérique des ces cellules, se révélant ainsi incapable de stimuler la recombinaison télomérique. L'absence de phénotype pourrait être en fait la conséquence d'une interférence de la télomérase dans la mise en place d'un processus de recombinaison télomérique. Le deuxième volet de notre étude nous amené à préciser le rôle la recombinaison dans le maintien des télomères. Pour cela, nous avons construit des lignées isogéniques invalidées pour les deux voies majeures de la recombinaison grâce à une nouvelle famille de vecteurs ARNi basée sur des vecteurs EBV (brevet CEA N° 0501483) développé par Biard D. Ce système permet d'obtenir une réduction importante, spécifique et à long terme (plus de 300 jours en culture) de l'expression d'un gène cible. Plusieurs partenaires du NHEJ (DNA-PKcs, XRCC4, LigIV, Ku70), ou de la RH (RAD54, RAD51, RAD52) ou du complexe MRN ont été inhibés dans la lignée HeLa (adénocarcinome cervical). Dès les premiers jours d'invalidation du gène cible, des altérations de la stabilité des télomères sont constatées. Ces altérations se maintiennent au cours de la sélection (de 100 à 300 jours selon les clones). Ainsi, il semble que l'invalidation du NHEJ conduise à une instabilité télomérique associée à un raccourcissement de la taille des télomères dans le cas de XRCC4 et LigaseIVKD. Malgré une instabilité télomérique prononcée, les cellules RHKD se distinguent pourtant des clones NHEJKD par des altérations télomériques particulières. En effet, la dérégulation du RH mène à des signaux hétérogènes au sein du même bras chromosomique. En revanche, les anomalies dites de structure (perte associée à des cassures) sont plus abondantes dans les cellules déficientes pour le NHEJ. Ces résultats suggèrent que le NHEJ jouerait un rôle de protection alors que le RH serait plutôt impliqué dans l'élongation et la réplication des télomères. Cette étude s'est poursuit avec l'examen de clones MRE11KD, RAD50KD, NBS1KD permettant de clarifier dans un premier temps le rôle de du complexe dans les différentes voies de recombinaison puis sur la maintenance des télomères. A l'image des autres protéines de la recombinaison, RAD50 préserverait l'intégrité télomérique. L'invalidation des protéines NBS1 et MRE11 initie une élongation des télomères, probable manifestation de l‘activation de la recombinaison télomérique, absente des cellules RAD50KD. Ainsi, la présence de cercles télomériques extrachromosomiques dans le clone NBS1KD vient étayer cettehypothèse. Le complexe MRE11/RAD50/NBS1 constituerait alors un répresseur de la RH aux télomères.