Zsfassung in engl. Sprache. - Würzburg, Univ., Diss., 2008

Zugl.: München, Univ., Diss., 2008

Universiẗat, Diss., 2003--Dortmund.

Universiẗat, Diss., 2003--Göttingen.

Stuttgart, Univ., Diss., 2003.

München, Techn. Univ., Diss., 2002.

Die intakte Signalübertragung im animalischen Nervensystem erfordert eine an richtiger Stelle ausgebildete funktionsfähige Synapse zwischen zwei Nervenzellen bzw. zwischen Nerv und Muskel. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Mutante von Drosophila melanogaster untersucht, bei der es zu Veränderungen der Verteilung eines wichtigen Organisationsproteins der synaptischen aktiven Zone kommt. Ein wichtiges Ergebnis der Untersuchungen ist die Beobachtung, dass es in der Mutante zu einer ektopen Ausbildung von Elementen aktiver Zonen in Axonen kommt. In den Arbeitsgruppen von E. Buchner und S. Sigrist ist bereits das Protein Bruchpilot (BRP) charakterisiert worden, das Bestandteil der präsynaptischen Ribbons, bei Drosophila als T-bars bezeichnet, ist. Bei der Suche nach Interaktionspartnern von BRP, ist eine Serin-Arginin-Protein spezifische Kinase SRPK79D entdeckt worden, die offenbar an der Regulation des Aufbaus der Tbars beteiligt ist (Nieratschker et al., 2009). Es gibt vier verschiedene Isoformen der Kinase. Werden nur zwei Isoformen der Kinase (SRPK79D-RB und -RE) exprimiert bzw. das Gen der Kinase komplett ausgeschaltet, findet man Ansammlungen von BRP als immunreaktive Aggregate in der Immunfluoreszenz- Färbung von larvalen Motoneuron-Axonen (Nieratschker, 2008). Es ist unser übergeordnetes Ziel, die Funktion und den molekularen Signalweg der Kinase SRPK79D zu entschlüsseln. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, PB-Protein in Reinform für eine Affinitätsreinigung eines PB-Antikörpers zu gewinnen, um in nachfolgenden Untersuchungen die Lokalisation dieser Kinase-Isoform zu untersuchen. Die Proteinreinigung war erfolgreich, aber es gelang nicht, eine für eine Affinitätsreinigung ausreichende Menge des Proteins zu isolieren. Ein weiterer Versuch, Lokalisationsuntersuchungen zur Expression der Kinase in Drosophila- Embryonen durchzuführen, war ebenfalls nicht erfolgreich. Obwohl die Herstellung einer für die SRPK79D mRNA spezifischen RNA Sonde für die in-Situ-Hybridisierung gelang, war die Sensitivität dieser Sonde nicht hoch genug, um die Lokalisation vornehmen zu können. Eindeutige und aufschlussreiche Ergebnisse dagegen ergab die Untersuchung der Ultrastruktur der BRP-Ansammlungen in den larvalen Motornerven. Als deren Korrelat fanden sich elektronenmikroskopisch charakteristische Ansammlungen elektronendichter intraaxonaler Strukturen, deren Form Ähnlichkeiten zu T-bars aufwies und die von Vesikeln umgeben waren. Die elektronendichten Strukturen zeigten zahlreiche Formvariationen, die wie Ansammlungen von T-bars nebeneinander bzw. „miteinander verklebte“ T-bars oder wie zerstörte T-bars aussahen. In einer nachfolgenden Studie wurde durch eine immun-elektronenmikroskopische Untersuchung gezeigt, dass diese Strukturen in der Tat BRP enthalten (Nieratschker et al., 2009). Ergebnis der Untersuchungen der vorliegenden Arbeit war der Nachweis, dass prinzipiell ähnliche Aggregate auch im Wildtyp gelegentlich gefunden werden, dass sie aber in Mutanten signifikant häufiger vorkommen und auch einen signifikant höheren Durchmesser aufweisen. Doppelimmunreaktionen mit Antikörpern, die den C- bzw. N-terminalen Bereich von BRP erkennen, belegten darüber hinaus, dass in den Aggregaten das vollständige BRP-Protein vorliegt. Angeregt durch die Ultrastrukturbefunde von mit den elektronendichten Strukturen in den Aggregaten assoziierten Vesikeln wurde in weiteren Doppelimmunreaktionen untersucht, ob ein typisches Protein synaptischer Vesikel neuromuskulärer Synapsen in Drosophila, der vesikuläre Glutamattransporter (DVGlut), in den BRP-Ansammlungen nachweisbar ist. Während Kolokalisation von BRP und DVGlut in aktiven Zonen präsynaptischer Boutons nachgewiesen werden konnte, war der Vesikelmarker in BRP-Aggregaten nicht kolokalisiert. Die Ergebnisse belegen, dass die Kinase SRPK79D für die Vermeidung einer ektopen Bildung von BRP-enthaltenden, elektronenmikroskopisch atypischen aktiven Zonen ähnelnden Strukturen in larvalen Motoneuronaxonen notwendig ist. Die in diesen Aggregaten regelmäßig zu beobachtenden Vesikel ähneln morphologisch synaptischen Vesikeln, besitzen aber keine dafür typischen Vesikelmarker. / Intact signal transmission in an animal’s nervous system requires a properly localized and functional synapse between two neurons or between neuron and muscle. This dissertation is part of the investigation of a Drosophila melanogaster mutant which displays alterations in the distribution of a synaptic active zone protein. An important result of the present study is the documentation of an ectopic formation of active zone structural elements in this mutant. Analyses carried out in the laboratories of E. Buchner and S. Sigrist contributed to the characterization of the protein Bruchpilot (BRP), a constituent of the T-bar, the characteristic presynaptic ribbon in Drosophila. Searching for interaction partners of BRP, a serine-arginine-protein specific kinase was identified that apparently regulates T-bar assembly (Nieratschker et al., 2009). There are four kinase isoforms. Knocking out two of these isoforms (SRPK79D-RB and -RE) results in accumulations of BRP-immunoreactive aggregates in the larval ventral nerves (Nieratschker, 2008). Further studies were designed to identify the function and molecular signalling pathways of the kinase SRPK79D. One objective of the present experiments was to produce purified PB-protein in order to enable affinity-purification of an antibody against this isoform of the kinase for subsequent specific immunohistochemical localization analyses. Although production of the antigen was successful, the amount of protein produced was too low to allow efficient affinity purification. An attempt to show the expression pattern of the kinase in Drosophila embryos with in-situ hybridization resulted in production of a SRPK79D specific RNAprobe, however, the probe sensitivity was not high enough to yield conclusive results for mRNA localization. Ultrastructural analyses of the BRP-ir aggregates in the larval ventral nerves, on the other hand, yielded definite and conclusive results. These aggregates corresponded to extensive intraaxonal electron-dense, ribbon-like structures surrounded by vesicles. These electron-dense structures were differently shaped and resembled accumulations of regularly shaped, clotted or dysmorphic T-bars, which in subsequent immuno-electronmicroscopic analyses carried out by another investigator were proven to contain BRP (Nieratschker et al., 2009). An important result of the present study was the observation that similar intraaxonal aggregates were occasionally also present in wild type nerves, however, the aggregates found in the mutants were significantly more frequent and of significantly larger size than those observed in wild-type larvae. Moreover, double-immunostaining using BRP-antibodies recognizing specifically the C- and the N-terminal part of the protein, respectively, provided evidence that the complete BRP protein is localized in the aggregates. Since electron microscopy had showed that numerous vesicles were associated with the electron dense aggregates, we tested whether the vesicular glutamate transporter (DVGlut), a marker protein for synaptic vesicles of motoneurons in Drosophila, could be localized in BRP-ir aggregates. While colocalization of BRP and DVGlut was observed at the presynaptic active zones, no colocalization of the synaptic vesicle marker was observed in the BRP-ir aggregates in the larval nerves. In conclusion, the results provide evidence that the kinase SRPK79D is required for the prevention of ectopic formation of BRP-containing ribbon-like structures in larval ventral nerves. These structures include vesicles resembling synaptic vesicles, which however do not display immunoreactivity for a typical synaptic vesicle marker protein.

Knochenwachstumsfaktoren (Bone Morphogenetic Proteins, BMPs) sind ubiquitäre, sekretierte Proteine mit vielfältigen biologischen Funktionen. Die Vielfalt an zellulären Prozessen, die durch BMPs reguliert werden, von der Knochenentwicklung und Organhomöostase bis hin zur Neurogenese, erstaunt – und wirft angesichts von teils redundanten, teils spezifischen Funktionen der BMPs Fragen zu den Mechanismen ihrer Signalübermittlung auf. Die Signaltransduktion von BMPs erfolgt wie bei den strukturell verwandten TGF-βs und Activinen durch die ligandeninduzierte Oligomerisierung von transmembranen Serin/Threonin-Kinaserezeptoren, von denen zwei Typen – Typ I und Typ II – existieren. Einer Vielzahl von mehr als 18 BMP-Liganden stehen nach derzeitigem Erkenntnisstand nur vier Typ I und drei Typ II Rezeptorsubtypen für die Bildung von heteromeren Rezeptorkomplexen zur Verfügung. Ein BMP-Ligand kann hochspezifisch nur einen bestimmten Rezeptorsubtyp oder in einer promisken Art und Weise mehrere Rezeptorsubtypen binden. Trotz dieser Bindungspromiskuität üben BMPs ihre biologische Funktion überwiegend hochspezifisch aus, d.h. abhängig vom Liganden werden spezifische zelluläre Prozesse reguliert. Somit stellt sich die Frage, wie die Bildung von heteromeren Ligand-Rezeptor-Komplexen und die Aktivierung definierter intrazellulärer Signalkaskaden zusammenhängen und wie letztlich ein bestimmtes BMP-Signal durch einen „Flaschenhals“, repräsentiert durch die begrenzte Anzahl an Rezeptorsubtypen, in das Zellinnere übermittelt wird. Die Interaktionen zwischen BMP-2 / GDF-5 und den Typ I Rezeptoren BMPR-IA / BMPR-IB sind ein Paradebeispiel für Bindungspromiskuität und -spezifität. Während BMP-2 beide Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB mit gleicher Bindungsaffinität bindet („promiske Interaktion“), zeigt GDF-5 eine 15-20fach höhere Bindungsaffinität zu BMPR-IB („spezifische“ Interaktion). Dieser Unterschied ist scheinbar gering, aber physiologisch überaus relevant. Um Einblick in die Mechanismen der molekularen Erkennung zwischen den Bindungspartnern zu gewinnen, wurden binäre und ternäre Komplexe aus den Liganden BMP-2 oder GDF-5, den extrazellulären Domänen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA oder BMPR-IB sowie der extrazellulären Domäne des Typ II Rezeptors ActR-IIB untersucht. Die hier vorliegende Arbeit beschreibt die strukturelle und funktionelle Analyse dieser Ligand-Rezeptor-Komplexe. Um den Einfluss struktureller Flexibilität auf die BMP Typ I Rezeptor Erkennung näher zu analysieren, wurde zudem die Struktur von BMPRIA in freiem Zustand mittels NMR-Spektroskopie aufgeklärt. Aus Mutagenesedaten und der Kristallstruktur des GDF-5•BMPR-IB-Komplexes lassen sich im Vergleich zu bekannten Kristallstrukturen Merkmale ableiten, mit denen die Ligand-Rezeptor-Bindung und -Erkennung charakterisiert werden kann: (1) Die Hauptbindungsdeterminanten in Komplexen von BMPR-IA und BMPR-IB mit ihren Liganden sind unterschiedlich. Während in Komplexen mit BMPR-IB ein hydrophobes Motiv die Bindungsaffinität bestimmt, trägt in Komplexen mit BMPR-IA eine polare Interaktion signifikant zur Bindungsenergie bei. Ein Vergleich der Strukturen von freien und gebundenen Liganden und Typ I Rezeptoren zeigt, dass interessanterweise diese Hauptbindemotive erst bei der Ligand-Rezeptor-Interaktion entstehen, sodass ein „induced fit“ vorliegt und die Moleküle entsprechend „aufeinander falten“. (2) Die Bindungsspezifität wird durch periphere Schleifen in den Typ I Rezeptoren bestimmt. Wie Untersuchungen von Punktmutationen in BMPR-IA zeigen, die einer krebsartigen Darmerkrankung (Juvenile Polyposis) zugrunde liegen, führt erst die „richtige“ Kombination aus Flexibilität in den Schleifen und Rigidität des Rezeptorgrundgerüsts zu signalaktiven Typ I Rezeptoren mit einer potentiell den Liganden komplementären Oberfläche. Die mangelnde sterische Komplementarität von Ligand- und Rezeptoroberflächen führt zu der niedrigeren Bindungsaffinität von GDF-5 zu BMPR-IA im Vergleich zu BMPR-IB. Interessanterweise zeigen die hier vorgestellten, hochaufgelösten Strukturdaten, dass die Orientierungen/Positionen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB in den Bindeepitopen der Liganden BMP-2 und GDF-5 variieren. Unter der Voraussetzung, dass die extrazelluläre Domäne, das Transmembransegment und die intrazelluläre Domäne der Typ I Rezeptoren ein starres Element bilden, sollte sich die unterschiedliche Orientierung der extrazellulären Domänen der Typ I Rezeptoren in der Anordnung der Kinasedomänen widerspiegeln und sich auf die Signaltransduktion auswirken. Möglicherweise ist eine bestimmte Anordnung der Kinasedomänen der Typ I und Typ II Rezeptoren für eine effiziente Phosphorylierung bzw. Signaltransduktion erforderlich. Der Vergleich mehrerer Ligand-Typ I Rezeptor-Komplexe zeigt, dass die unterschiedliche Orientierung dieser Rezeptoren möglicherweise vom Liganden abhängt. Angesichts der Bindungspromiskuität unter BMP-Liganden und -Rezeptoren könnten so spezifische Signale übermittelt und spezifische biologische Funktionen reguliert werden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Erkenntnisse tragen wesentlich zur strukturellen Charakterisierung der Ligand-Rezeptor-Erkennung in der BMP-Familie bei. Die Frage, warum trotz strukturell hoch homologer Liganden und Rezeptoren und weitgehend konservierten Bindeepitopen eine teils promiske und teils spezifische Interaktion möglich ist, kann nun für die Liganden BMP-2 und GDF-5 sowie den beiden Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB beantwortet werden. / Bone morphogenetic proteins (BMPs) are ubiquitous, secreted cytokines involved in a manifold of biological functions. The diversity of cellular processes regulated by BMPs, from bone development to tissue homeostasis and neuronal processes, is amazing – and raises questions about the mechanisms of signal transduction in the light of redundant functions on the one hand, and specific functions on the other hand. Similar to structurally related activins and TGF-βs, the signal transduction of BMPs is accomplished by ligand-induced oligomerization of transmembrane BMP type I and type II serine/threonine receptor kinases. According to current knowledge, only four type I and three type II receptor subtypes are available for BMP signal transduction, facing a multitude of more than 18 BMP ligands. Binding of BMP ligands to their receptors can be highly specific meaning that only one specific receptor of either subtype is used for signaling. In contrast, many BMP ligands can recruit more than one receptor subtype, which results in binding promiscuity. However, even though receptor subtypes are bound in a promiscuous manner, only certain biological functions are triggered. Dependent on the BMP ligand, specific cellular processes are activated and regulated. This discrepancy between unspecific binding and specific signaling events and the biological response raises the question how the formation of heteromeric ligand-receptor complexes is linked to the activation of defined intracellular signaling cascades, and finally, how a certain BMP signal is transduced into the interior of the cell through a „bottleneck“ represented by the limited number of receptor subtypes. The interaction between BMP-2 / GDF-5 and the BMP type I receptors BMPR-IA / BMPR-IB is a prime example for binding promiscuity and binding specificity. BMP-2 binds BMPR-IA and BMPRIB with almost equal binding affinity („promiscuous interaction“) while GDF-5 exhibits a 15-20fold higher binding affinity to BMPR-IB („specific interaction“). Although this difference is seemingly small, it is however of considerable relevance for the physiological role of these ligands. To gain insight into the mechanisms of molecular recognition between the binding partners, binary and ternary ligand-receptor complexes consisting of BMP-2 or GDF-5, the extracellular domains of the type I receptors BMPR-IA or BMPR-IB, and the extracellular domain of the type II receptor ActRIIB were investigated. The thesis presented here describes the structural and functional analysis of these ligand-receptor complexes. To analyse the effect of structural flexibility on BMP type I receptor recognition in more detail, the structure of free BMPR-IA was determined using NMR spectroscopy. Based on data from a limited mutagenesis and the crystal structure of the GDF-5•BMPR-IB complex several characteristics concerning ligand-receptor binding and recognition can be deduced: (1) The main binding determinants in complexes of BMPR-IA and BMPR-IB with their ligands BMP-2 and GDF-5 differ. A hydrophobic binding motif determines binding affinity in complexes of BMPR-IB, whereas a polar interaction significantly contributes to binding energy in complexes of BMPR-IA. These main binding motifs are only formed during complex formation as demonstrated by a comparison between structures of free and bound ligands as well as type I receptors. Both ligand and receptor fold „onto each other“ which suggests an induced fit mechanism. (2) Binding specificity is encoded on loops at the periphery of the binding epitope of the type I receptors. Only the „appropriate“ combination between structural flexibility in the receptor loops and structural rigidity of the receptor backbone results in signal active type I receptors, as shown by analysis of single polymorphisms in BMPR-IA causing juvenile polyposis syndrome, a cancerous disease of the intestine. A lack of steric surface complementarity between GDF-5 and BMPR-IA, that cannot be overcome by structural flexibility, leads to the lower binding affinity in comparison to BMPR-IB. Interestingly, the high resolution structure of the GDF-5•BMPR-IB complex shows that the orientations/positions of BMPR-IA in the binding epitope of BMP-2 and of BMPR-IB in the binding epitope of GDF-5 vary. Assuming that the extracellular domain, the transmembrane segment, and the intracellular domain of the type I receptors form a rigid element, the different orientations of the extracellular domains should also reflect the assembly of the kinase domains and therefore, affect signal transduction. One can assume that a defined arrangement of the kinase domains of type I and type II receptors is required to allow for efficient phosphorylation and signal transduction, respectively. The comparison of several BMP ligand-type I receptor complexes suggests that the different orientations of these receptors are likely dependent on the ligand. Considering the binding promiscuity among BMP ligands and receptors such a mechanism would represent a possible way for the transmission of specific signals and regulation of specific biological functions. The insights into molecular structure and function of BMP ligands and receptors presented in this thesis contribute significantly to a more detailed understanding of their binding properties. The question why the interaction of BMP ligands and receptors is promiscuous on the one hand and specific on the other hand in spite of structurally highly homologous molecules can now be answered for BMP-2 and GDF-5 as well as BMPR-IA and BMPR-IB.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es festzustellen, ob die unterschiedliche Versorgung mit Protein (XP), Threonin (Thr) und Glycin (Gly) bei einer limitierten Threoninversorgung einen Einfluss auf die Threonindehydrogenase-Aktivität (TDG-Aktivität) in der Leber von Küken und Laborratten hat. Dazu wurden 7 Versuche mit federgesexten männlichen Cobb-Küken und weißen Wistar-Ratten in verschiedenen Altersstufen und Lebendmassebereichen durchgeführt: Versuch 1: Küken vom 15. - 25. Lebenstag bei unterschiedlichen Rohproteingehalten. Die kalkulierten XP-Gehalte lagen bei 5,5%; 11,0%; 16,5%; 22,0%; 27,5% und 33,0%. Versuch 2: Küken vom 17. - 30. Lebenstag bei XP-Gehalten von 18,5% und 22,5% mit jeweils 2 Threoninstufen von 0,45% und 0,60% wahr fäcal verdaulichem Threonin. Versuch 3: Küken vom 10. - 20. Lebenstag bei XP-Gehalten von 16,5% und 22,0% und einer Steigerung des Threoningehaltes von 0,65% auf 0,79% Threonin bei 16,5% XP und 0,86% auf 1,05% Threonin bei 22,0% XP. Versuch 4: Küken vom 1. - 49. Lebenstag in Bodenhalten bei praxisnaher Phasenfütterung. Die Prüfung der Leber-Threonindehydrogenase erfolgte am 7., 21., 35. und 49. Lebenstag. Versuch 5: Küken vom 5. - 15. Lebenstag bei einem XP-Gehalt von einheitlich 22,0% und Glycingehalten von 0,64% und 0,98% und wahr fäcal verdaulichen Threoningehalten von 0,45% und 0,60% bei 0,64% bzw. 0,98% Glycingehalt. Die Gly+Ser-Gehalte betrugen insgesamt 1,55% bzw. 1,90%. Versuch 6: Weiße Wistar-Ratten im Lebendmassebereich von 106 - 140 g bei XP-Gehalten von 0%, 6,0%, 12,0%, 18,0% und 24,0%. Vesuch 7: Weiße Wistar-Ratten im Lebendmassebereich von 149 - 167 g und XP-Gehalten von 12,0% und 18,0% mit unterschiedlichen Threoningehalten von 0,28%, 0,42% und 0,72% bei 12,0% XP bzw. 0,42%, 0,52% und 0,72% bei 18,0% XP. Am Ende des jeweiligen Vesuches wurden die Lebern von jeweils 6 Tieren entnommen und für die Bestimmung der TDG-Aktivität in vitro aufbereitet. Die Threoninwirksamkeiten wurden aus N-Bilanzversuchen mit einem exponentiellen N-Verwertungsmodell abgeleitet. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1. Durch die Erhöhung der XP-Gehalte stieg die TDG-Aktivität in der Kükenleber ab 22,0% XP in der Futtermischung trotz limitierter Threoninversorgung signifikant an. Die Threoninwirksamkeit war unverändert bis zu einem XP-Gehalt von 27,5% und fiel bei 33,0% XP signifikant ab. D. h. durch einen verstärkten Abbau von Threonin durch die TDG erfolgte eine Verminderung der Thr-Wirksamkeit bei der Futtermischungen mit hohem XP-Gehalt. 2. Bei einem XP-Gehalt von 18,5% und einem Anstieg der Thr-Konzentration von 0,45% auf 0,60% dThr zeigte sich kein Einfluss auf die TDG-Aktivität in der Kükenleber, wohl aber bei einem XP-Gehalt von 22,5% und einem Gehalt von 0,60% dThr war die TDG-Aktivität in der Kükenleber erhöht. Das könnte den Bereich angeben, in dem Threonin nicht mehr limitierend wirkt. 3. Bei einem Gehalt von 16,5% XP und einem Anstieg der Thr-Konzentration von 0,65% auf 0,79% wurde kein Einfluss auf die TDG-Aktivität in der Kükenleber ermittelt, dagegen stieg die TDG-Aktivität bei einem Gehalt von 22,0% XP und einer Erhöhung des Thr-Gehaltes von 0,86% auf 1,05% signifikant an. 4. Im Verlauf des Phasenfütterungsversuches zeigten sich altersabhängige Veränderungen der TDG-Aktivität, die mit Phasen eines besonders hohen metabolischen Bedarfes an Glycin erklärt weden können. 5. Bei einem XP-Gehalt von 22,0% (Gly + Ser-Gehalt 1,55%) führte die Erhöhung des Thr-Gehaltes von 0,45% auf 0,60% dThr zu einer mehreren Akkumulation von Gly in den Lebermitochondrien, jedoch nicht signifikantem Anstieg der TDG-Aktivität. Bei 1,90% Gly+Ser und 22,0% XP stieg die TDG-Aktivität nach Thr-Zulage signifikant an. Dieser Befund weist auf das Ende des Thr-Limitierungsbereiches hin. 6. Bei Laborratten lag die TDG-Aktivität bei einer proteinfreien Ration am niedrigsten, erhöhte sich bei einer XP-Steigerung bis 12,0% XP, verringerte sich geringfügig bis 18,0% XP und stieg von 18,0% bis 24,0% XP tendenziell an. Insgesamt beeinflusste das XP-Niveau die TDG-Aktivität aber nur zufällig. 7. Der Anstieg des Thr-Gehaltes von 0,28% auf 0,72% bei 12,0% XP bewirkte einen allmählichen Anstieg der TDG-Aktivität in den Rattenlebermitochondrien. Das trifft ebenfalls für die Futtermischung mit 18,0% XP zu, allerdings auf einem etwas höheren Niveau. Die TDG-Aktivität wurde nahezu ausschließlich durch die Aminoacetonakkumulierung moduliert. TDG-Aktivität und Thr-Wirksamkeit zeigten das Ende des Thr-Limitierungsbereiches an. Die in vitro TDG-Aktivitäten der Leber von Küken und Laborratten wird demnach nicht nur durch die Thr-Konzentrationen im Futter sondern auch vom XP-Gehalt und damit dem Angebot anderer Aminosäuren sowie vom Alter beeinflusst. Da offensichtlich Zusammenhänge zur unspezifischen Katabolisierungsrate anderer Aminosäuren bestehen, wird die Interpretation von TDG-Veränderungen (in vitro) erschwert. Bezüge zum Parameter Thr-Wirksamkeit sind mit Einschränkungen deutlich geworden und müssen, bevor quantitative Aussagen möglich sind, weiter erforscht werden.

TRPA1 is a thermosensitive ion channel from the ankyrin subfamily of Transient Receptor Potential (TRP) receptors. These proteins play essential roles in the transduction of wide variety of environmental and endogenous signals. TRPA1, which is abundantly expressed in primary nociceptive neurons, is an important transducer of various noxious and irritant stimuli and is also involved in the detection of temperature changes. Similarly to other TRP channels, TRPA1 is comprised of four subunits, each with six transmembrane segments (S1-S6), flanked by the cytoplasmic N- and C-terminal ends. In native tissues, TRPA1 is supposed to be regulated by multiple phosphorylation sites that underlie TRPA1 activity under physiological and various pathophysiological conditions. Using mutational approach, we predicted and explored the role of potential phosphorylation sites for protein kinase C in TRPA1 functioning. Our results identify candidate residues, at which phosho-mimicking mutations affected the channel's ability to respond to voltage and chemical stimuli, whereas the phospho-null mutations to alanine or glycine did not affect the channel activation. Particularly, we identify the serine 602 within the N-terminal ankyrin repeat domain 16, the substitution of which to aspartate completely abolished the TRPA1...