Themis est une protéine de signalisation des récepteurs des lymphocytes T (TCR) essentielle pour la sélection positive des cellules T. La fonction moléculaire de Themis a été controversée mais de récentes études suggèrent qu'il est un régulateur positif des voies de signalisation des TCR. Nous avons montré dans une étude préliminaire que Themis interagit avec des déubiquitinases et qu'il est ubiquitiné dans les thymocytes. L'objectif de ma thèse était de caractériser les mécanismes moléculaires qui régulent l'ubiquitination de Themis et de déterminer si ces processus affectent la fonction de Themis durant le développement des lymphocytes T. Nous avons montré que si l'expression des ARNm codant pour Themis diminue dans les stades précoces de la sélection positive, son expression protéique est parallèlement augmentée, suggérant une stabilisation de Themis par des modifications post-traductionnelles durant cette étape. Nous avons montré que la déubiquitinase USP9X déubiquitine Themis pour stabiliser son expression durant la stimulation des TCR. L'ensemble de nos résultats proposent qu'USP9X soit activé durant la stimulation des TCR grâce à son recrutement dans les complexes proximaux des TCR par l'intermédiaire de l'adaptateur Grb2 et Themis, entrainant la stabilisation de l'expression de Themis. Nous pensons que ce mécanisme est important pour maintenir l'expression de Themis durant la sélection positive afin de favoriser l'induction d'un signal des TCR soutenu, requis pour l'efficacité de ce processus. / The protein Themis is a new actor of the T cell receptor (TCR) signaling essential for the positive selection of T cells. The molecular function of Themis has been controversial but recent findings suggest that it acts as positive regulator of TCR signaling. We demonstrated in an initial research that Themis interacts with deubiquitylases and is covalently associated to ubiquitin chains in thymocytes. The aim of my PhD project was to characterize the molecular process that regulates the ubiquitination of Themis and to investigate how these post-translational modifications affect Themis function during T cell development. We demonstrated that Themis mRNA expression is progressively decreased after positive selection whereas Themis protein expression is enhanced at the early stages of positive selection, suggesting that Themis is stabilized by post-translational modifications during positive selection. We demonstrated that USP9X allows the deubiquitination of Themis and its stabilization following TCR engagement. Ours results suggest that USP9X is activated during TCR engagement following its recruitment to proximal signaling complexes through Grb2 and Themis, leading to the deubiquitination and stabilization of Themis expression. We believe that this mechanism is important to sustain Themis expression during positive selection and to promote durable TCR signals required for the efficiency of this process.

T cell activation and thymic selection are thought to be determined by the binding propensity (avidity or affinity) of the T cell receptor (TCR) to its ligands. However, binding propensity quantified by previous 3D TCR–pMHC kinetics such as using tetramer staining or surface plasmon resonance (SPR) under estimate TCR–pMHC interaction due to neglecting physiological conditions. Recent studies considering membrane contribution in TCR–pMHC interaction reported 2D kinetics and force regulated bond dissociation kinetics have better prediction to biological responses in CD8+ T cells. In this study, we further tested the findings in CD4+ T cells and CD4+ CD8+ (double-positive, DP) thymocytes. We analyzed TCR–pMHC interaction for a well-characterized panel of altered peptide ligands (APLs) on multiple transgenic mouse TCR systems. Using ultrasensitive 2D mechanical assays, in situ 2D kinetic measurements show better sensitivity than the SPR 3D kinetic measurements in gauging the ligand potency and thymic selection. Furthermore, force-regulated bond lifetime of TCR–pMHC interaction amplifies the discrimination in recognition of APLs and thymic selection. When force was applied to TCR–pMHC–CD4/8 bonds, two distinct patterns emerged: agonist/negative selecting ligands formed CD4/8-dependent catch-slip bonds where lifetime first increased, reached a maximum, then decreased with increasing force, whereas antagonist/positive selecting ligands formed slip-only bonds where lifetime monotonically decreases with increasing force. Our results highlight an important role of mechanical force in ligand discrimination and suggest a new mechanism for T cell activation and thymic selection that is distinct from previous models based on 3D measurements.

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Les cellules T ɑβ conventionnelles expriment des récepteurs antigéniques qui peuvent reconnaître et répondre à une grande variété d’agents pathogènes. En parallèle, des mécanismes cruciaux sont en place pour empêcher les cellules T de réagir aux auto-antigènes afin de prévenir le développement d’auto-immunité. Dans le but d’assurer la génération d’un réservoir de cellules T fonctionnelles, diverses et tolérantes au soi, les récepteurs des cellules T (TCR) ɑβ appropriés sont sélectionnés dans le thymus en fonction de la quantité et de la qualité des interactions avec les peptides du soi présentés par le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) sur les cellules présentatrice d’antigènes (CPA). Chez les nouveau-nés, des mécanismes intrinsèques et extrinsèques aux cellules influencent les interactions entre le TCR et le complexe CMH-peptide du soi, résultant en un répertoire de cellules T qui possèdent des propriétés distinctes par rapport à leurs homologues adultes. Par ailleurs, les souris diabétiques non-obèses (NOD), qui ont des cellules T auto-réactives qui attaquent les cellules β du pancréas, responsables de la production d’insuline, sont porteuses de polymorphismes génétiques qui peuvent influencer la sélection thymique. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que des facteurs intrinsèques et extrinsèques aux cellules modulent la sélection thymique tout au long de la vie et peuvent ultimement contribuer à la fonction et au dysfonctionnement de cellules T effectrices. La force globale de la signalisation TCR perçue lors du développement des lymphocytes T peut être mesurée en évaluant le niveau d’expression de différentes molécules, telles que CD5. Nous avons découvert que, tant chez la souris que l’humain, le répertoire des cellules T néonatales est composé de cellules T exprimant des niveaux plus élevés de CD5 que ceux des adultes. Cette augmentation des niveaux d’expression de CD5 n’est pas due à des défauts de tolérance centrale. En fait, nous avons plutôt démontré que les thymocytes exprimant un TCR de faible affinité pour les antigènes du soi ne sont pas sélectionnés efficacement chez les nouveau-nés et donc ne font pas partie du répertoire des cellules T néonatales, alors que ces thymocytes se développent adéquatement chez les adultes. Cette modification dans les seuils de sélection thymique biaise le niveau basal d’auto-réactivité du répertoire de cellules T néonatales et pourrait expliquer en partie les différences de réponse aux infections observées entre les nouveau-nés et les adultes. En comparant les niveaux de CD5 sur les thymocytes et les cellules T périphériques de souris NOD, prédisposées au diabète, avec ceux de souris C57BL/6 (B6), résistantes au développement du diabète auto-immun, nous avons découvert que les populations de cellules T des souris NOD ne perçoivent pas nécessairement des signaux TCR plus forts lorsqu’ils interagissent avec des antigènes du soi. Au contraire, une plus grande proportion de cellules T CD4+ et régulatrices avec un plus faible niveau de CD5 se différencient chez les souris NOD. Ce phénotype est fortement dépendant du locus du CMH des souris NOD. En revanche, les niveaux de CD5 sur les cellules T CD8+ périphériques des souris NOD sont plus élevés que ceux des souris B6, en raison d’un biais de survie intrinsèque aux cellules. Ces différences en niveau d’expression de CD5 sur le répertoire de cellules T des souris NOD ont des conséquences fonctionnelles directes et pourraient contribuer au développement ou à la progression du diabète auto-immun. Enfin, nous avons évalué si la sélection thymique était modulée par une molécule de co-signalisation, le co-stimulateur inductible de cellules T (ICOS). ICOS appartient à la famille des molécules de co-signalisation de type CD28 et se lie au ligand de ICOS (ICOSL). Alors que d’autres molécules de co-signalisation ont été démontré comme étant impliquées dans la tolérance centrale, le rôle joué par ICOS n’est pas clair. Nous avons démontré que ICOSL est exprimé par une variété de CPA thymiques importantes dans l’induction de la tolérance centrale et que ICOS est exprimé à la hausse durant la sélection thymique, en fonction de la force du signal TCR perçue par les thymocytes. Nous fournissons également, pour la première fois, une preuve que la voie ICOS-ICOSL pourrait avoir un rôle dans la régulation fine de la sélection négative. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse démontrent que la sélection thymique être altérés dans le contexte de l’ontogénie et du diabète auto-immun, conduisant au développement de cellules T avec une auto-réactivité basale relativement plus élevée ou plus faible en comparaison aux animaux adultes en bonne santé. Ces modulations pourraient avoir des conséquences importantes sur la fonction immunitaire et doivent être considérées pour le développement de futurs vaccins ou approches thérapeutiques chez ces populations. / Conventional ɑβ T cells express antigen receptors that can recognize and respond to a wide range of foreign pathogens. In parallel, critical mechanisms are in place to prevent T cells from reacting to self-antigens causing autoimmunity. To ensure the generation of a functional, diverse yet self-tolerant T cell pool, appropriate ɑβ T cell receptors (TCR) are selected in the thymus based on the quality and quantity of their interactions with self-peptides presented by the major histocompatibility complex (MHC) on thymic antigen presenting cells (APC). In neonates, cell-intrinsic and -extrinsic mechanisms influence TCR and self-peptide-MHC interactions resulting in a T cell pool that exhibits distinct functions as compared to their adult counterparts. Similarly, non-obese diabetic (NOD) mice, which contain autoreactive T cells that attack insulin-producing pancreatic β cells, carry genetic polymorphisms that can influence thymic selection. Therefore, we hypothesized that cell-intrinsic and -extrinsic factors modulate thymic selection throughout life and may ultimately contribute to the function and dysfunction of effector T cells. The overall perceived strength of TCR signaling during T cell development can be measured by several molecules, including CD5. We found that, in both mice and humans, the neonatal T cell pool is composed of T cells with higher CD5 levels than their adult counterparts. The increased CD5 levels are not due to defects in central tolerance. Instead, we demonstrated that thymic selection is altered in neonates. Thymocytes expressing a TCR with low affinity to self-antigen that develop in adults are not efficiently selected into the neonatal T cell pool. This shift in thymic selection thresholds skews the basal self-reactivity of the neonatal T cell repertoire and may explain, in part, differences in the neonatal versus adult response to infections. By comparing CD5 levels on thymocytes and peripheral T cells from diabetes-prone NOD mice with those from autoimmune-resistant C57BL/6 (B6) mice, we found that T cell populations in NOD mice do not necessarily perceive stronger TCR signals when interacting with self-antigens. Rather, NOD mice allow the differentiation of more CD4+ T cells and thymic Tregs with lower CD5 levels. This phenotype is strongly dependent on the NOD MHC locus. In contrast, CD5 levels on peripheral NOD CD8+ T cells are higher than those in the B6 mice that is likely due to a cell-intrinsic survival bias. These differences in CD5 levels in the NOD T cell pool have direct functional consequences and may contribute to the development or progression of autoimmune diabetes. Lastly, we investigated whether thymic selection is modulated by the co-signaling molecule, inducible T cell costimulator (ICOS). ICOS belongs to the CD28 family of co-signaling molecules and binds to the ICOS ligand (ICOSL). While other co-signaling molecules have been implicated in central tolerance, the role played by ICOS is unclear. We demonstrated that ICOSL is expressed by an array of thymic APCs important for central tolerance induction, and that ICOS is upregulated during thymic selection relative to the strength of TCR signaling the thymocytes perceive. We also provide, for the first time, evidence that the ICOS-ICOSL pathway may fine-tune negative selection. In conclusion, the results presented in this thesis demonstrate that thymic selection appears to be altered within the context of ontogeny and autoimmune diabetes, leading to the development of T cells with relatively higher or lower basal self-reactivity as compared to healthy adult animals. These modulations may have significant consequences on immune function and require careful consideration for future vaccination and therapeutic approaches within these populations.