Cette thèse porte sur l'histoire évolutive des gènes de vertébrés. Deux types de phénomènes évolutifs peuvent perturber l’organisation des gènes dans les génomes eucaryotes : les modifications du contenu en gènes des génomes par duplications ou délétions de gènes, et les changements dans l’ordre des gènes par réarrangements. L’impact fonctionnel et sélectif de ces processus sur les génomes est encore mal connu.Ce travail de thèse s’articule autour de trois projets portant sur les événements de duplication et de délétion qui modifient le nombre de copies d'un gène. Nous nous sommes intéressés à ces événements à partir d’arbres phylogénétiques reconstruits à l’échelle de génomes entiers. Dans une première partie nous avons examiné le cas où ces événements seraient sous sélection négative, en étudiant les arbres de gènes ou aucune duplication ou délétion ne s'est fixée. Nous avons observé que ces gènes avaient des propriétés particulières et nous proposons des hypothèses pour les expliquer. Dans une deuxième partie nous nous sommes intéressés aux duplications de gènes et aux corrélations que l'on observe avec l'évolution des fonctions biologiques. Enfin en dernière partie nous avons étudié en détail la famille de gènes ROBO dont une des copies aurait acquis une fonction différente dans le développement du système nerveux des mammifères sous l’influence de la sélection positive. Dans leur ensemble ces résultats apportent de nouveaux éléments pour mesurer et comprendre l’impact global des contraintes ou des avantages que les duplications de gènes en particulier, et le changement du nombre de copies des gènes en général, peuvent exercer sur un génome de vertébré. / This thesis is about the evolutionary history of vertebrates genes. Two categories of evolutionary processes can disrupt the gene organization in eukaryotic genomes: changes in the content of genomes by gene duplications or gene deletions, and changes in the order of the genes by rearrangements. Functional and selective impacts of these processes on genomes are poorly understood.This thesis covers three different projects about duplication and deletion events that change the number of gene copies. We were interested in these events from phylogenetic trees reconstructed at the scale of whole genomes. In the first part we examined the case where these events would be under negative selection, by studying phylogenetic gene trees where no duplication or deletion was fixed. We found that these genes have special properties and propose hypotheses to explain them. In the second part we looked at gene duplications and correlated these events with the evolution of biological functions. Finally in the last part we have studied in detail the ROBO genes family in which one copy has acquired a different function in the developing nervous system of mammals under the influence of positive selection.Taken together these results provide new elements to measure and understand the global impact of constraints or advantages that gene duplications in particular, and the change of genes copy number in general, can have on a vertebrate genome.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'identification de régions génomiques cibles de la sélection naturelle positive permet de mieux comprendre notre passé évolutif et de trouver des variants génétiques fonctionnels importants. Puisque la fréquence des allèles sélectionnés augmente dans la population, la sélection laisse des traces sur les séquences d'ADN et ces empreintes sont détectées lorsque la variabilité génétique d'une région est différente de celle attendue sous neutralité sélective. On propose une nouvelle approche pour analyser les données de polymorphismes : le calcul des classes alléliques d’haplotypes (HAC), permettant d'évaluer la diversité globale des haplotypes en étudiant leur composition allélique. L'idée de l'approche est de déterminer si un site est sous sélection positive récente en comparant les distributions des HAC obtenues pour les deux allèles de ce site. Grâce à l'utilisation de données simulées, nous avons étudié ces distributions sous neutralité et sous sélection en testant l'effet de différents paramètres populationnels. Pour tester notre approche empiriquement, nous avons analysé la variation génétique au niveau du gène de lactase dans les trois populations inclues dans le projet HapMap. / Natural selection eliminates detrimental and favors advantageous phenotypes. This process leaves characteristic signatures in the underlying genomic segments that can be recognized through deviations in the allelic or in haplotypic frequency spectra. We introduce a new way of looking at the genomic single nucleotide polymorphisms : the haplotype allelic classes (HAC). The model combine segregating sites and haplotypic informations in order to reveal useful characteristics of the data, providing an identifiable signature of recent positive selection that can be detected by comparison with the background distribution. We compare the HAC distribution's partition between the haplotypes carrying the selected allele and the remaining ones. Coalescence simulations are used to study the distributions under standard population models assuming neutrality, demographic scenarios and selection models. To test, in practice, the performance of HAC and the derived statistic in capturing deviation from neutrality due to selection, we analyzed the genetic variation in the locus of lactase persistence in the three HapMap populations.

L’adénovirus possède plusieurs caractéristiques faisant de ce virus un candidat de choix pour la construction de vecteurs utiles dans les études de génomique fonctionnelle. Dans la majorité de ces applications, on a recours à un vecteur adénoviral de première génération délété de sa région E1. L’utilisation de vecteurs adénoviraux comprend deux maillons faibles : la construction du vecteur et la production subséquente de ce dernier. Le développement de méthodes alternatives est donc nécessaire pour renforcer ces deux maillons, permettant ainsi une utilisation étendue de ces vecteurs. Ce développement va s’articuler sur deux axes : l’ingénierie du vecteur de transfert pour la construction de l’adénovirus recombinant et l’ingénierie d’une lignée cellulaire pour la production du vecteur. En utilisant un vecteur de transfert adénoviral co-exprimant, à partir d’un promoteur régulable à la tétracycline, la protéase de l’adénovirus et une protéine de fluorescence verte (GFP) par l’intermédiaire d’un site d’entrée ribosomal interne (IRES), notre groupe a établi que la sélection positive, via l’expression ectopique de la protéase, est un processus efficace pour la création de librairie d’adénovirus recombinants. Par contre, la diversité atteinte dans ce premier système est relativement faible, environ 1 adénovirus recombinant par 1 000 cellules. Le travail effectué dans le cadre de cette thèse vise à construire un nouveau transfert de vecteur dans lequel l’expression de la protéase sera indépendante de celle du transgène permettant ainsi d’optimiser l’expression de la protéase. Ce travail d’optimisation a permis de réduire le phénomène de transcomplémentation du virus parental ce qui a fait grimper la diversité à 1 virus recombinant par 75 cellules. Ce système a été mis à l’épreuve en générerant une librairie adénovirale antisens dirigée contre la GFP. La diversité de cette librairie a été suffisante pour sélectionner un antisens réduisant de 75% l’expression de la GFP. L’amplification de ce vecteur adénoviral de première génération doit se faire dans une lignée cellulaire exprimant la région E1 telle que les cellules 293. Par contre, un adénovirus de première génération se répliquant dans les cellules 293 peut échanger, par recombinaison homologue, son transgène avec la région E1 de la cellule créant ainsi un adénovirus recombinant réplicatif (RCA), compromettant ainsi la pureté des stocks. Notre groupe a déjà breveté une lignée cellulaire A549 (BMAdE1) exprimant la région E1, mais qui ne peut pas recombiner avec le transgène du virus. Par contre, le niveau de réplication de l’adénovirus dans les BMAdE1 est sous-optimal, à peine 15-30% du niveau obtenu dans les cellules 293. Le travail fait dans le cadre de cette thèse a permis de mettre en évidence qu’une expression insuffisante d’E1B-55K était responsable de la mauvaise réplication du virus dans les BMAdE1. Nous avons produit de nouveaux clones à partir de la lignée parentale via une transduction avec un vecteur lentiviral exprimant E1B-55K. Nous avons confirmé que certains clones exprimaient une plus grande quantité d’E1B-55K et que ces clones amplifiaient de manière plus efficace un vecteur adénoviral de première génération. Ce clone a par la suite été adapté à la culture en suspension sans sérum. / The adenovirus has numerous interesting characteristics making this particular virus an ideal candidate for the construction of vector for conducting studies in functional genomics. The vast majority of those applications rely on a so-called “first-generation vector” in which the E1 region is replaced by a transgene. Despite all their advantages, there are 2 weak links associated with first-generation vector: the efficient construction of the actual vector and its production. Therefore, the development of alternative methods for construction and production is necessary to ensure their usefulness. The development will involve 2 axes: the reengineering of the transfer vector for the construction of recombinant adenovirus and the reengineering of the cell line capable of producing the vector. Using a transfer vector co-expressing the adenoviral protease (PS) gene and GFP by using an IRES under the control of a tetracycline-regulated promoter, our laboratory previously established the proof of concept that positive selection of recombinant adenovirus through ectopic expression of the PS gene was an efficient approach to generate adenoviral libraries. However, the diversity achieved was quite low, around 1 recombinant adenovirus per 1,000 cells. The goal of this thesis was to design a new transfer vector in which the PS expression was independent from the expression of the transgene in order to be able to optimize its expression independently. We also improved library diversity by lowering the amount of PS in order to reduce the the trans-complementation from the transfer vector. Using this method, at least 1 recombinant adenovirus per 75 cells was generated with 100% of the plaques being recombinant. This system was successfully used to generate an antisense library targeting GFP. The diversity of the library was high enough to allow the selection of an antisense that inhibited 75% of GFP expression. Amplification of those first-generation recombinant adenoviruses must take place in an E1-expressing cell such as 293 cells. However, when replicating in 293 cells, the recombinant adenovirus can exchange their transgene with the E1 region of the cell by homologous recombination, which results in the generation of a fully replicative adenovirus (RCA), a situation that compromises the purity of the viral preparation. Our laboratory has previously patented an A549 cell line expressing the E1 region and producing RCA-free recombinant adenovirus (BMAdE1). However, the replication of E1-deleted adenovirus in BMAdE1 cells was sub-optimal, in the range of 15-30% the level obtained in 293 cells. The work done in this thesis establishes that the low level of E1B-55K could be responsible for the lower productivity of BMAdE1 cells. Thus, we have derived new clones following lentiviral transduction in order to increase E1B-55K expression. Western blot confirmed that some clones expressed more E1B-55K than BMAdE1, and this correlated with a more robust replication of a recombinant adenovirus in those clones. This newly optimized BMAdE1 cell line was adapted to serum-free suspension culture.

Dans le cadre de cette thèse nous nous sommes intéressés à l'étude de l'évolution et de la variabilité génétique de la famille des butyrophilines (BTN), des récepteurs de la superfamille des immunoglobulines impliqués dans la régulation de la réponse immunitaire. Par une étude phylogénétique approfondie nous avons caractérisé chez les mammifères 14 groupes phylogénétiques résultant d'une série de duplications à partir de huit gènes ancestraux à la base des thériens. Par la suite, nous avons étudié l'évolution des BTN de la région CMH chez les primates et leur variabilité génétique dans les populations humaines par une analyse minutieuse des données de séquençage générées du projet 1000 Genomes pour plus de 1600 individus à travers le monde. Nous avons montré que l'évolution du gène BTNL2 est marquée par une pression de sélection positive diversifiante chez les mammifères qui est accompagnée chez les hominoïdes d'un niveau de polymorphisme élevé induisant la formation de variants tronqués de BTNL2. Chez l'homme, quatre lignages d'allèles ont été identifiés. Ils ont été maintenus à des fréquences intermédiaires par une forte sélection balancée. D'autre part, l'analyse phylogénétique détaillée du groupe BTN3 (BTN3A1, 3A2 et 3A3) a montré la présence d'une évolution concertée, caractérisée par une homogénéisation forte et récurrente de la région codant pour le peptide signale et le domaine IgV chez les hominoïdes, au cours de laquelle les séquences de 3A1 et 3A3 sont remplacées par la séquence de 3A2. Chez l'homme, ces gènes sont polymorphismes important avec plus de 46 allèles chacun, mais avec la présence d'une homogénéisation extrême des séquences du domaine IgV / In this thesis we were interested in studying the evolution and the genetic variability of the butyrophilin family (BTN), a family of immune receptors belonging to the immunoglobulin superfamily implicated in the regulation of immune response. Through a thorough phylogenetic study of the family we characterized 14 phylogenetic groups in mammals resulting from a series of duplications from eight ancestral genes at the base of therian. Thereafter, we studied the evolution of the BTN of the MHC region and their genetic variability in human populations by a careful analysis of sequencing data generated by the consortium 1000 Genomes for more than 1,600 individuals representing 26 populations worldwide. We have shown that the evolution of BTNL2 gene is marked by a positive diversifying selection in placental mammals. This selection pressure is accompanied in hominoids of a high level of polymorphism inducing the formation of truncated BTNL2 variants. In humans this high level of polymorphism results in the presence of four ancient allele lineages that are maintained at intermediate frequencies by a strong balancing selection. On the other hand, a detailed phylogenetic analysis of BTN3 group (BTN3A1, 3A2 and 3A3) showed that these genes evolve in hominoids in a concerted manner characterized by a strong and recurrent homogenization of the regions encoding for the peptide signal and the IgV domain in which the 3A1 and 3A3 sequences are replaced by the 3A2 sequence. In humans these genes are polymorphic with over 46 alleles each, but with the presence of extreme homogenization of IgV domain sequences

L'identification de régions génomiques cibles de la sélection naturelle positive permet de mieux comprendre notre passé évolutif et de trouver des variants génétiques fonctionnels importants. Puisque la fréquence des allèles sélectionnés augmente dans la population, la sélection laisse des traces sur les séquences d'ADN et ces empreintes sont détectées lorsque la variabilité génétique d'une région est différente de celle attendue sous neutralité sélective. On propose une nouvelle approche pour analyser les données de polymorphismes : le calcul des classes alléliques d’haplotypes (HAC), permettant d'évaluer la diversité globale des haplotypes en étudiant leur composition allélique. L'idée de l'approche est de déterminer si un site est sous sélection positive récente en comparant les distributions des HAC obtenues pour les deux allèles de ce site. Grâce à l'utilisation de données simulées, nous avons étudié ces distributions sous neutralité et sous sélection en testant l'effet de différents paramètres populationnels. Pour tester notre approche empiriquement, nous avons analysé la variation génétique au niveau du gène de lactase dans les trois populations inclues dans le projet HapMap. / Natural selection eliminates detrimental and favors advantageous phenotypes. This process leaves characteristic signatures in the underlying genomic segments that can be recognized through deviations in the allelic or in haplotypic frequency spectra. We introduce a new way of looking at the genomic single nucleotide polymorphisms : the haplotype allelic classes (HAC). The model combine segregating sites and haplotypic informations in order to reveal useful characteristics of the data, providing an identifiable signature of recent positive selection that can be detected by comparison with the background distribution. We compare the HAC distribution's partition between the haplotypes carrying the selected allele and the remaining ones. Coalescence simulations are used to study the distributions under standard population models assuming neutrality, demographic scenarios and selection models. To test, in practice, the performance of HAC and the derived statistic in capturing deviation from neutrality due to selection, we analyzed the genetic variation in the locus of lactase persistence in the three HapMap populations.

L’adénovirus possède plusieurs caractéristiques faisant de ce virus un candidat de choix pour la construction de vecteurs utiles dans les études de génomique fonctionnelle. Dans la majorité de ces applications, on a recours à un vecteur adénoviral de première génération délété de sa région E1. L’utilisation de vecteurs adénoviraux comprend deux maillons faibles : la construction du vecteur et la production subséquente de ce dernier. Le développement de méthodes alternatives est donc nécessaire pour renforcer ces deux maillons, permettant ainsi une utilisation étendue de ces vecteurs. Ce développement va s’articuler sur deux axes : l’ingénierie du vecteur de transfert pour la construction de l’adénovirus recombinant et l’ingénierie d’une lignée cellulaire pour la production du vecteur. En utilisant un vecteur de transfert adénoviral co-exprimant, à partir d’un promoteur régulable à la tétracycline, la protéase de l’adénovirus et une protéine de fluorescence verte (GFP) par l’intermédiaire d’un site d’entrée ribosomal interne (IRES), notre groupe a établi que la sélection positive, via l’expression ectopique de la protéase, est un processus efficace pour la création de librairie d’adénovirus recombinants. Par contre, la diversité atteinte dans ce premier système est relativement faible, environ 1 adénovirus recombinant par 1 000 cellules. Le travail effectué dans le cadre de cette thèse vise à construire un nouveau transfert de vecteur dans lequel l’expression de la protéase sera indépendante de celle du transgène permettant ainsi d’optimiser l’expression de la protéase. Ce travail d’optimisation a permis de réduire le phénomène de transcomplémentation du virus parental ce qui a fait grimper la diversité à 1 virus recombinant par 75 cellules. Ce système a été mis à l’épreuve en générerant une librairie adénovirale antisens dirigée contre la GFP. La diversité de cette librairie a été suffisante pour sélectionner un antisens réduisant de 75% l’expression de la GFP. L’amplification de ce vecteur adénoviral de première génération doit se faire dans une lignée cellulaire exprimant la région E1 telle que les cellules 293. Par contre, un adénovirus de première génération se répliquant dans les cellules 293 peut échanger, par recombinaison homologue, son transgène avec la région E1 de la cellule créant ainsi un adénovirus recombinant réplicatif (RCA), compromettant ainsi la pureté des stocks. Notre groupe a déjà breveté une lignée cellulaire A549 (BMAdE1) exprimant la région E1, mais qui ne peut pas recombiner avec le transgène du virus. Par contre, le niveau de réplication de l’adénovirus dans les BMAdE1 est sous-optimal, à peine 15-30% du niveau obtenu dans les cellules 293. Le travail fait dans le cadre de cette thèse a permis de mettre en évidence qu’une expression insuffisante d’E1B-55K était responsable de la mauvaise réplication du virus dans les BMAdE1. Nous avons produit de nouveaux clones à partir de la lignée parentale via une transduction avec un vecteur lentiviral exprimant E1B-55K. Nous avons confirmé que certains clones exprimaient une plus grande quantité d’E1B-55K et que ces clones amplifiaient de manière plus efficace un vecteur adénoviral de première génération. Ce clone a par la suite été adapté à la culture en suspension sans sérum. / The adenovirus has numerous interesting characteristics making this particular virus an ideal candidate for the construction of vector for conducting studies in functional genomics. The vast majority of those applications rely on a so-called “first-generation vector” in which the E1 region is replaced by a transgene. Despite all their advantages, there are 2 weak links associated with first-generation vector: the efficient construction of the actual vector and its production. Therefore, the development of alternative methods for construction and production is necessary to ensure their usefulness. The development will involve 2 axes: the reengineering of the transfer vector for the construction of recombinant adenovirus and the reengineering of the cell line capable of producing the vector. Using a transfer vector co-expressing the adenoviral protease (PS) gene and GFP by using an IRES under the control of a tetracycline-regulated promoter, our laboratory previously established the proof of concept that positive selection of recombinant adenovirus through ectopic expression of the PS gene was an efficient approach to generate adenoviral libraries. However, the diversity achieved was quite low, around 1 recombinant adenovirus per 1,000 cells. The goal of this thesis was to design a new transfer vector in which the PS expression was independent from the expression of the transgene in order to be able to optimize its expression independently. We also improved library diversity by lowering the amount of PS in order to reduce the the trans-complementation from the transfer vector. Using this method, at least 1 recombinant adenovirus per 75 cells was generated with 100% of the plaques being recombinant. This system was successfully used to generate an antisense library targeting GFP. The diversity of the library was high enough to allow the selection of an antisense that inhibited 75% of GFP expression. Amplification of those first-generation recombinant adenoviruses must take place in an E1-expressing cell such as 293 cells. However, when replicating in 293 cells, the recombinant adenovirus can exchange their transgene with the E1 region of the cell by homologous recombination, which results in the generation of a fully replicative adenovirus (RCA), a situation that compromises the purity of the viral preparation. Our laboratory has previously patented an A549 cell line expressing the E1 region and producing RCA-free recombinant adenovirus (BMAdE1). However, the replication of E1-deleted adenovirus in BMAdE1 cells was sub-optimal, in the range of 15-30% the level obtained in 293 cells. The work done in this thesis establishes that the low level of E1B-55K could be responsible for the lower productivity of BMAdE1 cells. Thus, we have derived new clones following lentiviral transduction in order to increase E1B-55K expression. Western blot confirmed that some clones expressed more E1B-55K than BMAdE1, and this correlated with a more robust replication of a recombinant adenovirus in those clones. This newly optimized BMAdE1 cell line was adapted to serum-free suspension culture.

Résumé : La biologie évolutive permet de comprendre et de retracer l'origine des espèces ou des populations, de comprendre leurs dispersions dans différentes zones et d'analyser les différentiations résultant de ces évolutions. L'invasion biologique et les espèces envahissantes en général sont de bons modèles pour étudier et comprendre l'adaptation à de nouveaux environnements. Plasmodium falciparum, un protozoaire parasite agent du paludisme, a envahit de nouvelles populations hôtes et de nouvelles espèces de vecteurs à plusieurs reprises. Notre objectif était d'étudier (i) l'introduction, l'origine et la distribution de P. falciparum dans des environnements radicalement différents : dans une nouvelle aire géographique tout d'abord (en Amérique du Sud) puis dans une nouvelle espèce hôte (chez les primates) et (ii) de déterminer les gènes potentiellement impliqués dans l'adaptation à ces nouveaux environnements. Ces questions ont été abordées à travers différentes approches réunissant des analyses de génétique des populations, de phylogéographie ainsi que des analyses phylogénétiques. Les résultats obtenus démontrent pour la première fois que, P. falciparum a été introduit par l'homme au moins à deux reprises en Amérique du Sud à partir de l'Afrique. Cette thèse a aussi permis de démontrer pour la première fois que ce parasite circule naturellement chez les primates non-humains. L'analyse des patrons de sélection sur des gènes candidats jouant un rôle dans l'invasion des hématies par le parasite a été réalisée afin de déterminer si des évolutions adaptatives particulières avaient opérées sur ces gènes dans ces nouveaux environnements. L'ensemble de nos résultats démontrent que P. falciparum peut être considéré comme une espèce envahissante et que ce parasite n'est en fait pas spécifique à l'homme. L'ensemble de notre travail nous a permis d'avancer dans la connaissance de ce modèle biologique en termes de stratégie d'émergence ou de réémergence dans différents environnements. Nos résultats soulignent les changements qui ont opéré dans la distribution géographique et l'émergence du spectre d'hôte utilisé par P. falciparum au cours de son histoire évolutive passée et présente ce qui peut laisser craindre d'autres évolutions à l'avenir.Mots clés : Invasion biologique, espèce invasive, parasite, origine, adaptation, sélection, maladies émergente, Plasmodium falciparum, Amérique du Sud, génétique des populations, phylogéographie, marqueurs moléculaires, singes. / Abstract: The evolutionary biology allows to understand and to trace the origin of species or populations, to understand their dispersions in different areas and analyse the resulting differentiation of these developments. The biological invasion and invasive species, in general, are good models to study and understand the adaptation to new environments. Plasmodium falciparum, a protozoan parasite, agent of the malaria, invades a new host and new vector species at several times. The objective of this thesis was to analyse (i) introduction, origin and distribution of P. falciparum in radically different environments; first, a new geographical area (South America); second, a new host species (in primates); and (ii) identify genes potentially involved in adaptation to new environments. I addressed these questions using different approaches, including population genetics, phylogeographic analyses, and also phylogenetic analyses. The results demonstrate for the first time, P. falciparum has been introduced by humans at least twice in South America from Africa. This thesis has also demonstrated for the first time that this parasite circulates naturally in nonhuman primates. The analysis of the patterns of the selection on candidate genes play a role in the invasion of erythrocytes by the parasite was performed to determine if adaptive evolutions were occur on these specific genes in these new environments. Overall, our results demonstrate that P. falciparum can be considered an invasive species and that parasite is not specific to humans. All of our work allowed us to advance in the knowledge of the biological model in terms of strategy emergence or reemergence in different environments. Our results highlight the changes that have taken place in the geographical distribution and the emergence of host range used by P. falciparum during its evolutionary history, past and present which may raise concerns of other developments in the future. Keywords : Biological invasion, invasive species, parasite, origin, adaptation, selection, emerging infectious diseases, Plasmodium falciparum, South America, population genetics, phylogeography, molecular markers, apes.

Les premières cellules progénitrices lympho-myéloïdes (LMPP) entrent dans le thymus et commencent leur processus de différenciation au stade double négatif (DN, CD4-CD8-). Après un réarrangement fonctionnel de la chaine bêta de leur récepteur des cellules T (RCT), les cellules reçoivent des signaux de différenciation, de prolifération, de survie et de sélection et passent au stade double positif (DP, CD4+CD8+). Ensuite, la chaine alpha du RCT est réarrangée et testée via les sélections positive et négative. Si le RCT reçoit un signal ni trop fort, ni trop faible, les cellules passent au stade simple positif où elles exprimeront soit la molécule CD4 ou CD8. ERK3, une MAPK non-conventionnelle, joue un rôle important dans le développement thymique. Des études précédentes ont démontré qu’une déficience en ERK3 diminue de 50 % la cellularité thymique et de 75% le nombre de cellules simples positives CD4 (CD4SP). Nous avons posé comme hypothèses qu’il y a une augmentation de l’apoptose chez les thymocytes DP de souris Erk3-/- et que cette déficience chez les thymocytes DP affecterait la sélection positive des cellules DP, réduisant ainsi le nombre de thymocytes CD4SP. Afin de vérifier la première hypothèse, nous avons regardé les niveaux d’apoptose grâce à la cytométrie en flux et par immunohistochimie. Dans les deux cas, nous étions incapables de détecter une différence du niveau d’apoptose chez les thymocytes DP entre les souris Erk3+/+ et Erk3-/-. Ensuite, nous nous sommes posés la question suivante : La demi-vie des thymocytes DP Erk3-/- était-elle plus courte que le type sauvage? La demi-vie des thymocytes DP a été mesurée à l’aide de l’étude des réarrangements secondaires de la chaine alpha du RCT par PCR semi-quantitatif et à l’aide de cultures de thymus fœtaux. En effet, ERK3 semble important pour prolonger la demi-vie des thymocytes DP. Ensuite, nous avons utilisé des marqueurs cellulaires différentiels (CD69, CD5 et RCT) pour regarder si les thymocytes DP sont capables de passer la sélection positive. En effet, il y a moins de thymocytes DP Erk3-/- qui sont CD69fort, CD5fort et RCTfort. Finalement, nous voulons savoir si les fonctions de ERK3 passent par MK5, son seul partenaire d’interaction connu à ce jour. Après la caractérisation du thymus de la souris Mk5-/-, nous observons que seulement la réduction du nombre de thymocytes CD4SP est identique à celle des thymocytes CD4SP de la souris Erk3-/-. En conclusion, ces résultats révèlent des fonctions importantes pour la molécule ERK3 lors du processus de sélection positive, le maintient de la demi-vie des thymocytes DP et lors de la régulation de développement thymique de manière MK5-dépendante et -indépendante. / Early thymic progenitor cells (ETP) enter the thymus and begin their differentiation process at the double negative (DN) stage, having no CD4 and CD8 expression. After a functional rearrangement of the beta chain of the T-cell receptor (TCR), the cells receive differentiation, proliferation, survival, and selection signals and pass to the double positive (DP) stage and acquire the expression of CD4 and CD8 molecules. Then, the TCR alpha chain is rearranged and the fully composed TCR is tested through positive and negative selection. If the TCR receives a signal that is just right (not too strong or too weak), the cells pass to the single-positive stage by acquiring either the CD4 or CD8 molecule. ERK3, an unconventional MAPK, plays an important role in thymic development. Previous studies have shown that a deficiency in ERK3 decreases by 50% the total thymic cellularity and by 75% the number of CD4 single- positive cells (CD4SP). We hypothesized that there is an increase in apoptosis in DP thymocytes of Erk3-/- mice for and that this deficiency would affect the positive selection of DP cells, resulting in a reduced number of CD4SP. To test the first hypothesis, we looked at apoptosis levels by flow cytometry and immunohistochemistry. In both cases, we were unable to detect a difference in the level of apoptosis in DP thymocytes from Erk3+/+ and Erk3-/- mice. We then made a second assumption, that the half-life of Erk3-/- DP thymocytes for was shorter, which was measured by secondary rearrangements of the RCT alpha chain by semi-quantitative PCR and cultures of fetal thymi. Indeed, ERK3 seems important to extend the half- life of DP thymocytes. Next, we used differential cell markers (CD69, CD5, and TCR) to see if the DP thymocytes are able to pass positive selection. Indeed, there are less DP thymocytes Erk3-/- that are CD69hi, CD5hi, and TCRhi. Finally, we wanted to know whether the functions of ERK3 passes through MK5, its only interacting partner known to date. After characterization of the thymus of Mk5-/- mice, we observe that only the reduction of CD4SP thymocytes is identical to that of CD4SP thymocytes of Erk3-/-mice. In conclusion, these results reveal important functions for the molecule ERK3 for maintaining the half-life of DP thymocytes, for the process of positive selection and for regulating T-cell development in a MK5-dependent and - independent manner.

Les chauve-souris représentant un réservoir important pour de nombreux virus pathogènes pour l’homme, un ensemble d’études en évolution moléculaire converge vers l’évidence d’une forte pression de sélection au niveau de gènes impliqués dans l’immunité dans l’ordre Chiroptera. En particulier, les chauves-souris du genre Pteropus hébergent des virus de la famille Henipavirus: Nipah et Hendra. Ces virus sont responsables d'épidémies en Asie du sud-est, et bien qu'ayant un taux d'incidence bas, les maladies résultantes de l'infection ont un taux de létalité allant de 40% à 90% chez l'homme. L’infection atteint aussi la plupart des mammifères avec des symptômes clinique graves, (e.g. porc ou cheval : espèces d’intérêt agronomique). La particularité du genre Pteropus est de ne pas développer ces symptômes cliniques graves d’infection. Afin d'en identifier les bases génétiques, nous avons utilisé l'analyse de sélection positive sur l’ensemble du génome codant sans restreindre notre analyse aux gènes de l’immunité. Nous avons mis en place les outils informatiques innovants et nécessaires au déploiement de cette démarche. Ces analyses, reposent sur des séquences de références pour les génomes de différentes espèces, et en absence du génome de référence pour P. giganteus, nous l’avons préalablement séquencé et assemblé. Or, tous les gènes sous sélection ne sont pas forcément liés à notre phénotype d’intérêt mais possiblement à d’autres (e.g. capacité de vol). Nous avons mis en place un algorithme afin d’établir un lien fonctionnel potentiel entre ces gènes identifiés sous sélection positive et un phénotype d’intérêt. / Bats represent a considerable reservoir for an extensive group of human pathogenic viruses. A number of molecular evolution studies points toward the evidence of a strong selection pressure in Chiroptera immune-related genes. Notably, Pteropus bats host viruses from Henipavirus genus: Nipah and Hendra. These viruses are responsible for epidemics in South-Est Asia, and, while the incidence is low, the resulting diseases are highly lethal, ranging between 40 to 90% in humans. Most of mammals are susceptible to the infection (including pigs and horses, animals valued in agronomy), and develop severe clinical symptoms. Specificity of Pteropus genus lies in the absence of clinical symptoms following the infection. In order to identify the genetic basis of this interesting phenomenon, we applied positive selection analysis to the entire coding genome, without bounding our analysis to immune-regulating genes. We have set breakthrough computational tools, without which our analysis would not have been possible. Reference sequences from genome of several species are the groundwork for our analysis. As P. giganteus reference genome has not yet been resolved, we sequenced and assembled it. However, not all genes under positive selection are necessarily linked to a phenotype of interest, but may be linked to other phenotypes (such as the flying ability). We have thus developed an algorithm to establish a possible functional link between the genes identified under positive selection and a phenotype of interest, which allows new perspectives in phylogenomic research.