Ziel der Dissertation ist die Entwicklung eines Perfusionsbioreaktors, um physiologische Zellnischen nachzuahmen und damit 3-dimensionale (3D) Knochenkonstrukte mit knochenähnlichen Eigenschaften zu erzeugen. Zukünftig sollen diese Konstrukte das klinische Ergebnis der Knochendefektheilung verbessern und die biomechanische Belastbarkeit wiederherstellen. Dazu sind neue 3D-Tissue-Engineering-Entwicklungen notwendig, weil die existierenden Zellkultivierungsgefäße übermäßig vereinfacht und nicht hinreichend sind.. Folglich werden in dieser Arbeit mehrere Technologien kombiniert, um physiologische Nischen zu schaffen und klinisch anwendbare Knochenkonstrukte in vitro abzuleiten.

Osteoarthritis is a prevalent disease that affects the articular cartilage of the joints. Millions of people suffer worldwide and it is a major cause of disability in the United States. Current research for treatments of osteoarthritis are studying tissue-engineered cartilage in vitro generated by articular chondrocytes. A challenge faced in vitro for cartilage tissue engineering is the failure of chondrocytes to produce adequate expression of type II collagen. Surprisingly, the media commonly used in vitro lacks 14 vitamins and minerals present in the physiological environment of chondrocytes. Therefore, studying the interactions between micronutrients and chondrocytes may help in potentially increasing the amount of type II collagen expressed by these cells. This project studied the combinatorial effects of vitamins and minerals in defined chondrogenic media on type II collagen expression. Linolenic acid was determined to have predominantly negative effects on chondrogenesis and Vitamin B7 to have beneficial effects. Multiple vitamins and minerals displayed significant interactions, both positive and negative.

Magnetic resonance imaging is a non-invasive imaging modality that is used to produce detailed images of soft tissues within the human body. Typically, MRI scanners used in the clinical setting are high field systems because they have a magnetic field strength greater than 1.5 Tesla. The high magnetic field offers the benefit of high spatial resolution and high SNR. However, low filed systems can also produce high resolution MR images with the added benefit of imaging stiffer samples. In this study, a low field 0.5 T MR system was used to image various samples to demonstrate the capability of the low field system in acquiring MR images with resolution comparable to high field systems. Furthermore, the MR system was modified to one capable of performing low field MR Elastography (MRE), a technique that can non-destructively measure the mechanical properties of soft samples. Agarose gel phantom of 0.5% wt. and 1.0% wt. were used to validate the MRE system. Additionally, a rat brain was used to assess the sensitivity of the MRE system in measuring the mechanical properties of small tissues. The results illustrated that the low field MR system can acquire high resolution images and provide sufficient tissue contrast (e.g through long TE times (80 ms), which is not possible with high field systems). MRE results on gel phantoms illustrated the capability of the low field system to accurately measure the mechanical properties and the MRE testing of rat brain demonstrated the potential of the system to study biological tissues. Finally, the capability of low field MRI and MRE to assess the growth of tissue engineered bone has the potential to transform the field of tissue engineering.

The development of treatments for neurological disorders such as Alzheimer’s and Parkinson’s disease begins by understanding what these diseases affect and the consequences of further manifestation. One particular region where these diseases can produce substantial problems is the blood-brain barrier (BBB). The BBB is the selective diffusion barrier between the circulating blood and the brain. The barrier’s main function is to maintain CNS homeostasis and protect the brain from the extracellular environment. The progression of BBB research has advanced to the point where many have modeled the BBB in vitro with aims of further characterizing and testing the barrier. Particularly, the pharmaceutical industry has gained interest in this field of research to improve drug development and obtain novel treatments for patients so the need for an improved model of the BBB is pertinent in their discovery. In the Cal Poly Tissue Engineering lab, an in vitro tissue engineered BBB system has previously been obtained and characterized for the initial investigation of the barrier and its components. However, certain limitations existed with use of the commercial system. Therefore, the focus of this thesis was to improve upon the capabilities and limitations of this commercialized system to allow further expansion of BBB research. The work performed was based on three aims: first to design and develop an in-house bioreactor system that could be used to cultivate the BBB; second, to characterize flow and functional capabilities of the bioreactor; third, to develop protocols for the overall use of the bioreactor, to ultimately allow co-cultures of BAEC and C6 glioma cells, and further the progression toward creating an in vitro model of the BBB. The work of this thesis demonstrates development of an in-house custom bioreactor system that can successfully culture cells. Results showed that the system was reusable, could be sterilized and monitored, was easily used by students trained in the laboratory, and allowed non-destructive scaffold extraction. This thesis also discusses the next set of experiments that will lead to an in vitro model of the BBB.

<p>Hemophilia B patients may have frequent, spontaneous and life-threatening bleeds that are currently managed by an invasive and expensive treatment. Mesenchymal stem cells (MSCs) are increasingly being applied to clinically therapeutic strategies and lentiviral gene vectors have been shown to be safe and efficient tools for modifying stem cells for long-term expression of high levels of transgenes. In this study, MSCs were engineered with a lentivirus to express sustained and therapeutic levels of human FIX protein <em>in vitro </em>and in mice. The modified MSCs secreted human FIX protein at levels exceeding 4 μg/10⁶ MSCs/24 h with high FIX coagulant activity of greater than 2.5 mIU/10⁶ MSCs/24 h for 6 week <em>in vitro. </em>Functional FIX transgene was continually expressed by these cells when they were induced to differentiate into adipocyte, osteoblast and chondrocyte lineages <em>in vitro</em>. However, the modified MSCs transplanted via tail vein into NOD-SCID-γ mice expressed low levels of FIX <em>in vivo</em>. The transplantation procedure had an increased risk of death that was more pronounced in mice that received cell doses exceeding 2 million cells. Organ examinations suggested the deaths resulted from entrapment of MSCs in pulmonary capillaries. Modified MSCs encapsulated in alginate-PLL microcapsules and transplanted into the peritoneal cavity of both NOD-SCID-γ and hemophilia B mice at 9 million cells/mouse resulted in therapeutic expression around 100 ng of human FIX/mL of plasma only for a few days <em>in vivo</em> as human FIX expression quickly decreased to basal values by the end of the first week. Cultured <em>ex vivo</em>, human FIX expression by retrieved capsules indicated an innate immune response to the encapsulated cells prevented sustained expression of FIX. These investigations demonstrate that lentivirally modified MSCs have the potential to express therapeutic human FIX for sustained periods <em>in vitro</em>, even after their differentiation. However, they also highlight the challenges to overcome to optimize cell engraftment and survival following transplantation, and to minimize the immune responses associated with the xenogeneic translational<em> </em>models used.</p> / Doctor of Philosophy (PhD)

Computational fluid dynamic models for porous lattice scaffolds are one of the few significant methods of determining the viability of a structure for in vivo applications. The most important property analyzed to determine this is fluid induced Wall Shear Stress (WSS) exhibited throughout the structure. This property has key ranges that are specifically identified and closely analyzed. Three different geometries, 2 TPMS structures and 1 non-TPMS structure are modeled and discussed. Three different models for each geometry are developed with porosities of 62, 70 and 80 percent. The Voronoi yields the best results, with WSS values well within the desired criteria for osteogenesis, minimizing cell death and detachment, and maximizing osteoblast and osteocyte generation. The outcome of this thesis helps reinforce the Voronoi lattice structure in bone tissue engineering applications. Further in vitro and in vivo experimentation is required to verify the results of this CFD analysis.

Aufgrund der steigenden Lebenserwartung und des damit verbundenen demographischen Wandels sind muskuloskelettale Erkrankungen, die mit lokalisierten Knochendefekten einhergehen, der zweithäufigste Faktor für funktionelle Einschränkungen und wirtschaftliche Belastungen der nationalen Gesundheitssysteme (Vos et al., 2017). Traumata, Infektionen, Tumore, angeborene Fehlbildungen und degenerative Erkrankungen können zu sogenannten kritischen Knochendefekten führen, die eine Behandlung mittels autologer Knochentransplantation erforderlich machen (Gómez-Barrena et al., 2015). Der dabei entstehende Entnahmedefekt und der zusätzliche chirurgische Eingriff erhöhen das Risiko für anhaltende Schmerzen, Nervenverletzungen, Frakturen und Infektionen. Die Züchtung von künstlichem Gewebe (Tissue Engineering) ist ein vielversprechender alternativer Ansatz zur dauerhaften Heilung von Gewebedefekten. Mesenchymale Stammzellen (engl.: mesenchymal stem cells - MSC), die auf ein künstliches Gerüst aufgebracht werden, sind in der Lage, sich ex vivo vermehrt zu teilen und sich in das entsprechende Gewebe zu entwickeln, wenn sie einem biochemischen oder mechanischen Differenzierungsreiz ausgesetzt werden (Caplan und Bruder, 2001; Caetano-Silva et al., 2019). Voraussetzung für die Anwendung im klinischen Kontext ist die Verwendung großformatiger Scaffolds. Eines der Hauptziele dieser Studie war es, die Auswirkungen dynamischer in vitro Besiedlungsmethoden auf die Besiedlungseffizienz und die Zellverteilung zu untersuchen. Dynamische Perfusions- und Rotationskolonisation wurden mit statischer Kolonisation verglichen. Aufgrund des hohen Scaffoldvolumens nimmt die Bedeutung der initialen Zelldichte für die Zellverteilung und Besiedlungseffizienz zu. Bei vergleichsweise geringen Ausgangszelldichten 0,8 ∙ 106 Zellen / cm3 konnte eine um bis zu 32 % verbesserte Besiedlungseffizienz durch dynamische Verfahren im Vergleich zu statischen Verfahren gezeigt werden. Jede Besiedlungsmethode zeigte eine unterschiedliche räumliche Verteilung der hTERT-MSC auf den BCB- und β-TCP-Scaffolds in Abhängigkeit von der verwendeten Scaffoldstruktur. Die rotierende Besiedlung erwies sich für beide Scaffolds als vorteilhaft. Es wurde ein universelles Protokoll für die effiziente und teilautomatisierte Besiedlung großer Scaffolds entwickelt. Neben verschiedenen Kultivierungsverfahren (Rauh et al., 2011) ermöglicht die Durchströmung des Scaffolds im Perfusionsbioreaktor die Versorgung und Stimulation der mesenchymalen Zellen in osteogener Richtung (Ando et al., 1988) und den Abtransport toxischer Nebenprodukte. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Bioreaktorsystem (Milan, 2010) optimiert, das die Herstellung großflächiger Implantate aus autologen Zellen für die Knochenregeneration ermöglicht. Eine gezwungene Perfusion direkt durch das Knochengerüst sorgte für eine gleichmäßige Versorgung der MSC im gesamten Gerüst, die mit Sauerstoffsensoren online verfolgt wurde. Die kontinuierliche Sauerstoffmessung im Zentrum der statisch kultivierten Scaffolds diente als Prozessleitparameter und zeigte bereits am Tag 6 eine Unterversorgung bei einem Sauerstoffgehalt von 1% an. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zeigten am Tag 14 deutlich nekrotische Zonen im Inneren des Scaffolds, die aus der Sauerstoffunterversorgung resultierten. Im Gegensatz dazu wurde im Perfusionsbioreaktorsystem ein normoxischer Sauerstoffgehalt von 20 % aufrechterhalten. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zeigten nach 14 Tagen dynamischer Perfusionskultur ausschließlich vitale Zellen. Diese Einführung eines Leitparameters und die Anpassung des Perfusionsbioreaktorsystems sind wichtige Voraussetzungen für die Skalierung des Tissue Engineering von Knochen in klinisch relevante Scaffoldgrößen. Die Segmentierung der Proben ermöglichte neben der Untersuchung der Zellverteilung auch die Untersuchung der Genexpression und der osteogenen Differenzierung der MSC. Im Vergleich zur statischen Kultur zeigte die dynamische Kultur eine Tendenz zu einer stärkeren osteogenen Differenzierung (66 %). Gleichzeitig war die Zellzahl mit 63 % signifikant niedriger. Die parallele Verwendung kleinerer Scaffolds ermöglicht die Untersuchung geeigneter Randbedingungen, verschiedener Zelltypen und die Optimierung der Prozessparameter bei geringerem Materialeinsatz. So konnte gezeigt werden, dass der Einfluss der Perfusionsrate vom verwendeten Zelltyp abhängt. Dabei profitieren robustere Zellpopulationen von höheren Perfusionsraten, während mittlere Perfusionsraten universell eingesetzt werden können. Auch eine Abhängigkeit von der Zelldichte konnte beobachtet werden. Dies legt eine gezielte Anpassung des Perfusionsregimes in Abhängigkeit vom Wachstums- und Differenzierungsstadium der MSC nahe. Aktuelle Studien zeigen, dass eine Vorhersage der optimalen Prozessparameter mit Hilfe von Simulationen möglich und sinnvoll ist (McCoy und O’Brien, 2012; Zhao et al., 2019). Die Herstellung komplexerer oder gar individualisierter Scaffolds ist eine wichtige Voraussetzung für die Translation in die klinische Anwendung. In einem Proof of Concept konnte gezeigt werden, dass 3D-gedruckte Strukturen mit dem Perfusionssystem erfolgreich kultiviert werden können. Die Co-Kultivierung von Knochenvorläuferzellen zusammen mit vaskulären Vorläuferzellen zeigt positive Tendenzen zu einer verbesserten Proliferation und Differenzierung. Durch Optimierung der Prozessparameter sind hier weitere Verbesserungen zu erwarten. Ein optimiertes Protokoll ermöglichte die effiziente Zellbesiedlung von groß dimensionierten Scaffolds. Das speziell für diese Dimensionen konzipierte Bioreaktorsystem gewährleistete eine konstante Versorgung der MSC auch innerhalb des Scaffolds. Durch die kontinuierliche Messung des Sauerstoffgehaltes wurde ein Leitparameter etabliert, der durch eine optimierte Endpunktanalyse validiert wurde. Die in dieser Arbeit beschriebenen Methoden und Werkzeuge ermöglichen die Kultivierung von vitalem Knochenersatzmaterial in klinisch relevanten Größen.:1 Motivation 2 Grundlagen 2.1 Knochen 2.1.1 Knochenaufbau 2.1.2 Knochenumbau und Knochenregeneration 2.1.3 Knochendefekte und Knochenheilung 2.1.4 Kritischer Knochendefekt 2.1.5 Therapieansätze zur Behandlung von Knochendefekten 2.2 Knochen-Tissue Engineering (TE) 2.2.1 Mesenchymale Stammzellen 2.2.2 Differenzierungsfaktoren 2.2.3 Scaffolds für die Knochenregeneration 2.2.4 Vaskularisierung kritischer Knochendefekte 2.3 Bioreaktoren zur dynamischen Kultivierung von Knochengewebe 2.3.1 Strömungsbasierte Systeme 2.3.2 Weitere Bioreaktorsysteme 3 Material und Methoden 3.1 Materialien, Geräte und Software 3.1.1 Scaffolds 3.1.2 Geräte und Software 3.1.3 Werkstoffe 3.1.4 Verwendete Bioreaktoren 3.1.5 Sauerstoffsensor 3.1.6 Schneidevorrichtung 3.2 Zellkulturtechniken 3.2.1 Zellkulturmedien 3.2.2 Zelltypen 3.2.3 Kultivierung von MSC 3.3 Versuchsaufbau 3.3.1 Optimierung der Besiedlungsmethode 3.3.2 Theoretische Ermittlung der optimalen Durchflussgeschwindigkeit 3.3.3 Funktionstest Bioreaktor 3.3.4 Optimale Durchflussrate für große Scaffolds 3.3.5 Optimale Durchflussrate für kleine Scaffolds 3.3.6 Tissue Engineering von Rapid Prototyping Konstrukten 3.4 Zellquantifizierung und -differenzierung 3.4.1 Direkte Bestimmung der Zellzahl und der Besiedlungseffizienz 3.4.2 Quantifizierung der DNA 3.4.3 Bestimmung der LDH-Aktivität 3.4.4 Nachweis der osteogenen Differenzierung 3.4.5 Quantitative real-time PCR Analyse 3.5 Mikroskopie 3.5.1 Histologische Untersuchung der besiedelten Spongiosa 3.5.2 Live/Dead-Färbung 3.5.3 Rasterelektronenmikroskopie zur Bestimmung der Zellverteilung im Scaffold 4 Versuchsergebnisse 4.1 Visualisierung und Analyse von großen TE-Konstrukten 4.1.1 Sauerstoffmessung 4.1.2 Segmentierung der Proben 4.2 Optimierung Bioreaktorsystem 4.2.1 Überarbeitung Bioreaktorkammer 4.2.2 Teilautomatisierung Bioreaktorsystem 4.3 Besiedlungsmethoden für große TE-Konstrukte 4.3.1 Adhärenz 4.3.2 Besiedlungseffizienz 4.3.3 Zellverteilung 4.4 Erprobung eines Perfusionsbioreaktors mit online Sauerstoffmessung 4.4.1 Verteilung und Vitalität 4.4.2 Sauerstoffgehalt 4.4.3 Zellwachstum und Differenzierung 4.5 Bestimmung der optimalen Strömungsgeschwindigkeit 4.5.1 Optimale Druchflussrate für kleine TCP-Scaffolds 4.5.2 Simulation 4.5.3 Optimale Durchflussrate für große TCP-Scaffolds 4.6 Tissue Engineering von Rapid Prototyping Konstrukten 4.6.1 Zellverteilung, -vitalität und -adhärenz 4.6.2 Zellzahl 4.6.3 Sauerstoffkonzentration 5 Diskussion 5.1 Zellexpansion von MSC mit Hilfe von Bioreaktoren 5.2 Besiedlung verschiedener Scaffoldstrukturen 5.2.1 Besiedlungsmethode 5.2.2 Initiale Zelldichte 5.2.3 Zellverteilung 5.2.4 Besiedlungseffizienz 5.2.5 Scaffoldstruktur 5.2.6 Verhältnis Suspensionsvolumen zu Porosität 5.3 Perfusionsbioreaktoren für die Herstellung von Tissue Engineering Konstrukten 5.4 Erprobung eines Perfusionsbioreaktors mit online Sauerstoffmessung 5.4.1 Technische Herausforderungen 5.5 Optimale Druchflussrate für kleine TCP-Scaffolds 5.5.1 Scale-up der Scaffoldstruktur 5.5.2 Parameter in Perfusionsbioreaktorsystemen 5.5.3 Vergleich von Versuchsparametern 5.5.4 Identifikation von Leitparametern 5.5.5 Simulation für präzise Parametervorhersage 5.5.6 Regelung von Prozessparametern 6 Zusammenfassung 7 Literaturverzeichnis 8 Bilderverzeichnis 9 Tabellenverzeichnis / Due to increasing life expectancy and the associated demographic change, disorders of the musculoskeletal system associated with localized bone defects are the second most common factor for functional limitations and economic burdens on national healthcare systems (Vos et al., 2017). Trauma, infection, tumors, congenital malformations and degenerative diseases can lead to so-called critical bone defects that require treatment by autologous bone grafting (Gómez-Barrena et al., 2015). The resulting harvesting defect and the additional surgery increase the risk of persistent pain, nerve injury, fractures and infection. The cultivation of artificial tissue (tissue engineering) is a promising alternative concept for the sustainable healing of tissue defects. Mesenchymal stem cells (MSCs) applied to an artificial structure are capable of dividing to a greater extent ex vivo and developing into the corresponding tissue when exposed to a biochemical or mechanical differentiation stimulus (Caplan and Bruder, 2001; Caetano-Silva et al., 2019) The use of large-scale scaffolds is a prerequisite for their application in a clinical context. One of the primary objectives of this study was to investigate the effects of dynamic in vitro colonisation methods on colonisation efficiency and cell distribution. Dynamic perfusion and rotational colonisation were compared to static colonisation. Due to the high scaffold volume, the importance of the initial cell density for cell distribution and colonisation efficiency increases. At a comparatively low initial cell density of 0,8 ∙ 106 cells / cm3, dynamic methods showed an improvement in colonisation efficiency of up to 32% compared to static methods. Each colonisation method showed a different spatial distribution of hTERT-MSCs on the BCB and β-TCP scaffolds, depending on the scaffold structure used. Rotational colonisation proved advantageous for both scaffolds. A universal protocol for efficient and semi-automated colonisation of large scaffolds was developed. In addition to various cultivation methods (Rauh et al., 2011), the flow through the scaffold in the perfusion bioreactor allows the supply and stimulation of mesenchymal cells in the osteogenic direction (Ando et al., 1988) and the removal of toxic by-products. In the present study, a bioreactor system (Milan, 2010) was optimised for the production of large-area implants from autologous cells for bone regeneration. Forced perfusion directly through the bone scaffold ensured a uniform oxygen supply to the MSCs throughout the scaffold, which was monitored online using oxygen sensors. Continuous oxygen measurement in the centre of the statically cultured scaffolds served as a process control parameter and indicated an undersupply at an oxygen content of 1% as early as day 6. Fluorescence microscopy on day 14 clearly showed necrotic zones inside the scaffold resulting from the oxygen deficiency. In contrast, a normoxic oxygen level of 20% was maintained in the perfusion bioreactor system. Fluorescence microscopy revealed only viable cells after 14 days of dynamic perfusion culture. The introduction of a control parameter and the adaptation of the perfusion bioreactor system are important prerequisites for scaling up bone tissue engineering to clinically relevant scaffold sizes. The segmentation of the samples allowed the study of gene expression and osteogenic differentiation of the MSC in parallel with the study of cell distribution. Compared to static culture, dynamic culture showed a 66% trend towards greater osteogenic differentiation. At the same time, the cell count was significantly lower by 63%. The parallel use of smaller scaffolds allows the investigation of suitable boundary conditions, different cell types and the optimisation of process parameters with less material input. It has been shown that the influence of the perfusion rate depends on the cell type used. More robust cell populations benefit from higher perfusion rates, while medium perfusion rates can be used universally. A dependence on cell density was also observed. This suggests a targeted adaptation of the perfusion regime based on the growth and differentiation stage of the MSC. Recent studies show that it is possible and useful to predict the optimal process parameters using simulations (McCoy and O'Brien, 2012; Zhao et al., 2019). The production of more complex or even customised scaffolds is an important prerequisite for translation into clinical application. A proof-of-concept study has shown that 3D printed structures can be successfully cultured using the perfusion system. The co-culture of bone progenitor cells with vascular progenitor cells shows positive trends towards better proliferation and differentiation. Further increases can be expected with optimisation of the process parameters. An optimised protocol allowed efficient cell colonisation of large scaffolds. The bioreactor system, specially designed for these dimensions, ensured a constant supply of oxygen to the MSCs inside the scaffold. By continuously measuring the oxygen content, a control parameter was established and validated by an optimised endpoint analysis. The methods and tools described in this thesis enable the cultivation of vital bone substitute materials in clinically relevant sizes.:1 Motivation 2 Grundlagen 2.1 Knochen 2.1.1 Knochenaufbau 2.1.2 Knochenumbau und Knochenregeneration 2.1.3 Knochendefekte und Knochenheilung 2.1.4 Kritischer Knochendefekt 2.1.5 Therapieansätze zur Behandlung von Knochendefekten 2.2 Knochen-Tissue Engineering (TE) 2.2.1 Mesenchymale Stammzellen 2.2.2 Differenzierungsfaktoren 2.2.3 Scaffolds für die Knochenregeneration 2.2.4 Vaskularisierung kritischer Knochendefekte 2.3 Bioreaktoren zur dynamischen Kultivierung von Knochengewebe 2.3.1 Strömungsbasierte Systeme 2.3.2 Weitere Bioreaktorsysteme 3 Material und Methoden 3.1 Materialien, Geräte und Software 3.1.1 Scaffolds 3.1.2 Geräte und Software 3.1.3 Werkstoffe 3.1.4 Verwendete Bioreaktoren 3.1.5 Sauerstoffsensor 3.1.6 Schneidevorrichtung 3.2 Zellkulturtechniken 3.2.1 Zellkulturmedien 3.2.2 Zelltypen 3.2.3 Kultivierung von MSC 3.3 Versuchsaufbau 3.3.1 Optimierung der Besiedlungsmethode 3.3.2 Theoretische Ermittlung der optimalen Durchflussgeschwindigkeit 3.3.3 Funktionstest Bioreaktor 3.3.4 Optimale Durchflussrate für große Scaffolds 3.3.5 Optimale Durchflussrate für kleine Scaffolds 3.3.6 Tissue Engineering von Rapid Prototyping Konstrukten 3.4 Zellquantifizierung und -differenzierung 3.4.1 Direkte Bestimmung der Zellzahl und der Besiedlungseffizienz 3.4.2 Quantifizierung der DNA 3.4.3 Bestimmung der LDH-Aktivität 3.4.4 Nachweis der osteogenen Differenzierung 3.4.5 Quantitative real-time PCR Analyse 3.5 Mikroskopie 3.5.1 Histologische Untersuchung der besiedelten Spongiosa 3.5.2 Live/Dead-Färbung 3.5.3 Rasterelektronenmikroskopie zur Bestimmung der Zellverteilung im Scaffold 4 Versuchsergebnisse 4.1 Visualisierung und Analyse von großen TE-Konstrukten 4.1.1 Sauerstoffmessung 4.1.2 Segmentierung der Proben 4.2 Optimierung Bioreaktorsystem 4.2.1 Überarbeitung Bioreaktorkammer 4.2.2 Teilautomatisierung Bioreaktorsystem 4.3 Besiedlungsmethoden für große TE-Konstrukte 4.3.1 Adhärenz 4.3.2 Besiedlungseffizienz 4.3.3 Zellverteilung 4.4 Erprobung eines Perfusionsbioreaktors mit online Sauerstoffmessung 4.4.1 Verteilung und Vitalität 4.4.2 Sauerstoffgehalt 4.4.3 Zellwachstum und Differenzierung 4.5 Bestimmung der optimalen Strömungsgeschwindigkeit 4.5.1 Optimale Druchflussrate für kleine TCP-Scaffolds 4.5.2 Simulation 4.5.3 Optimale Durchflussrate für große TCP-Scaffolds 4.6 Tissue Engineering von Rapid Prototyping Konstrukten 4.6.1 Zellverteilung, -vitalität und -adhärenz 4.6.2 Zellzahl 4.6.3 Sauerstoffkonzentration 5 Diskussion 5.1 Zellexpansion von MSC mit Hilfe von Bioreaktoren 5.2 Besiedlung verschiedener Scaffoldstrukturen 5.2.1 Besiedlungsmethode 5.2.2 Initiale Zelldichte 5.2.3 Zellverteilung 5.2.4 Besiedlungseffizienz 5.2.5 Scaffoldstruktur 5.2.6 Verhältnis Suspensionsvolumen zu Porosität 5.3 Perfusionsbioreaktoren für die Herstellung von Tissue Engineering Konstrukten 5.4 Erprobung eines Perfusionsbioreaktors mit online Sauerstoffmessung 5.4.1 Technische Herausforderungen 5.5 Optimale Druchflussrate für kleine TCP-Scaffolds 5.5.1 Scale-up der Scaffoldstruktur 5.5.2 Parameter in Perfusionsbioreaktorsystemen 5.5.3 Vergleich von Versuchsparametern 5.5.4 Identifikation von Leitparametern 5.5.5 Simulation für präzise Parametervorhersage 5.5.6 Regelung von Prozessparametern 6 Zusammenfassung 7 Literaturverzeichnis 8 Bilderverzeichnis 9 Tabellenverzeichnis

Tato diplomová práce se zabývá tkáňovým inženýrstvím, zejména tvorbou homogenní, izotropní a planární vrstvy buněk srdečního svalu pomocí dvou technologii:”scaffold-based” a ”scaffold-free”. Nejprve popsaný histologie srdeční stěny, buňky srdečního svalu a buněčné kultury. Následuje popis tkáňového inženýrství, který zahrnuje technologii “cell sheet” a tkáňové inženýrství na bázi scaffoldů. Na konci teoretické části je popsána aplikace tkáňového inženýrství a buněčná vizualizace. Praktická část věnovaná tvorbě planární buněčné vrstvy z kardiomyocytů a fibroblastů s využitím informací z teoretické části.

Les pathologies musculo-squelettiques affectant les os et les articulations demeurent un défi pour la médecine régénératrice. Les difficultés retrouvées sont liées aux besoins d’une vascularisation tissulaire optimale pour les substituts osseux et à l’obtention d’un cartilage de qualité pour les substituts articulaires. Les objectifs de ces travaux de thèse étaient de parvenir à différencier des cellules souches mésenchymateuses (CSM) ombilicales humaines – outil de choix en médecine régénérative - vers un phénotype vasculaire et un phénotype chondrogénique articulaire pour répondre aux besoins de l’ingénierie tissulaire musculo-squelettique. La différenciation de CSM ombilicales en cellules musculaires lisses vasculaires a été montrée après 12 jours de stimulation par des facteurs solubles comme le transforming growth factor (TGF)-beta1 et l’acide ascorbique. Face aux limites des supports de culture en deux dimensions in vitro, un modèle de culture tridimensionnel a été mis en place à l’aide de CSM cultivées en “pellets” en présence ou non d’une solution matrice extracellulaire (MEC) ombilicale pour les expériences suivantes. Les facteurs solubles disposant d’une efficacité limitée et étant souvent onéreux, une transduction des “pellets” de CSM-GW a été réalisée à l’aide de virus adéno-associés recombinants (rAAV) permettant une synthèse de facteurs par les cellules à plus long terme. Ici, les pellets ont été transduits à l’aide de rAAV contenant le gène du facteur de transcription Sox9 afin d’induire une différenciation chondrogénique articulaire. Ces travaux démontrent l’intérêt d’associer la MEC et les CSM ombilicales humaines dans un modèle de culture en trois dimensions, ainsi que les outils de thérapie génique comme les rAAV pour constituer des implants utilisables pour régénérer les tissus musculo-squelettiques / Musculoskeletal conditions affecting bones and joints remain a challenge for regenerative medicine. The difficulties found are related to the needs of an optimal tissue vascularization for bone substitutes and to obtain a cartilage of quality for articular substitutes. The objectives of this PhD work were to differentiate human umbilical mesenchymal stem cells (MSC) - a tool of choice in regenerative medicine - towards a vascular phenotype and a joint chondrogenic phenotype to meet the needs of musculoskeletal tissue engineering. The differentiation of umbilical MSC into vascular smooth muscle cells was shown after 12 days of stimulation by soluble factors such as transforming growth factor (TGF)-beta1 and ascorbic acid. Facing the limits of two-dimensional culture supports in vitro, a three-dimensional culture model was set up using MSC cultured in pellets with or whitout an umbilical extracellular matrix (ECM) solution for the following experiences. Soluble factors have a limited efficacy and are often expensive, a transduction of MSC pellets was performed using recombinant adeno-associated viruses (rAAV) allowing a long term synthesis of factors by the cells. Here, the pellets were transduced using rAAV containing the Sox9 transcription factor gene to induce articular chondrogenic differentiation. This work demonstrates the interest of associating ECM and human umbilical MSC in a three-dimensional culture model, as well as gene therapy tools such as rAAVs to provide grafts that can be used to regenerate musculoskeletal tissues / Muskel- und Skeletterkrankungen an Knochen und Gelenken bleiben eine Herausforderung für die regenerative Medizin. Die Schwierigkeiten stehen im Zusammenhang mit den Ansprüchen einer optimalen Gewebevaskularisierung der Knochenersatzstoffe und damit, einen qualitativ hochwertigen Knorpel für den Gelenkersatz zu erhalten. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, humane mesenchymale Stammzellen (MSZ) aus der Nabelschnur, die das Werkzeug der Wahl in der regenerativen Medizin sind, in einen vaskulären und in einen chondrogenen Phänotyp zu differenzieren, um den Anforderungen des muskuloskeletalen Tissue Engineerings zu entsprechen. Die Differenzierung von Nabelschnur-MSZ in vaskuläre glatte Muskelzellen konnte durch Stimulation mit löslichen Faktoren wie dem Transforming Growth Factor (TGF)-beta1 und Ascorbinsäure nach 12 Tagen gezeigt werden. Angesichts der Grenzen einer zweidimensionalen Zellkultur in vitro, wurde ein dreidimensionales Kulturmodell, in dem MSZ in Pellets mit oder ohne extrazelluläre Matrix der Nabelschnur (EZM) kultiviert wurden, für die weiteren Versuche erstellt. Lösliche Faktoren haben eine limitierte Wirksamkeit und sind häufig teuer. Deshalb wurden die MSZ-Pellets mit rekombinanten Adeno-assoziierte Viren (rAAV) transduziert, was eine Synthese der Faktoren durch die Zellen über einen längeren Zeitraum ermöglicht. In unserem Fall wurden die Pellets mit rAAV, die das Transkriptionsgen Sox9 enthalten, tranzduziert, um eine artikuläre chondrogene Differenzierung zu induzieren. Diese Arbeit zeigt, dass es von Interesse ist EZMs und humane Nabelschnur-MSZ in einem dreidimensionalen Kulturmodell zu vereinen. Auch wird gezeigt, dass Werkzeuge der Gentherapie wie rAAVs, die den Transplantaten zugeführt werden, helfen können muskuloskeletales Gewebe zu regenerieren

The skin provides protection and maintains homeostasis, making it essential for survival. Additionally, skin has the impressive ability to grow, as observed in children as they grow into adults. However, skin functions are compromised in large skin defects, a serious problem that can be fatal. The gold standard treatment is to use an autologous skin graft; however, due to donor site morbidity and limited availability, when full-thickness defects surpass 2% total body surface area (TBSA), skin substitutes are preferred. Unfortunately, current skin substitutes on the market: are slow to revascularize (2+ weeks), have low graft survival rates (<50% take), and lead to significant scarring and contracture. Fortunately, a promising solution is to prevascularize engineered skin substitutes in vitro, which has been shown to facilitate rapid tissue integration upon grafting by providing an intact vascular network that readily connects to the host’s circulation. However, current approaches for prevascularizing tissue constructs require long in vitro culture times or implement low extracellular matrix (ECM) density tissue constructs – both which are problematic in a clinical setting. To address this, we implemented a novel multitissue interface culture model to define the design parameters that were essential for rapid vascularization of soft tissue constructs in vitro. Here, we identified endothelial colony forming cell (ECFC) density and maintenance of cell-matrix tensional forces as important factors for rapid in vitro tissue vascularization (18% vessel volume percentage after 3 days of culture). We then applied these parameters to achieve rapid in vitro vascularization of dense, oligomer tissue constructs (12, 20, and 40 mg/mL). We demonstrated, for the first time, rapid in vitro vascularization at 3 days within dense matrices (ECM concentration > 10 mg/mL). Lastly, a rat full-thickness excisional wound model was developed to determine the acellular densified oligomer’s (20 and 40 mg/mL) ability to resist wound contraction and facilitate a wound healing response (recellularization and vascularization) when grafted into wounds. Future work will implement the vascularized, dense tissue constructs into the developed animal model to assess the vascularized graft’s efficacy on treating wounds to reduce scarring and contracture outcomes.