No description available.

[EN] Plant viruses are obligate intracellular parasites which were used to develop recombinant plant virus vectors to express heterologous proteins and to modify endogenous metabolic pathways of natural products in plants. The main limitation of many plant virus-based systems is the difficulty to co-express various heterologous proteins in the same cell with proper subcellular localization, which is a crucial question in metabolic engineering. This work provides a solution to overcome this problem by using a potyvirus-based vector system. Potyviruses (genus Potyvirus, family Potyviridae) are plus-strand single-stranded RNA viruses, which have a genome expression strategy that allows the equimolar production of most viral proteins. On the basis of an infectious clone of Tobacco etch virus (TEV), Bedoya et al. (2010) developed an expression system in which the RNA-dependent RNA polymerase (NIb) gene was replaced by an expression cassette, harboring several heterologous proteins. This viral vector was able to express three fluorescent proteins with nucleocytoplasmic localization in equimolar amounts in transgenic tobacco plants in which NIb was supplemented in trans. Despite of the apparent simplicity of potyvirus genome expression strategy, foreign cDNA insertion is a complicated task. Thus, our first goal was to analyze the effect of gene insertion on TEV genome stability. As a result of this work, a novel insertion position was discovered at the amino-terminal end of the potyvirus polyprotein, which opened the possibility to explore new questions of recombinant protein expression. Since metabolic pathways are highly compartmentalized, proper subcellular targeting of enzymes is an essential task. Thus, our second objective centralized on the subcellular targeting of expressed proteins from the TEV-based viral vector. cDNAs coding for the green fluorescent protein (GFP) fused to chloroplast, nucleus and mitochondria targeting signal sequences were inserted into the newly described amino-terminal insertion position or into an internal site, replacing the NIb cistron. Our results showed that for protein delivery to chloroplasts and mitochondria, foreign genes have to be inserted at the amino-terminal site of the viral vector, but for nuclear delivery, both insertion positions are suitable. The last objective of this work was to investigate whether the potyvirus-based vector was able to express an entire heterologous multistep biosynthetic pathway in plant cells. For this aim we purposed to produce lycopene, a plant pigment with health promoting properties. To do so, we inserted cDNAs coding for the enzymes of a three-step metabolic pathway of bacterial origin into the potyvirus-based vector. Infected tobacco plants developed orange symptoms indicating lycopene accumulation, which was confirmed by high-performance liquid chromatography analysis and microscopy observations. Our results also illustrated that the sole expression of Pantoea ananatis phytoene synthase, crtB, is enough to induce carotenoid accumulation, conferring yellow coloration to the infected tissue and serves as reporter system to visually track viral infection in several plant species. / [ES] Los virus de plantas son parásitos intracelulares obligados que han sido utilizados para desarrollar vectores virales y expresar proteínas heterólogas y modificar rutas metabólicas endógenas de productos naturales. La principal limitación de muchos sistemas basados en virus de plantas es la dificultad de coexpresar diversas proteínas heterólogas en la misma célula con la localización subcelular apropiada, lo cual es una cuestión crucial en ingeniería metabólica. Este trabajo presenta una solución para superar este problema mediante el uso de un vector viral basado en un potyvirus. Los potyvirus (género Potyvirus, familia Potyviridae) son virus de RNA de cadena positiva simple que tienen una estrategia de expresión génica que permite la producción de la mayoría de las proteínas virales en cantidades equimolares. Basado en un clon infeccioso del virus del grabado del tabaco (Tobacco etch virus, TEV) Bedoya et al. (2010) desarrollaron un sistema de expresión en el que el gen de la RNA polimerasa dependiente de RNA (NIb) fue sustituido por un casete de expresión, que albergaba varias proteínas heterólogas. Este vector viral fue capaz de expresar tres proteínas fluorescentes con localización nucleocitoplásmica en cantidades equimolares en plantas de tabaco transgénicas que complementaban el cistron NIb en trans. A pesar de la aparente simplicidad de la estrategia de expresión génica de los potyvirus, la inserción de un cDNA foráneo es una tarea complicada. Por lo tanto, nuestro primer objetivo fue analizar el efecto de la inserción en la estabilidad del genoma de TEV. Como resultado de este trabajo, descubrimos una nueva posición de inserción en el extremo amino-terminal de la poliproteína viral que nos permitió explorar otras cuestiones sobre la expresión de proteínas recombinantes. Dado que las vías metabólicas son muy compartimentalizadas, la adecuada localización subcelular de enzimas es una tarea esencial en ingeniería metabólica. Por eso, nuestro segundo objetivo se centró en la distribución de las proteínas heterológas expresadas con el vector viral a diferentes orgánulos subcelulares. cDNAs que codificaban la proteína fluorescente verde (green fluorescent protein, GFP) fusionada a péptidos señal se insertaron en la nueva posición amino-terminal y en un sitio interno, sustituyendo el cistrón NIb, para enviarla al cloroplasto, núcleo y a la mitocondria. Nuestros resultados mostraron que para la distribución de proteínas al cloroplasto y mitocondria, los genes foráneos deben ser insertados en el sitio amino-terminal del vector viral, pero para la distribución nuclear, ambas posiciones son adecuadas. El último objetivo de este trabajo fue estudiar si el vector viral basado en potyvirus es capaz de expresar una ruta biosíntética de múltiples pasos en células vegetales. Para ello nos propusimos producir licopeno, un pigmento vegetal con propiedades beneficiosas para la salud humana. Para ello, insertamos un cDNA que codificaba las enzimas de una ruta metabólica de tres pasos de origen bacteriano en el vector viral. Las plantas de tabaco infectadas con el vector viral desarrollaron síntomas de color naranja indicando la acumulación de licopeno, que fue confirmado por análisis de cromatografía líquida de alta eficacia y observaciones de microscopía. Nuestros resultados también ilustraron que la sola expresión de la fitoeno sintasa de Pantonea ananatis, crtB, es suficiente para inducir la acumulación de carotenoides que confieren una coloración amarilla al tejido infectado y sirve como sistema reportero visual en varias especies de plantas. / [CAT] Els virus de plantes són paràsits intracel·lulars obligats que han estat utilitzats per a desenvolupar vectors virals i expressar proteïnes heteròlogues y modificar rutes metabòliques endògenes de productes naturals silenciant certs gens o expressant factors de transcripció i enzims metabòlics. La principal limitació de molts sistemes basats en virus de plantes és la dificultat de coexpressar diverses proteïnes heteròlogues en la mateixa cèl·lula amb la localització subcel·lular apropiada, cosa que és una qüestió crucial en enginyeria metabòlica. Aquest treball presenta una solució per a superar aquest problema mitjançant l'ús d'un vector viral basat en un potyvirus. Els potyvirus (gènere Potyvirus, família Potyviridae) són virus d'RNA de cadena positiva simple que tenen una estratègia d'expressió gènica que permet la producció de la majoria de les proteïnes virals en quantitats equimolars. Basat en un clon infecciós del virus del gravat del tabac (Tobacco etch virus, TEV) Bedoya et al. (2010) van desenvolupar un sistema d'expressió en el qual el gen de l'RNA polimerasa depenent d'RNA (NIb) va ser substituït per un casset d'expressió, que albergava diverses proteïnes heteròlogues. Aquest vector viral va ser capaç d'expressar tres proteïnes fluorescents amb localització nucleocitoplàsmica en quantitats equimolars en plantes de tabac transgèniques que complementaven el cistró NIb en trans. Malgrat l'aparent simplicitat de l'estratègia d'expressió gènica dels potyvirus, la inserció d'un cDNA forà és una tasca complicada. Per tant, el nostre primer objectiu va ser analitzar l'efecte de la inserció en l'estabilitat del genoma de TEV. Com a resultat d'aquest treball, hem descobert una nova posició d'inserció en l'extrem amino terminal de la poliproteïna viral que ens va permetre explorar altres qüestions sobre l'expressió de proteïnes recombinants. Atès que les vies metabòliques són molt compartimentalitzades, l'adequada localització subcel·lular d'enzims és una tasca essencial en enginyeria metabòlica. Per açò, el nostre segon objectiu es va centrar en la distribució de les proteïnes heteròlogues expressades amb el vector viral a diferents orgànuls subcelul·lars. cDNAs que codificaven la proteïna fluorescent verda (green fluorescent protein, GFP) fusionada a pèptids senyal es van inserir en la nova posició amino terminal i en un lloc intern, substituint el cistró NIb, per a enviar-la al cloroplast, nucli i al mitocondri. Els nostres resultats van mostrar que per a la distribució de proteïnes al cloroplast i mitocondri, els gens forans han de ser inserits en el lloc amino terminal del vector viral, però per a la distribució nuclear, ambdues posicions són adequades. El lloc amino terminal va resultar ser més adequat per a produir quantitats més grans de proteïnes recombinants, però el lloc d'inserció intern va demostrar ser més estable. Sobre la base d'aquests resultats, hem sigut capaços de distribuir dues proteïnes fluorescents diferents als cloroplasts i nuclis des d'un únic vector viral. L'últim objectiu d'aquest treball va ser estudiar si el vector viral basat en potyvirus és capaç d'expressar una ruta biosintètica de múltiples passos en cèl·lules vegetals. Per açò ens vam proposar produir licopè, un pigment vegetal amb propietats beneficioses per a la salut humana. Per això inserírem un cDNA que codificaba els tres enzims de una ruta metabòlica de tres passos d'origen bacterià en el vector viral. Les plantes de tabac infectades amb el vector viral van desenvolupar símptomes de color taronja indicant l'acumulació de licopè, que va ser confirmat per anàlisi de cromatografia líquida d'alta eficàcia i observacions de microscòpia. Els nostres resultats també van il·lustrar que la sola expressió de fitoè sintasa de Pantonea ananatis, crtB, és suficient per a induir l'acumulació de carotenoides que confereixen una colora / Majer, E. (2016). Metabolic engineering of plants using a disarmed potyvirus vector [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/68477 / TESIS

Diagnostics is important in the development and implementation of pest management strategies. The virus diagnostic capabilities of several plant pathology collaborators within the Integrated Pest Management Collaborative Research Support Program (IPM CRSP) host countries were evaluated with the aid of a survey. Very few plant disease diagnostic clinics had funds to cover daily operations despite over half of the responding clinics receiving an operational budget. Academically and government affiliated clinics within the developing host countries had little access to molecular tools and equipment, relying mostly on biological and serological methods. Clinics affiliated with private companies and within the USA relied more upon molecular assays. Ten CMV isolates identified by tissue blot immunoassay (TBIA) were collected from a garden at the Historic Smithfield Plantation on the Virginia Tech campus, and from Painter, Virginia on the Eastern Shore. Three CMV isolates from Smithfield were biologically compared to six early CMV isolates stored since the 1970s, while all isolates were compared serologically and molecularly. Sequences obtained after reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assigned the CMV isolates into subgroups, with eleven to subgroup 1A and three to subgroup 2. The subgroup assignments were confirmed by TBIA using CMV subgroup-specific monoclonal antibodies (Agdia Inc). At Smithfield Plantation, another virus, Turnip mosaic virus (TuMV) was identified from Dame's Rocket (Hesperis matronalis L.). This is the first report of TuMV in Virginia.  In TBIA virus-infected plant samples are blotted onto nitrocellulose membranes, dried, and processed. Membranes can be stored for long periods of time and transported safely across borders without risk of introducing viruses into new environments, but virus remains immunologically active for several months. Methods were developed with CMV and three potyviruses, using the same membranes, for detecting viral RNA by RT-PCR and direct sequencing of PCR products.. Amplification by RT-PCR  was possible after membrane storage for up to 15 months. The membranes also performed well with samples sent from IPM CRSP host countries and within the USA. This method should improve molecular diagnostic capabilities in developing countries, as samples can be blotted to membranes and sent to a centralized molecular laboratory for analysis. / Ph. D.

Over the years, the view on proteases as relatively non-specific protein degradation enzymes, mainly involved in food digestion and intracellular protein turnover, has shifted and they are now recognized as key regulators of many biological processes that determine the fate of a cell. Besides their biological role, proteases have emerged as important tools in various biotechnical, industrial and medical applications. At present, there are worldwide efforts made that aim at deciphering the biological role of proteases and understanding their mechanism of action in greater detail. In addition, with the growing demand of novel protease variants adapted to specific applications, protease engineering is attracting a lot of attention. With the vision of contributing to the field of protein science, we have developed a platform for the identification of site-specific proteolysis, consisting of two intracellular genetic assays; one fluorescence-based (Paper I) and one antibiotic resistance-based (Paper IV). More specifically, the assays take advantage of genetically encoded short-lived reporter substrates that upon cleavage by a coexpressed protease confer either increased whole-cell fluorescence or antibiotic resistance to the cells in proportion to the efficiency with which the substrates are processed. Thus, the fluorescence-based assay is highly suitable for high-throughput analysis of substrate processing efficiency by flow cytometry analysis and cell sorting, while the antibiotic resistance assay can be used to monitor and identify proteolysis through (competitive) growth in selective media. By using the highly sequence specific tobacco etch virus protease (TEVp) as a model in our systems, we could show that both allowed for (i) discrimination among closely related substrate peptides (Paper I & IV) and (ii) enrichment and identification of the best performing substrate-protease combination from a background of suboptimal variants (Paper I & IV). In addition, the fluorescence-based assay was used successfully to determine the substrate specificity of TEVp by flow cytometric screening of large combinatorial substrate libraries (Paper II), and in a separate study also used as one of several methods for the characterization of different TEVp mutants engineered for improved solubility (Paper III). We believe that our assays present a new and promising path forward for high-throughput substrate profiling of proteases, directed evolution of proteases and identification of protease inhibitors, which all are areas of great biological, biotechnical and medical interest. / QC 20110516

Tesis por compendio / [ES] En el contexto actual de cambio climático, resulta urgente desarrollar nuevas tecnologías de fitomejoramiento que garanticen el suministro de alimentos a una población en rápido crecimiento. La reciente aparición de herramientas basadas en las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (del acrónimo CRISPR en inglés) y sus proteínas asociadas (Cas) ha revolucionado la edición genómica dirigida, resultando muy prometedora tanto para la biología vegetal básica como para la mejora de cultivos. Los sistemas CRISPR-Cas más comunes incluyen una endonucleasa Cas y un ARN guía que determina específicamente la secuencia diana a editar en el genoma. El suministro de los componentes de reacción CRISPR-Cas a una célula vegetal es un paso crucial que influye notablemente en la velocidad y la eficiencia de edición. Los enfoques convencionales se basan en el suministro de dichos componentes mediante tecnologías de transformación o la expresión transitoria en protoplastos, siendo ambos procesos laboriosos que pueden acarrear problemas legales. Alternativamente, estudios recientes han destacado el potencial de virus de ARN para ser utilizados como vectores de expresión transitoria de los componentes de reacción CRISPR-Cas en plantas, también conocido como edición genómica inducida por virus (VIGE en inglés). Puesto que la aplicabilidad de cada vector viral se encuentra limitada por sus propiedades moleculares y un rango específico de plantas huésped, esta Tesis ha tenido como objetivo principal expandir y mejorar las herramientas disponibles para el VIGE. En primer lugar, diseñamos un vector derivado del Virus X de la patata (PVX; género Potexvirus; familia Alphaflexiviridae) para suministrar múltiples ARNs guía a una línea transformada de Nicotiana benthamiana que expresaba constitutivamente la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes. Mediante el vector derivado de PVX, conseguimos editar genes endógenos de la planta huésped de manera eficiente, IV produciendo casi un 80% de modificaciones en tejidos de plantas adultas. Curiosamente, PVX permitió la expresión simultánea de matrices de ARNs guía no espaciados, lo cual resultó en la edición de múltiples genes en pocos días. Obtuvimos progenies editadas con una alta tasa de mutaciones bialélicas hereditarias tanto de plantas regeneradas a partir de tejido infectado como de semillas de plantas infectadas; en este último caso, el ARN guía fue previamente fusionado a un módulo de ARN móvil. Dado que PVX no se transmite por semillas, todas las plántulas editadas estaban libres de virus. A fin de expandir las estrategias basadas en virus de plantas para una edición genómica sin transformación, seguidamente desarrollamos un sistema de dos vectores virales compatibles para el suministro simultáneo de todos los componentes de reacción CRISPR-Cas en la planta. Modificamos el Virus del grabado del tabaco (TEV; género Potyvirus; familia Potyviridae) para que expresase una nucleasa Cas12a y, en combinación con el envío de ARN guía mediante PVX, logramos la edición sin transformación de una línea de N. benthamiana que expresaba constitutivamente la NIb del potyvirus. Además, demostramos que un único vector PVX era capaz de proporcionar la actividad de NIb, así como de suministrar el ARN guía para la edición genómica en plantas silvestres. En conjunto, el trabajo realizado en esta Tesis contribuye a la expansión de las herramientas actuales para VIGE. La amplia gama de huéspedes que poseen tanto PVX como TEV, particularmente entre solanáceas, postula a ambos virus como candidatos muy prometedores para futuras aplicaciones en genómica funcional y mejora de cultivos. / [CA] En el context actual de canvi climàtic, resulta urgent desenvolupar noves tecnologies de fitomillorament que garantisquen el subministrament d'aliments a una població en ràpid creixement. La recent aparició d'eines basades en les repeticions palindròmiques curtes agrupades i regularment interespaiades (de l'acrònim CRISPR en anglés) i les seues proteïnes associades (Cas) ha revolucionat l'edició genòmica dirigida, resultant molt prometedora tant per a la biologia vegetal bàsica com per a la millora de cultius. Els sistemes CRISPR-Cas més comuns inclouen una endonucleasa Cas i un ARN guia que determina específicament la seqüència diana a editar en el genoma. El subministrament dels components de reacció CRISPR-Cas a una cèl·lula vegetal és un pas crucial que influeix notablement en la velocitat i l'eficiència d'edició. Els enfocaments convencionals es basen en el subministrament d'aquests components mitjançant tecnologies de transformació o l'expressió transitòria en protoplasts, sent tots dos processos laboriosos que poden implicar problemes legals. Alternativament, estudis recents han destacat el potencial de virus d'ARN per a ser utilitzats com a vectors d'expressió transitòria dels components de reacció CRISPR-Cas en plantes, també conegut com a edició genòmica induïda per virus (VIGE en anglés). Com que l'aplicabilitat de cada vector viral es troba limitada per les seues propietats mol·leculars i un rang específic de plantes hoste, aquesta Tesi ha tingut com a objectiu principal expandir i millorar les eines disponibles per al VIGE. En primer lloc, dissenyem un vector derivat del Virus X de la creïlla (PVX; gènere Potexvirus; família Alphaflexiviridae) per a subministrar múltiples ARNs guia a una línia transformada de Nicotiana benthamiana que expressava constitutivament la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes. Mitjançant el vector derivat de PVX, aconseguim editar gens endògens de la planta hoste de manera eficient, produint quasi un 80% de modificacions en teixits de plantes adultes. Curiosament, PVX va permetre l'expressió VI simultània de matrius d'ARNs guia no espaiats, la qual cosa va resultar en l'edició de múltiples gens en pocs dies. Vam obtindre progènies editades amb una alta taxa de mutacions bial·lèliques hereditàries tant de plantes regenerades a partir de teixit infectat com de llavors de plantes infectades; en aquest últim cas, l'ARN guia va ser prèviament fusionat a un mòdul d'ARN mòbil. Atés que PVX no es transmet per llavors, totes les plàntules editades estaven lliures de virus. A fi d'expandir les estratègies basades en virus de plantes per a una edició genòmica sense transformació, seguidament desenvolupem un sistema de dos vectors virals compatibles per al subministrament simultani de tots els components de reacció CRISPR-Cas en la planta. Modifiquem el Virus del gravat del tabac (TEV; gènere Potyvirus; família Potyviridae) perquè expressara una nucleasa Cas12a i, en combinació amb l'enviament d'ARN guia mitjançant PVX, aconseguim l'edició sense transformació d'una línia de N. benthamiana que expressava constitutivament la NIb del potyvirus. A més, vam demostrar que un únic vector PVX era capaç de proporcionar l'activitat de NIb, així com de subministrar l'ARN guia per a l'edició genòmica en plantes silvestres. En conjunt, el treball realitzat en aquesta Tesi contribueix a l'expansió de les eines actuals per a VIGE. L'àmplia gamma d'hostes que posseeixen tant PVX com TEV, particularment entre solanàcies, postula a tots dos virus com a candidats molt prometedors per a futures aplicacions en genòmica funcional i millora de cultius. / [EN] Innovative breeding technologies are urgently needed to ensure food supply to a rapidly growing population in the face of climate change. The recent emergence of tools based on the clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated (Cas) proteins has revolutionized targeted genome editing, thus holding great promise to both basic plant science and precision crop breeding. Most common CRISPR-Cas arrangements include a Cas endonuclease and a single guide RNA (sgRNA) that determines the specific target sequence to edit in the genome. The delivery of CRISPR-Cas reaction components within a plant cell is a crucial step that greatly influences editing speed and efficiency. Conventional approaches rely on supplying editing reaction components by transformation technologies or transient delivery to protoplasts, both of which are laborious processes that can raise legal concerns. Alternatively, recent studies have highlighted the potential of plant RNA viruses as transient delivery vectors of CRISPR-Cas reaction components, following the so-called virus-induced genome editing (VIGE). Since the applicability of each viral vector is limited to its molecular biology properties and a specific host range, the main objective of this Thesis has been to expand and improve the available toolbox for VIGE. First, we engineered a vector derived from Potato virus X (PVX; genus Potexvirus; family Alphaflexiviridae) to deliver multiple sgRNAs in a Nicotiana benthamiana transformed line constitutively expressing Streptococcus pyogenes Cas9. Using the PVX derived vector, host endogenous genes were efficiently targeted, producing nearly 80% indels in the tissues of adult plants. Interestingly, PVX allowed the simultaneous expression of unspaced sgRNA arrays, achieving highly efficient multiplex editing in a few days. We obtained edited progeny with a high rate of heritable bi-allelic mutations either from plants regenerated from infected tissue or infected plant seeds; in the latter II case, the sgRNA was previously fused to a mobile RNA module. Hence, since PVX is not seed-transmitted, all edited seedlings were virus-free. Aiming to expand the virus-based toolbox for transformation-free editing, we next developed a two-compatible virus vector system for the simultaneous delivery of all CRISPR-Cas reaction components in the plant. Tobacco etch virus (TEV; genus Potyvirus; family Potyviridae) was engineered to express a Cas12a nuclease, and in combination with PVX-assisted sgRNA delivery, we achieved successful transformation-free genome editing in a N. benthamiana line constitutively expressing potyviral NIb. Moreover, we demonstrated that a single PVX vector can supply the potyviral NIb activity as well as perform sgRNA delivery for genome editing in wild-type plants. Altogether, the work performed in this Thesis contributes to the enrichment of the current VIGE toolbox. The wide host range that both PVX and TEV possess, particularly among solanaceous species, postulates them as promising candidates for future applications in VIGE-mediated functional genomics and precision breeding. / Uranga Ruiz De Eguino, M. (2022). Engineering Viral Vectors for CRISPR-Cas Mediated Genome Editing in Plants [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/183374 / TESIS / Compendio