Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2116236 bytes, checksum: d980c77ceebcbdbba85d747746d497be (MD5) Previous issue date: 2012-02-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The flavonoid 3,6-dimethyl ether galetin (FGAL) was isolated from aerial parts of Piptadenia stipulacea (Benth.) Ducke. In previous studies, Macêdo et al. (2011a) demonstrated that FGAL inhibited in a significant and concentration-dependent manner the phasic contractions induced by carbachol and oxytocin on rat uterus, in a higher potency to oxytocin. The aim of this study was to investigate the mechanism of tocolytic action of FGAL on rat uterus. Segments of rat uterus were suspended in organ bath and the isometric contractions were monitored. FGAL inhibited (pD 2 = 5.68 ± 0.06) oxytocin cumulative curves and these were shifted to the right, in a non parallel manner (slope = 3.59 ± 0.04), with Emax the reduction, suggesting a non-competitive antagonism. In relation to the tonic contractions, FGAL relaxed in a concentration-dependent and significant manner but not equipotent rat uterus pre-contracted both oxytocin (pD2 = 6.9 ± 0.1) and KCl (pD2 = 5.6 ± 0.06). How the opening channels for calcium-dependent voltage (CaV) is one of the common step to the signaling pathways of oxytocin and KCl to maintain the tonic phase of contraction, raised the hypothesis that FGAL could be acting by blocking the influx of Ca2+ through the CaV. Therefore, cumulative contractions were induced with CaCl2 in depolarizing medium nominally without Ca2+ in the presence and absence of several concentrations of FGAL. The flavonoid antagonized the contractions induced by CaCl2 evidenced by shift to the right of the control curve in a non parallel manner with reduction of Emax, suggesting that FGAL is blocking indirectly the CaV to promote tocolytic effect on rat uterus. The K+ channels play a key role in membrane potential regulation and CaV modulation. According to this premise, we decided to investigate the involvement of these channels in the tocolytic action of FGAL. The relaxing potency of FGAL (pD2 = 6.9 ± 0.1) were reduced approximately 20 folds in the presence of CsCl (pD2 = 5.6 ± 0.01), a non-selective K+ channels blocker, confirming K+ channels the participation to the relaxant effect of the flavonoid. To determinated which K+ channel(s) subtype(s) were involved, selective blockers of these channels were used. The relaxation curve induced by FGAL was shifted to right in the presence of 4-aminopyridine (pD2 = 5.4 ± 0.01), a selective blocker of voltage gated K+ channels (KV); of glibenclamide (pD2 = 5.3 ± 0.01), a selective blocker of ATP sensitive K+ channels (KATP); of apamin (6.3 ± 0.02), a selective blocker of small conductance calcium-activated K+ channels (SKCa) and tetraethylamonium (TEA+) 1 mM (pD2 = 5.0 ± 0.08), a big conductance calcium-activated K+ channels (BKCa), suggesting the involvement of these channels on tocolytic action mechanism of FGAL on rat uterus. The aminophylline, a non selective inhibitor of phosphodiesterases (PDE), did not potentialized (pD2 = 6.7 ± 0.03) the relaxation produced by FGAL on rat uterus, suggesting that the cyclic nucleotides pathway is not involved on relaxing effect induced by FGAL. Thus, we concluded that the relaxing action mechanism of FGAL in rat uterus involves positive regulation of K+ channels, that indirectly modulated the CaV, leading to a consequent reduction of [Ca2+]c and uterine smooth muscle relaxation. / O flavonoide 3,6-dimetil éter galetina (FGAL) foi isolado das partes aéreas de Piptadenia stipulacea (Benth.) Ducke. Em estudos anteriores, Macêdo et al. (2011a) demonstraram que FGAL inibiu de maneira dependente de concentração as contrações fásicas induzidas por carbacol e ocitocina em útero isolado de rata, sendo mais potente para ocitocina. Desta forma, o objetivo desse estudo foi investigar o mecanismo de ação tocolítica de FGAL em útero de rata. Para tanto segmentos de útero de rata foram suspensos em cuba para órgãos isolados e as contrações isométricas foram monitoradas. FGAL inibiu (pD´2 = 5, 68 ± 0,06) as curvas cumulativas à ocitocina e estas foram desviadas para direita, de forma não paralela ( slope = 3,59 ± 0,04), com redução do Emax, sugerindo um antagonismo não competitivo. Em relação às contrações tônicas, FGAL relaxou de maneira significante, dependente de concentração e não equipotente o útero pré-contraído tanto por ocitocina (pD2 = 6,9 ± 0,1) como por KCl (pD2 = 5,6 ± 0,06). Como a abertura dos canais para cálcio dependentes de voltagem (CaV) é um dos passos comum às vias de sinalização da ocitocina e do KCl para manutenção da fase tônica da contração, levantou-se a hipótese de que FGAL poderia estar agindo por bloqueio do influxo de Ca2+ através dos CaV. Assim, foram induzidas contrações cumulativas com CaCl2 em meio despolarizante e nominalmente sem Ca2+ na presença e na ausência de várias concentrações de FGAL. O flavonoide antagonizou as contrações induzidas pelo CaCl2 evidenciado pelo desvio da curva controle para a direita de maneira não paralela e com diminuição do efeito máximo. Sugerindo assim que FGAL bloqueia de maneira indireta os CaV para promover efeito tocolítico em útero de rata. Os canais para K+ desempenham um papel chave na regulação do potencial de membrana e modulação dos CaV. Diante dessa premissa, decidiu-se investigar a participação desses canais na ação tocolítica de FGAL. A potência relaxante de FGAL (pD2 = 6,9 ± 0,1) foi reduzida em aproximadamente 20 vezes na presença de CsCl (pD2 = 5,6 ± 0,01), bloqueador não seletivo dos canais para K+, confirmando a participação de canais para K+ no efeito relaxante do flavonoide. Para determinar qual(is) canal(is) para K+ estariam envolvidos usou-se bloqueadores seletivos desses canais. A curva de relaxamento induzida por FGAL foi desviada para direita na presença de 4 -aminopiridina (pD2 = 5,4 ± 0,01), um bloqueador seletivo dos canais para K+ ativados por voltagem (KV); de glibenclamida (pD2 = 5,3 ± 0,01), um bloqueador seletivo dos canais para K+ ativados por ATP (KATP); de apamina (6,3 ± 0,02), um bloqueador seletivo dos canais para K+ de pequena condutância ativados por cálcio (SKCa) e tetraetilamônio 1 mM (pD2 = 5,0 ± 0,08), que nesta concentração é um bloqueador seletivo dos canais para K+ de grande condutância ativados por cálcio (BKCa), sugerindo o envolvimento destes canais no mecanismo de ação tocolítica de FGAL em útero isolado de rata. A aminofilina um inibidor não seletivo de fosfodiesterases (PDE) não potencializou (pD2 = 6,7 ± 0,03) o relaxamento produzido por FGAL em útero de rata, sugerindo que não há participação da via dos nucleotídios cíclicos no efeito relaxante induzido por FGAL. Conclui-se que o mecanismo de ação tocolítica de FGAL em útero de rata envolve a modulação positiva de canais para K+, majoritariamente dos BKCa, que modulam indiretamente os CaV, levando ao relaxamento da musculatura lisa uterina.

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:00:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1650279 bytes, checksum: 848f51aee13c80e0d670d1542b962211 (MD5) Previous issue date: 2010-03-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / 8(17),12E,14-labdatrien-18 oic acid (labdane-302), is a diterpene isolated from the stem bark of Xylopia langsdorfiana A. St.-Hil. & Tul. In a preliminary study, Ribeiro (2003) demonstrated that labdane-302 inhibited in an equipotent manner the phasic contractions induced by carbachol or oxytocin in rat uterus. The aim of the present study was to investigate the spasmolytic action mechanism of labdane-302 in that organ. Isometric and isotonic contractions were monitored and the parameters of relative potency and efficacy were determined from cumulative concentration-response curves. Labdane-302 inhibited the cumulative concentration-response curves to carbachol (pD´2 = 3.4 ± 0.1; r2 = 0.9 ± 0.05) and oxytocin (pD´2 = 3.8 ± 0.2; r2 = 0.9 ± 0.04) these were shifted to the right, in a non-parallel manner (Schild plot slope = 0.15 ± 0.04 and 1.13 ± 0.1 respectively), with reduction of the maximal effect (Emax), suggesting a noncompetitive antagonism. Labdane-302 was not effective in relaxing the uterus pre-contracted by 60 mM KCl (Emax = 9.75 ± 0.07%),on the other hand, relaxed in a significant and concentration dependent manner the rat uterus pre-contracted by oxytocin (pD2 = 4,3 ± 0,06), suggesting a possible involvement of the K+ channels in the spasmolytic effect caused by labdane-302. Because K+ channels play a major role in the regulation of membrane potential and modulation of CaV, we decided to investigate the participation of K+ channels in the spasmolytic action of labdane-302. The relaxant potency of labdane-302 (pD2 = 4.3 ± 0.06) was decreased about 16 times in the presence of CsCl (pD2 = 3.1 ± 0.06), a non-selective K+channels blocker, suggesting a possible involvement of the K+ channels in the tocolytic effect of the labdane-302. In order to verify which subtypes of K+ channels could be involved we used selectives blockers of these channels. The observation that 4-aminopyridine, a selective blocker of voltage-gated K+ channels (Kv), and that glibenclamide, a selective blocker of the ATP-sensitive K+ channels (KATP) did not change the relaxant effect of labdane-302 suggests that KV and KATP are not involved in its action mechanism. However, the log concentration-response curve induced by labdane-302 was shifted to the right in the presence of apamine (pD2 = 3.8 ± 0.03), a selective blocker of the small-conductance calcium-activated K+ channels (SKCa) and TEA+ 1 mM (pD2 = 3.6 ± 0.04), a selective blocker of the large conductance clacium-activated K+ channels (BKca). The involvement of BKCa was confirmed using a specific blocker of that channels iberiotoxin (IbTx) (pD2 = 3.8 ± 0.06) , suggesting the involvement of SKCa and BKCa in the tocolytic action mechanism induced by labdane-302 on uterus rat. The aminophylline a nonselective inhibitor of phosphodiesterases (PDE) potentiated (pD2 = 7.8 ± 0.1) in about 320 times the relaxation produced by labdane-302 in rat uterus. The results suggest that effect of labdane-302 on uterus rat, involves the activation of the SKCa e BKCa, which modulate indirectly the CaV, leading to a decrease the [Ca2+]c , and cyclic nucleotides like cAMP and cGMP may be involved in this tocolytic action / O ácido 8(17),12E,14-labdatrieno-18-óico (labdano-302) é um diterpeno isolado das cascas do caule de Xylopia langsdorfiana A. St.-Hil. & Tul. Em estudos anteriores Ribeiro (2003) demonstrou que o labdano-302 inibiu de maneira eqüipotente as contrações fásicas induzidas por carbacol e ocitocina em útero de rata. Assim, o objetivo desse estudo foi investigar o mecanismo de ação tocolítico do labdano-302. As contrações isométricas e isotônicas foram monitoradas e os parâmetros de potência e eficácia relativas foram determinados a partir de curvas de concentrações-resposta cumulativas. O labdano-302 inibiu as curvas cumulativas ao carbacol (pD´2 = 3,4 ± 0,1; r2 = 0,9 ± 0,05) e ocitocina (pD´2 = 3,8 ± 0,2; r2 = 0,9 ± 0,04) e estas foram desviadas para direita, de forma não paralela ( slope de Schild = 0,15 ± 0,04 e 1,13 ± 0,1 respectivamente), com redução do Emax, sugerindo um antagonismo não competitivo. O labdano-302 não foi eficaz em antagonizar as contrações induzidas por 60 mM de KCl apresentando um Emax = 9,75 ± 0,07%, por outro lado, labdano-302 relaxou de maneira significante e dependente de concentração quando o útero era pré-contraído por ocitocina (pD2 = 4,3 ± 0,06), sugerindo que este diterpeno deve estar agindo por uma modulação positiva de canais para potássio. Os canais para K+ desempenham um papel chave na regulação do potencial de membrana e modulação dos CaV, então decidiu-se investigar a participação desses canais na ação tocolítica do labdano-302. A potência relaxante de labdano-302 (pD2 = 4,3 ± 0,06) foi reduzida em aproximadamente 16 vezes na presença de CsCl (pD2 = 3,1 ± 0,06), bloqueador não seletivo dos canais para K+, confirmando a participação de canais para K+ no efeito relaxante do labdano-302. Para verificar qual(is) canal(is) para K+ estariam envolvidos usou-se bloqueadores seletivos desses canais. O fato da 4-aminopiridina, bloqueador seletivo dos canais para K+ abertos por voltagem (Kv), e da glibenclamida, bloqueador seletivo dos canais para K+ sensíveis ao ATP (KATP) não alterar o efeito relaxante do labdano-302 indica que os KV e os KATP não estariam envolvidos em seu mecanismo de ação tocolítico. Entretanto, a curva concentração-resposta de relaxamento induzida pelo labdano-302 foi desviada para direita na presença de apamina (pD2 = 3,8 ± 0,03), um bloqueador seletivo dos canais para K+ ativados por Ca2+ de pequena condutância (SKCa), ou de tetraetilamônio 1 mM (pD2 = 3,6 ± 0,04), que nesta concentração é um bloqueador seletivo dos canais para K+ de grande condutância ativados por cálcio (BKCa). A participação dos BKCa foi confirmada utilizando um bloqueador específico para esses canais a iberiotoxina (IbTx) (pD2 = 3,8 ± 0,06), sugerindo o envolvimento dos SKCa e dos BKCa no mecanismo de ação tocolítico do labdano-302 em útero isolado de rata. A aminofilina um inibidor não seletivo de fosfodiesterases (PDE) potencializou (pD2 = 7,8 ± 0,1) em cerca de 320 vezes o relaxamento produzido por labdano-302 em útero de rata. Conclui-se que o mecanismo de ação relaxante do labdano-302 em útero isolado de rata envolve a modulação positiva de canais para K+, mais especificamente os SKCa e BKCa, que modulam indiretamente os CaV, levando a uma conseqüente redução da [Ca2+]c , e que nucleotídios cíclicos como o AMPc e GMPc podem estar envolvidos nesta ação.