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Ovarian hyperstimulation is achieved through ovarian gonadotropin stimulation, and thus associated with supraphysiological levels of oestrogen and progesterone. To investigate the effects of exogenous gonadotropins on the expression of TGF b1 and TGF b2, which have been recognized as possible modulators of many endometrial functions, FSH and hCG were superimposed upon the normal hormonal milieu of the cycling rat, prior to mating. Endometrial tissue was collected at 4.5, 5.5 and 6.5 days after mating. ELISA was performed to estimate blood oestrogen and progesterone levels and immunohistochemistry was undertaken to localize TGF b1 and TGF b2 in the uterine endometrium. Apart from the known detrimental effects of hyperstimulation on gross morphology, hormone levels and endometrial histology, the hyperstimulation was also found to affect TGF b expression. An increase in the expression of TGF b2 was distinct in the glandular epithelium of the hyperstimulated animals, while regionalized expression of both TGF b1 and TGF b2 was prominent in the stroma. In conclusion, hyperstimulation affects the expression of both TGF b1 and TGF b2, which may contribute to the disruption of the endometrial environment required for successful embryo implantation.

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2116236 bytes, checksum: d980c77ceebcbdbba85d747746d497be (MD5) Previous issue date: 2012-02-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The flavonoid 3,6-dimethyl ether galetin (FGAL) was isolated from aerial parts of Piptadenia stipulacea (Benth.) Ducke. In previous studies, Macêdo et al. (2011a) demonstrated that FGAL inhibited in a significant and concentration-dependent manner the phasic contractions induced by carbachol and oxytocin on rat uterus, in a higher potency to oxytocin. The aim of this study was to investigate the mechanism of tocolytic action of FGAL on rat uterus. Segments of rat uterus were suspended in organ bath and the isometric contractions were monitored. FGAL inhibited (pD 2 = 5.68 ± 0.06) oxytocin cumulative curves and these were shifted to the right, in a non parallel manner (slope = 3.59 ± 0.04), with Emax the reduction, suggesting a non-competitive antagonism. In relation to the tonic contractions, FGAL relaxed in a concentration-dependent and significant manner but not equipotent rat uterus pre-contracted both oxytocin (pD2 = 6.9 ± 0.1) and KCl (pD2 = 5.6 ± 0.06). How the opening channels for calcium-dependent voltage (CaV) is one of the common step to the signaling pathways of oxytocin and KCl to maintain the tonic phase of contraction, raised the hypothesis that FGAL could be acting by blocking the influx of Ca2+ through the CaV. Therefore, cumulative contractions were induced with CaCl2 in depolarizing medium nominally without Ca2+ in the presence and absence of several concentrations of FGAL. The flavonoid antagonized the contractions induced by CaCl2 evidenced by shift to the right of the control curve in a non parallel manner with reduction of Emax, suggesting that FGAL is blocking indirectly the CaV to promote tocolytic effect on rat uterus. The K+ channels play a key role in membrane potential regulation and CaV modulation. According to this premise, we decided to investigate the involvement of these channels in the tocolytic action of FGAL. The relaxing potency of FGAL (pD2 = 6.9 ± 0.1) were reduced approximately 20 folds in the presence of CsCl (pD2 = 5.6 ± 0.01), a non-selective K+ channels blocker, confirming K+ channels the participation to the relaxant effect of the flavonoid. To determinated which K+ channel(s) subtype(s) were involved, selective blockers of these channels were used. The relaxation curve induced by FGAL was shifted to right in the presence of 4-aminopyridine (pD2 = 5.4 ± 0.01), a selective blocker of voltage gated K+ channels (KV); of glibenclamide (pD2 = 5.3 ± 0.01), a selective blocker of ATP sensitive K+ channels (KATP); of apamin (6.3 ± 0.02), a selective blocker of small conductance calcium-activated K+ channels (SKCa) and tetraethylamonium (TEA+) 1 mM (pD2 = 5.0 ± 0.08), a big conductance calcium-activated K+ channels (BKCa), suggesting the involvement of these channels on tocolytic action mechanism of FGAL on rat uterus. The aminophylline, a non selective inhibitor of phosphodiesterases (PDE), did not potentialized (pD2 = 6.7 ± 0.03) the relaxation produced by FGAL on rat uterus, suggesting that the cyclic nucleotides pathway is not involved on relaxing effect induced by FGAL. Thus, we concluded that the relaxing action mechanism of FGAL in rat uterus involves positive regulation of K+ channels, that indirectly modulated the CaV, leading to a consequent reduction of [Ca2+]c and uterine smooth muscle relaxation. / O flavonoide 3,6-dimetil éter galetina (FGAL) foi isolado das partes aéreas de Piptadenia stipulacea (Benth.) Ducke. Em estudos anteriores, Macêdo et al. (2011a) demonstraram que FGAL inibiu de maneira dependente de concentração as contrações fásicas induzidas por carbacol e ocitocina em útero isolado de rata, sendo mais potente para ocitocina. Desta forma, o objetivo desse estudo foi investigar o mecanismo de ação tocolítica de FGAL em útero de rata. Para tanto segmentos de útero de rata foram suspensos em cuba para órgãos isolados e as contrações isométricas foram monitoradas. FGAL inibiu (pD´2 = 5, 68 ± 0,06) as curvas cumulativas à ocitocina e estas foram desviadas para direita, de forma não paralela ( slope = 3,59 ± 0,04), com redução do Emax, sugerindo um antagonismo não competitivo. Em relação às contrações tônicas, FGAL relaxou de maneira significante, dependente de concentração e não equipotente o útero pré-contraído tanto por ocitocina (pD2 = 6,9 ± 0,1) como por KCl (pD2 = 5,6 ± 0,06). Como a abertura dos canais para cálcio dependentes de voltagem (CaV) é um dos passos comum às vias de sinalização da ocitocina e do KCl para manutenção da fase tônica da contração, levantou-se a hipótese de que FGAL poderia estar agindo por bloqueio do influxo de Ca2+ através dos CaV. Assim, foram induzidas contrações cumulativas com CaCl2 em meio despolarizante e nominalmente sem Ca2+ na presença e na ausência de várias concentrações de FGAL. O flavonoide antagonizou as contrações induzidas pelo CaCl2 evidenciado pelo desvio da curva controle para a direita de maneira não paralela e com diminuição do efeito máximo. Sugerindo assim que FGAL bloqueia de maneira indireta os CaV para promover efeito tocolítico em útero de rata. Os canais para K+ desempenham um papel chave na regulação do potencial de membrana e modulação dos CaV. Diante dessa premissa, decidiu-se investigar a participação desses canais na ação tocolítica de FGAL. A potência relaxante de FGAL (pD2 = 6,9 ± 0,1) foi reduzida em aproximadamente 20 vezes na presença de CsCl (pD2 = 5,6 ± 0,01), bloqueador não seletivo dos canais para K+, confirmando a participação de canais para K+ no efeito relaxante do flavonoide. Para determinar qual(is) canal(is) para K+ estariam envolvidos usou-se bloqueadores seletivos desses canais. A curva de relaxamento induzida por FGAL foi desviada para direita na presença de 4 -aminopiridina (pD2 = 5,4 ± 0,01), um bloqueador seletivo dos canais para K+ ativados por voltagem (KV); de glibenclamida (pD2 = 5,3 ± 0,01), um bloqueador seletivo dos canais para K+ ativados por ATP (KATP); de apamina (6,3 ± 0,02), um bloqueador seletivo dos canais para K+ de pequena condutância ativados por cálcio (SKCa) e tetraetilamônio 1 mM (pD2 = 5,0 ± 0,08), que nesta concentração é um bloqueador seletivo dos canais para K+ de grande condutância ativados por cálcio (BKCa), sugerindo o envolvimento destes canais no mecanismo de ação tocolítica de FGAL em útero isolado de rata. A aminofilina um inibidor não seletivo de fosfodiesterases (PDE) não potencializou (pD2 = 6,7 ± 0,03) o relaxamento produzido por FGAL em útero de rata, sugerindo que não há participação da via dos nucleotídios cíclicos no efeito relaxante induzido por FGAL. Conclui-se que o mecanismo de ação tocolítica de FGAL em útero de rata envolve a modulação positiva de canais para K+, majoritariamente dos BKCa, que modulam indiretamente os CaV, levando ao relaxamento da musculatura lisa uterina.

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2017-09-11T13:17:28Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2915806 bytes, checksum: 8e05efc416b7ae0bf16dc64a785206e4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-11T13:17:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2915806 bytes, checksum: 8e05efc416b7ae0bf16dc64a785206e4 (MD5) Previous issue date: 2014-12-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Rollinia leptopetala R. E. Fries species, popularly known as “pinha-brava”, “bananinha” and “pereiro”, and traditionally cited as digestive. From R. leptopetala leaves was extracted an essential oil (RL-OE) that showed tocolytic effect in carbachol- (CCh) and oxytocin-induced phasic contractions on rat uterus. Thus, we aimed characterize the mechanism of tocolytic action of RL-OE using by functional techniques. Since the mechanisms to induce the phasic contractions are distinct from the tonic ones, we decided to evaluate whether RL-OE would relax rat uterus pre-contracted with KCl or oxytocin. The essential oil relaxed pre-contracted with 60 mM KCl (EC50 = 22.4 ± 2.4 μg/mL) or 10-2 UI/mL oxytocin (EC50 = 4.1 ± 0.4 μg/mL). After, it was hypothesized that RL-OE would antagonize oxytocin receptors, and this hypothesis was confirmed since cumulative concentration-response curves to oxytocin were inhibited, shifted to the right, in a non-parallel manner and with Emax reduction, discarding a competitive antagonism. The participation of adrenergic receptors was also evaluated. For this, phentolamine (an antagonist of α-receptors) was used, but none change in RL-OE tocolytic potency was observed, being discarded the involvement of this receptor. Additionally, propranolol (an antagonist of β-receptors) was used and the relaxation curve induced by RL-OE, in the blocker presence, was shifted to the left, with potentiation of oil effect and rejecting the hypothesis of β-receptors activation. Other pathways that modulate the myometrium contractility are nitric oxide (NO) and Cyclooxygenase (COX) pathways. The involvement of them in tocolytic mechanism of RL-OE was investigated using L-NAME and indomethacin, inhibitors of NO and COX pathways, respectively. However, RL-OE effect was not altered in the presence of inhibitors, discarding their contribution. The participation of K+ channels was developed using non-selective and selective blockers of them. The tocolytic potency of RL-OE (EC50 = 4.1 ± 0.4 μg/mL) was reduced 2.2 fold in the presence of 5 mM CsCl (EC50 = 8.9 ± 1.1 μg/mL), a non-specific blocker K+ channels, indicating participation of these channels. To investigate which subtypes of K+ channels would be involved selective K+ channels blockers were used. In the presence of 1 mM TEA+, blocker of large conductance calcium-activated K+ channels (BKCa), apamin, blocker of small conductance calcium-activated K+ channels (SKCa) and glibenclamide, blocker of ATP-sensitive potassium channel (KATP) did not changed the tocolytic action of RL-OE, showing that BKCa, SKCa and KATP are not involved. Interestingly, the relaxation curve induced by RL-OE was shifted to the right in the presence of 4- aminopyridine, blocker of voltage-gated K+ channels (KV), with reduction of RL-OE potency (EC50 = 10 ± 0.6 μg/mL), indicating KV participation in the mechanism of tocolytic action of RL-OE on rat uterus. Therefore, the tocolytic mechanism of RL-OE involves the positive modulation the K+ channels, in special KV subtypes, that indirectly blockade of voltage-gated Ca2+ channels (CaV) leading to uterine smooth muscle relaxation. / A espécie Rollinia leptopetala R. E. Fries, conhecida popularmente como “pinha-brava”, “bananinha” e “pereiro”, é utilizada tradicionalmente como digestiva. Das folhas dessa espécie foi extraído o óleo essencial (RL-OE), que, em estudos anteriores, apresentou atividade tocolítica frente às contrações fásicas induzidas por carbacol (CCh) ou ocitocina em útero isolado de rata. Assim, o objetivo desse trabalho foi caracterizar o mecanismo de ação tocolítica do RL-OE, por meio de metodologias funcionais. Como os mecanismos para indução da contração fásica são diferentes dos que mantém a tônica, decidiu-se verificar se o RL-OE relaxaria o útero pré-contraído com KCl ou ocitocina. O óleo relaxou o útero pré-contraído com 60 mM de KCl (CE50 = 22,4 ± 2,4 μg/mL) ou com 10-2 UI/mL de ocitocina (CE50 = 4,1 ± 0,4 μg/mL), sendo mais potente para ocitocina. Em seguida, hipotetizou-se que o RL-OE estaria antagonizando os receptores de ocitocina, sendo essa hipótese confirmada, uma vez que, observou-se a inibição das curvas concentrações-resposta cumulativas à ocitocina, desviando-as para a direita, de maneira não paralela e com redução do seu Emax, descartando-se um antagonismo do tipo competitivo. A participação dos receptores adrenérgicos foi avaliada. Para isso, utilizou-se a fentolamina, um antagonista dos receptores α, entretanto não houve alteração da potência tocolítica do RL-OE, sendo descartado o antagonismo desse receptor. Também utilizou-se o propranolol, um antagonista dos receptores adrenérgicos β, constatando-se que a curva de relaxamento, na presença do bloqueador, foi desviada para a esquerda, com potencialização do RL-OE, descartando a ativação desses receptores. Outras vias que modulam a função contrátil do miométrio uterino são as vias do óxido nítrico (NO) e da ciclo-oxigenase (COX). Investigou-se a participação dessas vias no mecanismo de ação do óleo essencial utilizando L-NAME e indometacina, inibidores das vias do NO e da COX, respectivamente. Entretanto, o efeito do RL-OE não foi alterado na presença dos inibidores, descartando a participação dessas vias no seu mecanismo de ação tocolítica. Outra via investigada foi o modulação dos canais de K+. Para isso, utilizou-se bloqueadores não-seletivo e seletivos desses canais. A potência tocolítica do RL-OE (CE50 = 4,1 ± 0,4 μg/mL) foi reduzida 2,2 vezes na presença de 5 mM de CsCl (CE50 = 8,9 ± 1,1 μg/mL), bloqueador não seletivo desses canais, confirmando a participação dos canais de K+ no efeito tocolítico do RL-OE. Para verificar qual(is) canal(is) de K+ estariam envolvidos usou-se bloqueadores seletivos desses canais. O fato do TEA+ 1 mM, bloqueador dos canais de K+ de grande condutância ativados por cálcio (BKCa); da apamina, um bloqueador dos canais de K+ ativados por Ca2+ de pequena condutância (SKCa) e da glibenclamida, bloqueador dos canais de K+ sensíveis ao ATP (KATP) não alterarem o efeito tocolítico do RL-OE indica que os BKCa, SKCa e os KATP não estariam envolvidos em seu mecanismo de ação. Entretanto, a curva concentrações-resposta de relaxamento induzida pelo RL-OE foi desviada para direita na presença de 4-aminopiridina, bloqueador dos canais de K+ dependentes de voltagem (Kv), com redução da potência tocolítica do RL-OE (CE50 = 10 ± 0,6 μg/mL), sugerindo o envolvimento dos Kv no mecanismo de ação tocolítica do RL-OE em útero de rata. Conclui-se que o RL-OE exerce efeito tocolítico modulando positivamente os canais de K+, especificamente os Kv, que bloqueariam de modo indireto os canais de cálcio dependentes de voltagem (CaV), resultando no relaxamento da musculatura lisa uterina

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:00:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1650279 bytes, checksum: 848f51aee13c80e0d670d1542b962211 (MD5) Previous issue date: 2010-03-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / 8(17),12E,14-labdatrien-18 oic acid (labdane-302), is a diterpene isolated from the stem bark of Xylopia langsdorfiana A. St.-Hil. & Tul. In a preliminary study, Ribeiro (2003) demonstrated that labdane-302 inhibited in an equipotent manner the phasic contractions induced by carbachol or oxytocin in rat uterus. The aim of the present study was to investigate the spasmolytic action mechanism of labdane-302 in that organ. Isometric and isotonic contractions were monitored and the parameters of relative potency and efficacy were determined from cumulative concentration-response curves. Labdane-302 inhibited the cumulative concentration-response curves to carbachol (pD´2 = 3.4 ± 0.1; r2 = 0.9 ± 0.05) and oxytocin (pD´2 = 3.8 ± 0.2; r2 = 0.9 ± 0.04) these were shifted to the right, in a non-parallel manner (Schild plot slope = 0.15 ± 0.04 and 1.13 ± 0.1 respectively), with reduction of the maximal effect (Emax), suggesting a noncompetitive antagonism. Labdane-302 was not effective in relaxing the uterus pre-contracted by 60 mM KCl (Emax = 9.75 ± 0.07%),on the other hand, relaxed in a significant and concentration dependent manner the rat uterus pre-contracted by oxytocin (pD2 = 4,3 ± 0,06), suggesting a possible involvement of the K+ channels in the spasmolytic effect caused by labdane-302. Because K+ channels play a major role in the regulation of membrane potential and modulation of CaV, we decided to investigate the participation of K+ channels in the spasmolytic action of labdane-302. The relaxant potency of labdane-302 (pD2 = 4.3 ± 0.06) was decreased about 16 times in the presence of CsCl (pD2 = 3.1 ± 0.06), a non-selective K+channels blocker, suggesting a possible involvement of the K+ channels in the tocolytic effect of the labdane-302. In order to verify which subtypes of K+ channels could be involved we used selectives blockers of these channels. The observation that 4-aminopyridine, a selective blocker of voltage-gated K+ channels (Kv), and that glibenclamide, a selective blocker of the ATP-sensitive K+ channels (KATP) did not change the relaxant effect of labdane-302 suggests that KV and KATP are not involved in its action mechanism. However, the log concentration-response curve induced by labdane-302 was shifted to the right in the presence of apamine (pD2 = 3.8 ± 0.03), a selective blocker of the small-conductance calcium-activated K+ channels (SKCa) and TEA+ 1 mM (pD2 = 3.6 ± 0.04), a selective blocker of the large conductance clacium-activated K+ channels (BKca). The involvement of BKCa was confirmed using a specific blocker of that channels iberiotoxin (IbTx) (pD2 = 3.8 ± 0.06) , suggesting the involvement of SKCa and BKCa in the tocolytic action mechanism induced by labdane-302 on uterus rat. The aminophylline a nonselective inhibitor of phosphodiesterases (PDE) potentiated (pD2 = 7.8 ± 0.1) in about 320 times the relaxation produced by labdane-302 in rat uterus. The results suggest that effect of labdane-302 on uterus rat, involves the activation of the SKCa e BKCa, which modulate indirectly the CaV, leading to a decrease the [Ca2+]c , and cyclic nucleotides like cAMP and cGMP may be involved in this tocolytic action / O ácido 8(17),12E,14-labdatrieno-18-óico (labdano-302) é um diterpeno isolado das cascas do caule de Xylopia langsdorfiana A. St.-Hil. & Tul. Em estudos anteriores Ribeiro (2003) demonstrou que o labdano-302 inibiu de maneira eqüipotente as contrações fásicas induzidas por carbacol e ocitocina em útero de rata. Assim, o objetivo desse estudo foi investigar o mecanismo de ação tocolítico do labdano-302. As contrações isométricas e isotônicas foram monitoradas e os parâmetros de potência e eficácia relativas foram determinados a partir de curvas de concentrações-resposta cumulativas. O labdano-302 inibiu as curvas cumulativas ao carbacol (pD´2 = 3,4 ± 0,1; r2 = 0,9 ± 0,05) e ocitocina (pD´2 = 3,8 ± 0,2; r2 = 0,9 ± 0,04) e estas foram desviadas para direita, de forma não paralela ( slope de Schild = 0,15 ± 0,04 e 1,13 ± 0,1 respectivamente), com redução do Emax, sugerindo um antagonismo não competitivo. O labdano-302 não foi eficaz em antagonizar as contrações induzidas por 60 mM de KCl apresentando um Emax = 9,75 ± 0,07%, por outro lado, labdano-302 relaxou de maneira significante e dependente de concentração quando o útero era pré-contraído por ocitocina (pD2 = 4,3 ± 0,06), sugerindo que este diterpeno deve estar agindo por uma modulação positiva de canais para potássio. Os canais para K+ desempenham um papel chave na regulação do potencial de membrana e modulação dos CaV, então decidiu-se investigar a participação desses canais na ação tocolítica do labdano-302. A potência relaxante de labdano-302 (pD2 = 4,3 ± 0,06) foi reduzida em aproximadamente 16 vezes na presença de CsCl (pD2 = 3,1 ± 0,06), bloqueador não seletivo dos canais para K+, confirmando a participação de canais para K+ no efeito relaxante do labdano-302. Para verificar qual(is) canal(is) para K+ estariam envolvidos usou-se bloqueadores seletivos desses canais. O fato da 4-aminopiridina, bloqueador seletivo dos canais para K+ abertos por voltagem (Kv), e da glibenclamida, bloqueador seletivo dos canais para K+ sensíveis ao ATP (KATP) não alterar o efeito relaxante do labdano-302 indica que os KV e os KATP não estariam envolvidos em seu mecanismo de ação tocolítico. Entretanto, a curva concentração-resposta de relaxamento induzida pelo labdano-302 foi desviada para direita na presença de apamina (pD2 = 3,8 ± 0,03), um bloqueador seletivo dos canais para K+ ativados por Ca2+ de pequena condutância (SKCa), ou de tetraetilamônio 1 mM (pD2 = 3,6 ± 0,04), que nesta concentração é um bloqueador seletivo dos canais para K+ de grande condutância ativados por cálcio (BKCa). A participação dos BKCa foi confirmada utilizando um bloqueador específico para esses canais a iberiotoxina (IbTx) (pD2 = 3,8 ± 0,06), sugerindo o envolvimento dos SKCa e dos BKCa no mecanismo de ação tocolítico do labdano-302 em útero isolado de rata. A aminofilina um inibidor não seletivo de fosfodiesterases (PDE) potencializou (pD2 = 7,8 ± 0,1) em cerca de 320 vezes o relaxamento produzido por labdano-302 em útero de rata. Conclui-se que o mecanismo de ação relaxante do labdano-302 em útero isolado de rata envolve a modulação positiva de canais para K+, mais especificamente os SKCa e BKCa, que modulam indiretamente os CaV, levando a uma conseqüente redução da [Ca2+]c , e que nucleotídios cíclicos como o AMPc e GMPc podem estar envolvidos nesta ação.

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2110214 bytes, checksum: 4a28fa47726ea0c494b4de5c87f4f054 (MD5) Previous issue date: 2009-11-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Solanum agrarium Sendtner known popularly as babá , gogóia , and melancia da praia . In folk medicine, the decoction of its roots is used as abortive (AGRA, 1991). In a preliminary study, Santos et al. (2003) demonstrated that crude ethanolic extract of aerial parts from S. agrarium (SA-EtOH) showed non-selective spasmolytic activity on guinea-pig ileum and rat uterus. The aim of the study was evaluate on the cytotoxic potential of SA-EtOH in rats erythrocytes and to investigate the spasmolytic action mechanism on guinea-pig ileum and rat uterus. SA-EtOH extract showed moderate hemolytic activity only at concentration of 243 and 500 μg/mL (Emax = 21.2 ± 3.2%). On guinea-pig ileum, SA-EtOH extract inhibited the cumulative concentration-response curves to carbachol (CCh) and histamine, and these were shifted to the right, in a non-parallel manner, with depression of the maximal effect (Emax), suggesting a noncompetitive antagonism. SA-EtOH extract relaxed in a significant and concentration dependent manner the ileum pre-contracted with 40 mM KCl (EC50 = 17.4 ± 3.5 μg/mL), 10-6 M CCh (EC50 = 119.4 ± 24.3 μg/mL) or 10-6 M histamine (EC50 = 18.7 ± 4.6 μg/mL), suggesting that SA-EtOH extract could be acting on voltage-gated Ca2+ channels (Cav). This assumption was confirmed by observation that SA-EtOH extract antagonized the CaCl2 induced contractions in the depolarizing medium without Ca2+. The finding that SA-EtOH extract relaxed (EC50 = 187.2 ± 27.3 μg/mL) the guinea-pig ileum pre-contracted with S-(-)-BAY K8644 suggests that the Ca2+ channel subtype involved is the CaV1. As the SA-EtOH extract was more potent in relaxing the body pre-contracted with KCl than by S-(-)-Bay K8644, it is suggestive of indirect blockade of the Cav1. We decided to investigate the participation of K+ channels in the spasmolytic action of SA-EtOH extract. The relaxation curve induced by SA-EtOH extract was rightward displacement only in the presence of tetraethylammonium (TEA+) 1 mM, this concentration is a selective blocker of the large conductance clacium-activated K+ channels (BKca) (EC50 = 37.7 ± 4.9 μg/mL) and 4-aminopyridine, selective blocker of the voltage activated K+ channels (Kv) (EC50 = 48.9 ± 6.2 μg/mL). On rat uterus, SA-EtOH extract inhibited the cumulative concentration-response curves to oxytocin, and these were shifted to the right, in a non-parallel manner, with depression of the maximal effect (Emax) suggesting a noncompetitive antagonism. SA-EtOH extract did not effective at relax the uterus pre-contracted with 60 mM KCl (Emax = 10.5 ± 5.0%), however relaxed in a significant and concentration dependent manner the rat uterus pre-contracted with 10-2 UI/mL (EC50 = 56.3 ± 8.2 μg/mL). Therefore, suggesting that SA-EtOH extract could be promoting its spasmolytic effect of indirect blockade influx Ca2+ by Cav, as observed in guinea-pig ileum. However, the relaxation curve induced by SA-EtOH extract was rightward displacement only in the presence of glibenclamide (EC50 = 124.8 ± 21.0 μg/mL), selective blocker of the ATP-sensitive K+ channels (KATP), different from that observed in guinea-pig ileum. These results suggest that SA-EtOH extract is not promoting the membrane injury on rat erythrocytes and that the spasmolytic action mechanism of SA-EtOH extract involves modulation/activation of BKCa and KV on guinea-pig ileum, and of KATP on rat uterus. / Solanum agrarium Sendtner é conhecida popularmente por babá , gogóia e melancia da praia . O decocto da raiz é empregado popularmente como abortivo (AGRA, 1991). Em estudos anteriores, Santos et al., (2003) demonstraram que o extrato etanólico bruto obtido das partes aéreas de S. agrarium (SA-EtOH) apresentou atividade espasmolítica não seletiva em íleo de cobaia e útero de rata. O objetivo desse estudo foi avaliar o potencial citotóxico do extrato SA-EtOH em eritrócitos de rato e investigar o mecanismo de ação espasmolítica em íleo de cobaia e útero de rata. O extrato SA-EtOH apresentou uma atividade hemolítica moderada apenas nas concentrações de 243 e 500 μg/mL (Emax = 21,2 ± 3,2%). Em íleo de cobaia, o extrato SA-EtOH inibiu as curvas cumulativas ao carbacol (CCh) e à histamina e estas foram desviadas para a direita de maneira não paralela com redução do Emax, sugerindo um antagonismo não competitivo. O extrato SA-EtOH relaxou de maneira dependente de concentração e significante o íleo de cobaia pré-contraído com 40 mM de KCl (CE50 = 17,4 ± 3,5 μg/mL), ou com 10 6 M de CCh (CE50 = 119,4 ± 24,3 μg/mL) ou de histamina (CE50 = 18,7 ± 4,6 μg/mL), sugerindo que o extrato SA-EtOH deve estar agindo bloqueando os canais de Ca2+ dependentes de voltagem (CaV). A confirmação desta hipótese veio com a observação de que o extrato SA-EtOH antagonizou as contrações induzidas por CaCl2 em meio despolarizante nominalmente sem Ca2+. O fato do extrato SA-EtOH ter relaxado (CE50 = 187,2 ± 27,3 μg/mL) o íleo pré-contraído com S-(-)-BAY K 8644 sugere que o canal de Ca2+ envolvido é o tipo CaV1. Como a potência relaxante do extrato SA-EtOH foi maior quando o órgão foi pré-contraído com KCl do que pelo S-(-)-Bay K8644, isto é sugestivo de que há um bloqueio indireto dos Cav1. Decidiu-se investigar a participação dos canais de K+ na ação espasmolítica do SA-EtOH. A curva de relaxamento induzida pelo extrato SA-EtOH foi desviada para direita apenas na presença de tetraetilamônio (TEA+) 1 mM, nessa concentração um bloqueador dos canais de K+ ativados por Ca2+ de grande condutância (BKCa) (CE50 = 37,7 ± 4,9 μg/mL) e na de 4-aminopiridina, bloqueador dos canais de K+ operados por voltagem (KV) (CE50 = 48,9 ± 6,2 μg/mL). Em útero de rata, o extrato SA-EtOH inibiu as curvas cumulativas à ocitocina e esta foi desviada para a direita de maneira não paralela com redução do Emax, sugerindo um antagonismo não competitivo. O extrato SA-EtOH não foi eficaz em relaxar o útero pré-contraído com 60 mM de KCl (Emax = 10,5 ± 5,0%), entretanto relaxou de maneira dependente de concentração o útero pré-contraído com 10-2 UI/mL ocitocina (CE50 = 56,3 ± 8,2 μg/mL). Diante deste fato, pode-se sugerir que o extrato SA-EtOH pode estar promovendo seu efeito espasmolítico pelo bloqueio indireto do influxo de Ca2+ através dos CaV, assim como o observado em íleo de cobaia. Entretanto, a curva de relaxamento induzida pelo extrato SA-EtOH foi desviada para direita apenas na presença de glibenclamida (CE50 = 124,8 ± 21,0 μg/mL), bloqueador seletivo dos canais de K+ sensíveis ao ATP (KATP), diferente do observado em íleo de cobaia. Esses resultados são sugestivos de que o extrato SA-EtOH não esteja promovendo injúrias a membrana dos eritrócitos de ratos e que o mecanismo de ação espasmolítica do extrato SA-EtOH se dá pela modulação/ativação dos BKCa e KV em íleo de cobaia e pelos KATP em útero de rata.

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Isometric contractions were recorded to determine and compare the relative efficacy and potency (n = 5). Considering that the NO pathway can negatively modulate the CaV, we decided to evaluate this participation on rat uterus pre-contracted by oxytocin. For that, it was employed L-NAME, a non-selective inhibitor of NO synthase (NOS). The results show that the tocolytic potency of LM-OE (EC50 = 2.7 ± 0.6 μg/mL) was approximately 9.5-fold attenuated in the presence of L-NAME (EC50 = 25.6 ± 3.9 μg/mL). Furthermore, this reduction was reversed in the presence of the L-arginine (EC50 = 6.2 ± 1.7 μg/mL), a NOS substrate, and simultaneous presence of the L-arginine and L-NAME (EC50 = 7.2 ± 1.4 μg/mL), confirming the participation of NO pathway in the tocolytic action of LM-OE. Similarly, the relaxant potency of LM-OE was approximately 3.7-fold reduced in the presence of ODQ (EC50 = 10.1 ± 0.9 μg/mL), a soluble guanylate cyclase (sGC) inhibitor, and 3.3-fold in the presence of Rp-8-Br-PET-cGMPS (EC50 = 8.9 ± 0.9 μg/mL), a protein kinase G (PKG) inhibitor. Thus, LM-OE positively modulates the NO/sGC/PKG pathway to promote its tocolytic effect on rat. Given that this pathway can activate the K+ channels, it was questioned if these channels would be involved on tocolytic effect of LM-OE. To confirm this hypothesis, experiments were made in the presence of CsCl, a non-selective K+ channels blocker, and it was observed that the concentration-response curve of LM-OE (EC50 = 2.7 ± 0.6 μg/mL) was rightward shifted with an approximately 4.3-fold reduction on its relaxant potency, confirming the participation of K+ channels on tocolytic effect of essential oil. In order to verify the subtypes involved, it was employed selective blockers of K+ channels. Control concentration-response curve was also shifted to the right and the tocolytic potency of LM-OE was attenuated in the presence of tetraethylammonium (EC50 = 10.5 ± 0.3 μg/mL), apamin (EC50 = 10.0 ± 1.0 μg/mL), 4-aminopyridine (EC50 = 12.4 ± 2.0 μg/mL) and glibenclamide (EC50 = 9.7 ± 0.9 μg/mL), the large (BKCa) and small conductance (SKCa) calcium-activated, voltage-gated (KV) and adenosine triphosphate-sensitive (KATP) potassium channels blockers, respectively. Moreover, LM-OE had its tocolytic potency reduced in the same intensity when these four blockers were simultaneously incubated (EC50 = 16.6 ± 2.6 μg/mL), not observing synergistic effect. Therefore, the tocolytic action mechanism of LM-OE on rat involves the positive modulation of the NO/sGC/PKG/K+ channels pathway, suggesting the blockade of calcium influx through CaV, leading to the relaxation of uterine smooth muscle. / Lippia microphylla Cham. (Verbenaceae), conhecida como “alecrim-do-mato”, “alecrim-de-tabuleiro” e “alecrim-pimenta”, é usada popularmente como antisséptico ou para tratar distúrbios respiratórios. Das folhas dessa espécie foi extraído o óleo essencial (LM-OE) que, de acordo com Silva (2013), apresentou efeito tocolítico em útero isolado de rata, indicando uma provável inibição indireta do influxo de Ca2+ através dos canais de cálcio dependentes de voltagem (CaV). Diante disso, o objetivo deste trabalho foi caracterizar o mecanismo de ação tocolítica do LM-OE em rata. As contrações isométricas foram monitoradas para determinar e comparar a eficácia e a potência relativas (n = 5). Tendo em vista que os CaV podem ser modulados negativamente pela via do óxido nítrico (NO), decidiu-se avaliar a participação dessa via em útero de rata pré-contraído com ocitocina. Para tanto, utilizou-se L-NAME, um inibidor não seletivo de sintase do NO (NOS). Os resultados evidenciaram que a potência tocolítica do LM-OE (CE50 = 2,7 ± 0,6 μg/mL) foi reduzida em aproximadamente 9,5 vezes, na presença de L-NAME (CE50 = 25,6 ± 3,9 μg/mL), sendo essa redução revertida na presença de L-arginina (CE50 = 6,2 ± 1,7 μg/mL), substrato para a NOS, e na presença simultânea de L-arginina e de L-NAME (CE50 = 7,2 ± 1,4 μg/mL), confirmando o envolvimento da via do NO na ação tocolítica do LM-OE. Semelhantemente, a potência relaxante do LM-OE foi reduzida em aproximadamente 3,7 vezes na presença de ODQ (CE50 = 10,1 ± 0,9 μg/mL), inibidor de ciclase de guanilil solúvel (sGC), e 3,3 vezes na presença de Rp-8-Br-PET-cGMPS (CE50 = 8,9 ± 0,9 μg/mL), inibidor de proteína cinase G (PKG). Sendo assim, o LM-OE modula positivamente a via do NO/sCG/PKG para promover seu efeito tocolítico em rata. Uma vez que essa via pode ativar canais de K+, questionou-se se esses canais estariam participando do efeito tocolítico do LM-OE. Para confirmar essa hipótese, foram realizados experimentos na presença de CsCl, bloqueador não seletivo de canais de K+, e observou-se que a curva concentração-resposta do LM-OE (CE50 = 2,7 ± 0,6 μg/mL) foi desviada para a direita com redução da potência relaxante (CE50 = 11,7 ± 1,5 μg/mL) em aproximadamente 4,3 vezes, confirmando a participação dos canais de K+ no efeito tocolítico do óleo essencial. Para verificar quais seriam esses subtipos de canais utilizou-se bloqueadores seletivos. A curva controle concentração-resposta também foi desviada para a direita e a potência tocolítica reduzida na presença de tetraetilamônio (CE50 = 10,5 ± 0,3 μg/mL), de apamina (CE50 = 10,0 ± 1,0 μg/mL), de 4-aminopiridina (CE50 = 12,4 ± 2,0 μg/mL) e de glibenclamida (CE50 = 9,7 ± 0,9 μg/mL), bloqueadores de canais de potássio: ativados por cálcio de grande (BKCa) e de pequena condutância (SKCa), dependentes de voltagem (KV) e sensíveis ao trifosfato de adenosina (KATP), respectivamente. Ademais, o LM-OE teve sua potência tocolítica reduzida quando esses quatro bloqueadores foram pré-incubados simultaneamente (CE50 = 16,6 ± 2,6 μg/mL), não sendo observado efeito sinérgico. Assim, o mecanismo de ação tocolítica do LM-OE em rata envolve a modulação positiva da via NO/sGC/PKG/canais de K+, sugerindo o bloqueio do influxo de cálcio via CaV e, consequentemente, o relaxamento do músculo liso uterino.