Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / IntroduÃÃo: Cerca de 52% dos homens na faixa etÃria entre 40 e 70 anos sofrem de disfunÃÃo erÃtil (DE). A ioimbina (IOI), um inibidor adrenÃrgico &#945;2, vem sendo usada no tratamento da DE hà dÃcadas, e ainda tem as suas indicaÃÃes, porÃm seu mecanismo de aÃÃo ainda permanece obscuro. A maior parte dos estudos com IOI foi realizada em corpos cavernosos e aorta de ratos e coelhos, devido à dificuldade de se obter tecido humano. O objetivo deste estudo à definir o mecanismo de aÃÃo nÃo-adrenÃrgico nÃo-colinÃgico da IOI, avaliando a via nitrÃrgica e a via dos canais iÃnicos no mÃsculo liso de corpo cavernoso humano. MÃtodos: Os corpos cavernosos foram retirados de 13 doadores cadÃveres masculinos (idade 18-53 anos), durante cirurgia pra retirada de ÃrgÃos para transplante, seguindo os protocolos de doaÃÃo de tecidos. As tiras de mÃsculo cavernoso humano foram montadas verticalmente em paralelo, em banho de registro isomÃtrico em soluÃÃo de KHS (pH 7,4, a 37ÂC), constantemente aerada (O2-95% e CO2-5%). Foram realizadas curvas dose-resposta com IOI (10-12 â10-4 M) em tiras de corpos cavernosos de humanos prÃ-contraÃdas com fenilefrina (10 ÂM) e com soluÃÃo despolarizante rica em potÃssio (60 mM de K+), em associaÃÃo com inibidores da via nitrÃrgica e da via de canais iÃnicos (Na+, K+ e Cl-), para estudo das vias NANC. Resultados: A IOI obteve relaxamento importante das tiras de corpo cavernoso humano in vitro na dose 10-4 M. ApÃs prÃ-contraÃÃo com fenilefrina (10 ÂM), as tiras submetidas à IOI nesta dose, relaxaram 95,8%, e quando a prÃ-contraÃÃo foi realizada com soluÃÃo despolarizante rica em K+ (60 mM de K+), Ca++ (2 mM), contendo 10 ÂM guanetidina (simpatolÃtico quÃmico) e 10 ÂM fentolamina (bloqueador &#945;-adrenÃrgico), o relaxamento foi de 69,5% (p<0,05). A IOI (10-4M), apÃs prÃ-contraÃÃo com fenilefrina (10 ÂM), e na presenÃa de 7- NI (10ÂM) e do L-NAME (100ÂM) (bloqueadores das enzimas Ãxido nÃtrico sintetases constitutivas (nNOS e eNOS, respectivamente)) e do ODQ (inibidor da enzima guanilato ciclase solÃvel - 10ÂM) proporcionou relaxamento do mÃsculo cavernoso humano de 57,4%; 55,5%; 62,99%; respectivamente (p<0,05). Em associaÃÃo com TTX (Tetrodotoxina - bloqueador do canal de sÃdio neuronal - 100ÂM), TEA (tetraetilamonio - bloqueador de canais de potÃssio voltagem-dependentes ativados por cÃlcio - 100ÂM), e com apamina + charybdotoxina (inibidores dos canais de potÃssio ativados por cÃlcio de baixa, mÃdia e alta condutÃncia -0,1ÂM + 1ÂM), obteu-se relaxamento de 56,4%; 100%; 100% respectivamente (p>0,05). Jà com a glibenclamida (inibidor dos canais de KATP e de Cl- - 10ÂM), proporcionou relaxamento de 71,1% (p<0,05). ConclusÃo: Os resultados dos estudos farmacolÃgicos sugerem que a IOI relaxa o corpo cavernoso de humano por mecanismo outro que nÃo o seu bloqueio adrenÃrgico, possivelmente ativando a via nitrÃrgica, e via canais de KATP e de CL- (NO â GUANILATO CICLASE â GMPc â canais de KATP e de cloreto). A IOI nÃo age via canais de Na+, e nem atua via canais de potÃssio voltagem-dependentes ativados por cÃlcio, como tambÃm nÃo age nos canais de potÃssio ativados por cÃlcio de baixa, mÃdia e alta condutÃncia. Palavras-chave: ioimbina, corpo cavernoso, disfunÃÃo erÃtil, canais de K+. / Introduction: About 52% of men aged between 40 and 70 years old suffer with erectile dysfunction (ED). Yohimbine (YOH), an &#945;2-adrenergic blocker, has been used for ED treatment for several decades, and it still has its indications. However its mechanism of action still remains obscure. Most of the studies with YOH were made with corpus cavernosum and aorta of rats and rabbits, due to the difficulty of getting human tissue. The aim of this study is to define the non-cholinergic non-adrenergic mechanism of action of the YOH, evaluating the nitrergic pathway and the role of the ionic channels in the human cavernosum smooth muscle. Methods: The corpus cavernosum were removed from 13 male cadavers donors (18-53 years old), during surgery for removing of organs for transplant, following the national protocols for organs donation. The strips of human cavernosum muscle were vertically settled in parallel, in isometric register bath in KHS solution (pH 7,4, at 37ÂC), constantly gassed with (O2-95% and CO2-5%). Curves dose-reply were performed with IOI (10-12 - 10-4 M) in strips of human corpus cavernosum beings pre-contracted with phenilefrine (10 ÂM) and with rich depolarizing solution in potassium (60 mM of K+), in association with nitrergic and ionic channels inhibitors (Na+, K+ and Cl-), for study of NANC ways. Results: The YOH provided an important relaxation for the strips of in vitro human corpus cavernosum under the dose of 10-4 M. After pre-contraction with phenilefrine (10 ÂM), the strips submitted to the YOH in this dose, got relaxed 95.8%, and when the pre-contraction was made with rich depolarizing K+ solution (60 mM of K+), Ca++ (2 mM), containing 10 ÂM guanethidine (chemical simpatolitic) e 10ÂM phentolamine (&#945;-adrenergic blocker), the relaxation was of 69,5% (p<0,05). The YOH (10-4M), after pre-contraction with fenilefrina (10 ÂM), under the presence of 7-NI (10 ÂM) and of L-NAME (100 ÂM) (nitric oxide synthases inhibitors (nNOS and eNOS, respectively)), and of the ODQ (soluble guanylate cyclase enzyme inhibitor â 10 ÂM) provided relaxation of the human cavernosum muscle of 57,4%; 55.5%; 62.99%; respectively (p<0,05). In association with TTX (Tetrodotoxina - neuronal sodium channel inhibitor â 100 ÂM), TEA (tetraetilamonio - potassium channels voltage-dependents activated by calcium blocker â 100 ÂM), and with apamina + charybdotoxina (potassium channels activated by calcium blocker of low and high conductance - 0,1 ÂM + 1 ÂM), we got a relaxation of 56,4%; 100%; 100% respectively (p>0,05). With the glibenclamida (KATP and Cl- channels blocker â 10 ÂM), we got a 71,1% relaxation (p<0,05). Conclusion: The pharmacologic studies results suggest that the YOH relaxes the human corpus cavernosum by another mechanism different of his adrenergic blockade, possibly activating the nitrergic pathway, and through Cl- and KATP channels (NO - GUANILATO CICLASE - GMPc - chloride and KATP channels). The YOH doesnât act through Na+ channels, and doesnât act through potassium channels voltage-dependents activated by calcium, as well as it doesnât act in the K+ channels activated by calcium of low and high conductance.

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.PDF: 7069577 bytes, checksum: 994737d813443da6d7f127b17873faf9 (MD5) Previous issue date: 2012-03-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The flavonoid galetin 3,6 dimethyl ether (FGAL) was isolated from the aerial parts of Piptadenia stipulacea (Benth.) Ducke and was investigated its possible hemolytic activity in rat erythrocytes and spasmolytic activity in several isolated smooth muscles as rat uterus, guinea pig ileum and trachea, and rat aorta. FGAL showed no hemolytic effect on rat erythrocytes, which is suggestive of a low toxicity. In preliminary pharmacological screening performed in smooth muscle models, FGAL showed non-selective spasmolytic effect in the four organs tested, with a higher potency to relax the guinea pig trachea pre-contracted with carbachol and rat aorta pre-contracted with phenylephrine (FEN) in a functional epithelium and endothelium independent manner, respectively. The aim of this study was to investigate the action mechanism of FGAL relaxing effect in guinea pig trachea and rat aorta. The observation that FGAL was more potent in relaxing both pre-contracted organs with moderate increases in extracellular concentration of KCl than when contracted with larger increases of KCl is suggestive that FGAL modulates the channels positivety. This hypothesis was confirmed by decreasing of relaxant potency of FGAL in both organs in the presence of tetraethylammonium (TEA+) 10 mM, non-selective blocker of K+ channels. To determine the subtypes of K+ channel involved, were used selectives blockers: in trachea the effect of FGAL was not altered in the presence of TEA+ 1 mM, blocker of large conductance calcium-activated K+ channels (BKCa); glibenclamide, blocker of sensitive-ATP K+ channels (KATP); BaCl2, blocker of inward rectifier K+ channels (Kir) or 4-AP, blocker of voltage activated K+ channels (KV), but was reduced in the presence of apamin, blocker of small conductance calcium-activated K+ channels (SKCa). In aorta, the relaxant effect of FGAL was not altered in the presence of TEA+ 1 mM, but was reduced in the presence of apamin, glibenclamide, BaCl2 and 4-AP, suggesting the involvement of SKCa, KATP, Kir and KV in vasorelaxant action of flavonoid. The fact of FGAL rightward shifted, with Emax reduced the CaCl2-induced contractions in depolarizing medium, and CaCl2 in the presence of verapamil, a voltage activated calcium channel (CaV) blocker, and FEN, suggests the involvement of CaV and ROCs (receptor-operated calcium channel), respectively. Also in the aorta, FGAL inhibited FEN induced contractions in Ca2+-free medium, suggesting inhibition of Ca2+ release from the sarcoplasmic reticulum SR. We also evaluated the participation of the cyclic nucleotides pathway, and observed that the trachea and aorta relaxation induced by aminophylline, non selective inhibitor of phosphodiesterases (PDEs), was more potent in the presence of FGAL, suggesting the involvement of cAMP and/or cGMP. On the aorta was assessed FGAL effect on relaxation induced by selective inhibitors of PDE-3 (milrinone, cAMP selective) and PDE-5 (sildenafil, cGMP selective), and FGAL only potentiated the relaxation induced by sildenafil, suggesting the participation of cGMP. Since K+ channels are modulated negatively by PKC, we investigated a possible inhibition of PKC by FGAL and the flavonoid relaxed the aorta pre-contracted with a PKC activator (PMA), suggesting inhibition of this enzyme. In conclusion, the spasmolytic mechanism of FGAL in trachea involves positive modulation of SKCa and cyclic nucleotides, and in the aorta involves the positive modulation of KATP, SKCa, Kir, Kv and inhibition of CaV, ROCs, Ca2+ release of SR, PDE-5 and PKC. / O flavonoide 3,6-dimetil éter galetina (FGAL) foi isolado das partes aéreas de Piptadenia stipulacea (Benth.) Ducke e foi investigada sua possível atividade hemolítica em eritrócitos de rato e espasmolítica em vários músculos lisos isolados como útero de rata, íleo e traqueia de cobaia, e aorta de rato. FGAL não causou efeito hemolítico em eritrócitos de ratos, o que é sugestivo de baixa toxicidade. Na triagem farmacológica preliminar realizada em músculos lisos, FGAL apresentou efeito espasmolítico não seletivo nos 4 órgãos testados, apresentando uma maior potência em relaxar a traqueia de cobaia pré-contraída com carbacol e a aorta de rato pré-contraída com fenilefrina (FEN), de maneira independente de epitélio e endotélio funcional, respectivamente. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar o mecanismo de ação relaxante de FGAL em traqueia de cobaia e aorta de rato. A observação de que FGAL foi mais potente em relaxar ambos os órgãos pré-contraídos com aumentos moderados na concentração extracelular de KCl do que quando contraídos com aumentos maiores de KCl é sugestivo de que FGAL está agindo por modular positivamente os canais de K+, hipótese esta confirmada pela diminuição da potência relaxante de FGAL em ambos os órgãos na presença de tetraetilamônio (TEA+) 10 mM, bloqueador não seletivo dos canais de K+. Para verificar os subtipos de canais de K+, usou-se bloqueadores seletivos: em traqueia o efeito de FGAL não foi alterado na presença de TEA+ 1 mM, bloqueador dos canais K+ de grande condutância ativados pelo Ca2+ (BKCa), glibenclamida, bloqueador dos canais de K+ sensíveis ao ATP (KATP), BaCl2, bloqueador dos canais de K+ retificadores de entrada (Kir) ou de 4-AP, bloqueador dos canais de K+ sensíveis à voltagem (KV), porém foi reduzido na presença de apamina, bloqueador dos canais de K+ de pequena condutância ativados pelo Ca2+ (SKCa). Em aorta, o efeito relaxante de FGAL não foi alterado na presença de TEA+ 1 mM, por outro lado foi reduzido na presença de apamina, glibenclamida, BaCl2 e 4-AP, sugerindo a participação dos SKCa, KATP, Kir e KV na ação vosorrelaxante do flavonoide. O fato de FGAL deslocar para direita com redução do Emax as contrações induzidas por CaCl2 em meio despolarizante, e por CaCl2 na presença de FEN e verapamil, bloqueador de CaV, sugere o envolvimento dos CaV e dos ROCs, respectivamente. Ainda em aorta, FGAL inibiu as contrações induzidas por FEN em meio livre de Ca2+, sugerindo inibição da liberação de Ca2+ do retículo sarcoplasmático (RS). Avaliou-se ainda a participação dos nucleotídios cíclicos, e observou-se que o relaxamento induzido pela aminofilina, inibidor não seletivo de fosfodiesterases (PDEs) em traqueia e aorta foi potencializado com FGAL, sugerindo a participação de AMPc e/ou GMPc. Em aorta foi avaliado o efeito de FGAL sobre o relaxamento induzido com inibidores seletivos de PDE-3 (milrinona, seletiva para AMPc) e PDE-5 (sildenafila, seletiva para GMPc), sendo que FGAL só potencializou o relaxamento induzido por sildenafila, sugerindo a participação do GMPc. Como os canais de K+ são modulados negativamente pela PKC, investigou-se uma possível inibição da PKC por FGAL, que relaxou a aorta pré-contraída com o ativador de PKC (PMA), sugerindo inibição dessa enzima. Em conclusão, o mecanismo de ação espasmolítica de FGAL em traqueia envolve modulação positiva dos SKCa e dos nucleotídios cíclicos, e em aorta modulação positiva dos KATP, SKCa, Kir, KV; inibição dos CaV e dos ROCs, da liberação de Ca2+ do RS, da PDE-5 e PKC.

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2017-02-20T11:58:45Z No. of bitstreams: 1 arquivo total.pdf: 1664038 bytes, checksum: 10c74036755f7796ffefc80faf342151 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-20T11:58:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivo total.pdf: 1664038 bytes, checksum: 10c74036755f7796ffefc80faf342151 (MD5) Previous issue date: 2016-11-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Organic nitrates have been used in cardiovascular disorders therapy because they work as nitric oxide (NO) donors. The present study aimed to characterize the 2-nitrate-1,3-dioctanoxypropan (NDOP), an organic nitrate synthesized from glycerin as a NO donor. The ability of NO release elicited by NDOP was evaluated in vascular smooth muscles cells (VSMC) from aorta and in vascular reactivity essays in thoracic aorta rings from C57BL/6 mice pre-contracted with phenylephrine. In addition, in vitro tolerance for NDOP and the acute pre-clinical toxicity to its oral administration (v.o.) (300 and 2000 mg/kg) were evaluated. The treatment with NDOP increased NO levels in VSMC when compared to cells stimulated with DAF probe only (53,20 ± 1,61 vs. 10,74 ± 0,86 a.u., n = 13 and 13, respectively, p < 0.05). The NO increase in VSMC was not inhibited by endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor, L-NG-Nitroarginine (L-NNA, 100 μM) (52,80 ± 2,89 vs. 53,75 ± 2,18 a.u., n = 13 each). NDOP (10-8 – 10-3 M) induced endothelium-independent vasorelaxant effect in aorta from mice (Emax = 102,6 ± 1,7% vs. 107,3 ± 7,5%, n = 8 and 6, respectively). Pre-incubation with NOS blocker, L-NAME (100 μM) did not change the vasorelaxant response in functional endothelium rings (Emax= 112,5 ± 7,4%, n = 7). However the vasorelaxant effect to NDOP in rings without functional endothelium was decreased by pre-treatment with NO scavenger, 2-phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-oxide (PTIO, 300 μM) (Emax= 75,7 ± 5,6%, n = 7, p < 0.05) and by PTIO + hydroxocobalamin (Emáx= 38,8 ± 4,6%, n = 4, p < 0.05). The soluble guanylyl cyclase (sGC) selective inhibitor, 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one (ODQ, 10 μM), reduced the NDOP vasorelaxant response (Emáx = 22,2 ± 6,7%, n = 6, p < 0.05). When rings were contracted with modified Krebs solution by KCl 60 mM, NDOP maximum relaxation efficiency was attenuated (Emax = 80,4 ± 5,2%; n = 6, p < 0,05). The unspecified inhibition of potassium channels (K+) using Krebs depolarizing solution in addition to KCl 20 mM reduced the efficiency of relaxation induced by NDOP (Emax= 72,8 ± 3,4%; n = 6, p < 0.05). Specific blocking of BKca by TEA (1 mM), Kv by 4-aminopyridine (4-AP; 1 mM) or KATP by glybenclamide (GLIB, 10 μM) did not change the standard relaxing curve for NDOP. However, the pre-incubation with barium chloride (BaCl2, 30 μM), an inward-rectifier potassium channels (KIR) blocker reduced the relaxation effect induced by NDOP (Emax= 73,7 ± 5,7%, n = 6, p <0.05). In aorta rings pre-incubation with NDOP (10-4 M), the vasorelaxation induced by NDOP was reduced in rings with endothelium (Emax= 49,4 ± 3,5% vs. 102,6 ± 1,7%; n = 7 and 8, respectively, p < 0.05) and without endothelium (Emax= 44,1 ± 5,9% vs. Emax= 107.3 ± 7.5%, n = 6 and 6, respectively, p < 0.05). Oral administration of NDOP (300 and 2000 mg/kg) in female mice demonstrated that the compound present low pre-clinical acute toxicity and the DL50 was about 5000 mg/kg. The results demonstrate that NDOP acts as a NO donor in VSMC and produce vasorelaxation via NO-cGMP-PKG pathway and activation of KIR channels. However, although the low pre-clinical acute toxicity, NDOP demonstrate to induce vascular tolerance in vitro. / Nitratos orgânicos têm sido utilizados na terapia de desordens cardiovasculares pois são doadores de óxido nítrico (NO) e podem mimetizar o papel do NO endógeno. O presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de caracterizar o 2-nitrato-1,3-di(octanoxi)propano (NDOP), um nitrato orgânico sintetizado a partir da glicerina, como um doador de NO. A capacidade de liberação de NO eliciada pelo NDOP foi avaliada em células de músculo liso vascular (CMLV) de artéria aorta e em ensaios de reatividade vascular em anéis de aorta torácica de camundongos (Mus musculus) C57BL/6 pré-contraidos com fenilefrina. Em adição, foi também avaliada a tolerância in vitro para o NDOP e a toxicidade aguda pré-clinica frente sua administração via oral (v.o.) (300 e 2000 mg/kg) em camundongos fêmeas. O tratamento com NDOP aumentou os níveis de NO nas CMLV quando comparado às células estimuladas apenas com a sonda DAF (53,20 ± 1,61 vs.10,74 ± 0,86 a.u., n = 13 e 13, respectivamente, p < 0,05). O aumento de NO nas CMLV não foi inibido pelo bloqueio da enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) utilizando L-NG-Nitroarginina (L-NNA, 100 μM) (52,80 ± 2,89 vs. 53,75 ± 2,18 a.u., n = 13 e 13, respectivamente). O NDOP (10-8 – 10-3 M) induziu efeito vasorrelaxante em aorta torácica de camundongo C57BL/6 com e sem endotélio funcional de forma semelhante (Emáx = 102,6 ± 1,7% vs. 107,3 ± 7,5%, n = 8 e 6, respectivamente). A pré-incubação com o bloqueador da NOS, L-NAME (100 μM) não alterou a resposta vasorrelaxante em anéis com endotélio funcional (Emáx= 112,5 ± 7,4%, n = 7). Por outro lado, o efeito vasorrelaxante do NDOP em anéis sem endotélio funcional foi diminuído pelo pré-tratamento com o sequestrador de NO, 2-(4-fenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxi-3-óxido (PTIO, 300 μM) (Emáx= 75,7 ± 5,6%, n = 7, p < 0,05) e pelo PTIO juntamente com a hidroxicobalamina (Emáx= 38,8 ± 4,6%, n = 4, p < 0,05). O uso do 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-ona (ODQ, 10 μM), um inibidor seletivo da enzima ciclase de guanilil solúvel (CGs) reduziu a resposta vasorrelaxante do NDOP (Emáx = 22,2 ± 6.7%, n = 6, p < 0,05). Quando os anéis foram contraídos com a solução de Krebs modificada com KCl 60 mM, a eficiência máxima de relaxamento do NDOP foi atenuada (Emáx = 80,4 ± 5,2%; n = 6, p < 0,05). O bloqueio inespecífico dos canais para potássio (K+) com solução despolarizante de Krebs adicionada de KCl 20 mM reduziu a eficácia do relaxamento induzido pelo NDOP (Emáx = 72,8 ± 3,4%; n = 6, p < 0,05). O uso de TEA (1 mM), 4-aminopiridina (1 mM) e Glibenclamida (10 μM) para bloqueio dos canais BKCa, KV e KATP, respectivamente, não alterou o vasorrelaxamento induzido pelo NDOP. Entretanto, a pré-incubação dos anéis com cloreto de bário (BaCl2, 30 μM), inibidor dos canais para K+ retificadores de entrada (KIR) reduziu a eficiência de relaxamento induzido pelo NDOP (Emáx= 73,7 ± 5,7%, n = 6, p < 0,05). A pré-exposição dos anéis ao NDOP (10-4 M), durante 30 minutos, diminuiu o vasorrelaxamento induzido pelo composto em anéis com endotélio (Emáx= 49,4 ± 3,5% vs. 102,6 ± 1,7%; n = 7 e 8, respectivamente, p < 0,05) e sem endotélio vascular (Emáx= 44,1 ± 5,9% vs. Emáx= 107,3 ± 7,5%, n = 6 e 6, respectivamente, p < 0,05). A administração (v.o.) de 300 e 2000 mg/kg do NDOP em camundongos fêmeas demonstrou que o composto apresenta baixa toxicidade aguda pré-clínica e a DL50 foi aproximadamente 5000 mg/kg. Os resultados demonstram que NDOP atua como doador de NO em CMLV e que o vasorrelaxamento induzido pelo NDOP envolve a ativação dos canais para K+ do tipo KIR e a participação da CGs por meio da via NO-GMPc-PKG. Entretanto, apesar da baixa toxicidade aguda pré-clínica, o NDOP demostrou provocar tolerância vascular in vitro.

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2017-07-07T13:53:50Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2546672 bytes, checksum: c5c0e26a4ec7b88d290cf26347b25d8f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-07T13:53:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2546672 bytes, checksum: c5c0e26a4ec7b88d290cf26347b25d8f (MD5) Previous issue date: 2014-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Various epidemiological studies have suggested an association between diets rich in polyphenols and a lower risk of cardiovascular disease. Syzygium jambulanum is rich in polyphenols, and thus, the objective of this work was to evaluate the cardiovascular effects induced by lyophilized Syzygium jambulanum fruit juice (LSFSJ) using in vivo and in vitro techniques. LSFSJ presented a high polyphenols content (988.55 ± 5.41 mg of Gal Acid / 100g), and the presence of flavonoids and steroids. In normotensive rats, LSFSJ (5, 10, 30, 50 and 100 mg / kg, i.v.) induced hypotension and bradycardia at the maximal dose was observed. In superior mesenteric rat artery rings pre-contracted with phenylephrine (FEN) (1 μM), LSFSJ (1 - 5000 μg / mL) induced concentration-dependent relaxation in the presence (MR = 105.3 ± 3.54% (EC50 = 1172.7 ± 116.1 μg / mL) and absence of endothelium (MR = 106.4 ± 4.5%, EC50 = 1506.5 ± 148.1 μg / mL). These data suggest that the LSFSJ-induced response appears independent from endothelium released factors. All subsequent experiments were performed in the absence of endothelium. The LSFSJ contraction response induced by depolarizing tyrode solution with 60 mM KCl (MR = 28.7 ± 2.8%) was significantly lower than the LSFSJ response in FEN induced contraction. To investigate the involvement of potassium channels, depolarizing tyrode solution with 20 mM KCl or TEA at different concentrations was used. The LSFSJ response in contraction induced by depolarizing tyrode solution with 20 mM KCl was significantly attenuated (MR = 75.9 ± 6.0). The LSFSJ-induced response was also significantly attenuated in the presence of TEA at concentrations of 1 mM (MR = 62.5 ± 9.8%); 3mM (MR = 40.9 ± 3.8%) and 5mM (MR = 10.3 ± 3.7%). To investigate potassium channel subtypes involved in the response, 4- aminopyridine, a selective blocker of KV channels, glibenclamide (10 μM), a selective blocker of KATP channels, BaCl2 (30 μM), a selective blocker of KIR and iberiotoxin channels 100 nM) or TEA (1mM), a selective blocker of BKCa channels were used. In the simultaneous presence of differing potassium channel blockers, we observed significant attenuation of the LSFSJ effect (MR = 23.9 ± 3.4%), this was also observed in the presence of 4-aminopyridine (MR = 33.6 ± 5.9%), and in the presence of BaCl2 or glibenclamide, we also observed an attenuation of the maximum effect respectively (MR = 73.5 ± 6.9%, MR = 72.3 ± 4.3%). However, incubation with iberiotoxin (MR = 94.2 ± 8.1%) did not promote alteration in the response produced by LSFSJ. Through calcium influx we also investigated the involvement of CaV channels in the JSJ-induced response; in which there were no changes in maximal effect. However, its potency was altered. Also, an activator of L-type CaV channels, the S (-) - Bay K 8644, was used; and demonstrated possible participation of these channels in the vasorelaxant effect of JSJ. In conclusion, JSJ causes hypotension and vasorelaxation in rats, and this vaso-relaxing effect mainly involves three subtypes of potassium channels: KV, KATP and KIR without ruling out possible participation of the channels for Ca2+. / Vários estudos epidemiológicos têm sugerido uma associação entre dietas ricas em polifenóis e um menor risco de doenças cardiovasculares. Dentre as frutas ricas em polifenóis encontra-se a Syzygium jambulanum. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos cardiovasculares induzidos pelo liofilizado do suco da fruta Syzygium jambulanum (LSFSJ), utilizando técnicas in vivo e in vitro. O LSFSJ apresentou um alto teor de polifenóis (988,55 ± 5,41 mg de Ác. Gal/100g) e presença de flavonoides e esteroides. Em ratos normotensos, o LSFSJ (5; 10; 30, 50 e 100 mg/kg, i.v.) induziu hipotensão e observou-se uma bradicardia na dose máxima. Em anéis de artéria mesentérica superior de rato, pré-contraídos com fenilefrina (FEN) (1 μM), o LSFSJ (1 - 5000 μg/mL) induziu relaxamento dependente de concentração na presença (Emáx = 105,3 ± 3,54 %; CE50= 1172,7± 116,1 μg/mL) e ausência do endotélio (Emáx = 106,4 ± 4,5 %; CE50 = 1506,5 ± 148,1 μg/mL). Esses dados sugerem que a resposta induzida pelo LSFSJ parece ser independente dos fatores liberados pelo endotélio. Todos os experimentos seguintes foram realizados na ausência do endotélio. A resposta do LSFSJ na contração induzida por solução despolarizante de tyrode com 60 mM de KCl (Emáx = 28,7 ± 2,8 %) foi significativamente menor do que a resposta do LSFSJ na contração induzida por FEN. Para investigar o envolvimento dos canais para potássio foram utilizados solução despolarizante de tyrode com 20 mM de KCl ou TEA em diferentes concentrações. A resposta do LSFSJ na contração induzida por solução despolarizante de tyrode com 20 mM de KCl foi significativamente atenuada (Emáx = 75,9 ± 6,0). A resposta induzida pelo LSFSJ também foi significativamente atenuada na presença de TEA nas concentrações de 1 mM (Emáx= 62,5 ± 9,8 %); 3 mM (Emáx= 40,9 ± 3,8 %) e 5 mM (Emáx= 10,3 ± 3,7 %). Para investigar os subtipos de canais para potássio envolvidos na resposta foram utilizados: 4-aminopiridina, bloqueador seletivo dos canais KV, glibenclamida (10 μM), bloqueador seletivo dos canais KATP, BaCl2 (30 μM), bloqueador seletivo dos canais KIR e iberiotoxina (100 nM) ou TEA (1mM), bloqueador seletivo dos canais BKCa. Na presença dos diferentes bloqueadores dos canais para potássio, simultaneamente, observamos uma atenuação significativa do efeito do LSFSJ (Emáx = 23,9 ± 3,4 %), esse efeito também foi observado na presença de 4- aminopiridina (Emáx = 33,6 ± 5,9 %), na presença de BaCl2 ou glibenclamida também observamos uma atenuação do efeito máximo (Emáx = 73,5 ±6,9 %; Emáx = 72,3 ± 4,3 %) respectivamente. Contudo a incubação de iberiotoxina (Emáx = 94,2 ± 8,1 %) não promoveu alteração da resposta produzida pelo LSFSJ. Também investigamos o envolvimento dos canais CaV na resposta induzida pelo JSJ através do influxo de cálcio no qual não observamos alterações no efeito máximo contudo houve sua potencia foi alterada, além disso um ativador dos canais CaV do tipo-L, o S(-)-Bay K 8644, também foi utilizado o que demonstrou uma possível participação destes canais no efeito vasorrelaxante do JSJ. Em conclusão o JSJ causa hipotensão e vasorrelaxamento em ratos, e esse efeito vasorrelaxante envolve majoritariamente três subtipos de canais para potássio o KV, o KATP e o KIR sem descartar uma possível participação dos canais para Ca2+

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arquivototal.pdf: 1442527 bytes, checksum: 9d12b86569a24dac4080acc552110564 (MD5) Previous issue date: 2012-02-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / It was observed the pharmacological effects of OXDINH, a 1,3,4-oxadiazole derivative obtained by organic synthesis, on the cardiovascular system and the involvement of K+ channels in this response, were studied in rats using techniques combined in vivo and in vitro. In the superior mesenteric artery rings isolated from rats with functional endothelium, OXDINH (10-10 - 10-4 M) induced relaxation of contractions induced by phenylephrine (1 μM) (pD2 = 5.33 ± 0.16, Emax = 117.03 ± 6.49%, n = 7) concentration dependent manner and this effect was not attenuated after removal of the vascular endothelium (pD2 = 5.15 ± 0.09; Emáx = 108.58 ± 6.03%, n = 6). These results suggest that the response induced by vasorelaxant OXDINH seems to be independent of the vascular endothelium. Based on these initial observations, the subsequent experiments were performed with preparations without endothelium. In the preparations incubated with KCl 20mM, a modulator of the efflux of K+, the vasorelaxant effect induced OXDINH was changed (pD2 = 4.67 ± 0.08; Emáx = 57.71 ± 1.72%, n = 5), which is a characteristic of substances that act by activating K+ channels. This effect was corroborated after the use of tetraethylammonium (TEA) 3 mM (Emáx = 44.26 ± 2.41%) that this concentration does not selectively block K+ channels. In addition, the vasodilating effect OXDINH was significantly attenuated after incubation with 4- aminopyridine (1 mM) (Emáx = 61.17 ± 5.55%), glibenclamide (10 μM) (Emáx = 57.00 ± 4.07%), or BaCl2 (30 μM) (Emáx = 61.87 ± 7.52%), selective blockers of KV, KATP and KIR, respectively. By using TEA (1 mM), which at this concentration is more selective for the BKCa, vasodilatation was also found to be significantly attenuated (Emáx = 47.31 ± 5.75%), suggesting the involvement of these channels in this effect. Additionally, when OXDINH (10-5 and 10-4 M) was incubated in depolarizing medium nominally without Ca2+, CaCl2 induced contractions were not changed. However, these contractions were significantly attenuated concentration dependent manner when OXDINH (10-4 M) was incubated in saline without Ca2+ and nominally in the presence of phenylephrine (10μM). In non-anesthetized normotensive rats, OXDINH (1, 5 and 10 mg.kg-1 iv, randomly) produced hypotension accompanied by tachycardia. Interestingly, the highest dose (30 mg.kg-1) of OXDINH, the pressor and tachycardic response was, probably by a direct effect of the compound in the heart. In conclusion, these results suggest that the biological effects induced by OXDINH seem to directly involve the participation of K+ channels, probably by repolarization / hyperpolarization of the membrane and consequent closure of Cav, preventing the influx of Ca2+ through these channels. / Os efeitos farmacológicos de OXDINH, um derivado 1,3,4-oxadiazol obtido por síntese orgânica, sobre o sistema cardiovascular e a participação dos canais para K+ nesta resposta, foram estudados em ratos usando técnicas combinadas in vivo e in vitro. Em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, com endotélio funcional, OXDINH (10-10 10-4 M) induziu relaxamento das contrações induzidas por fenilefrina (1 μM) (pD2 = 5,33 ± 0,16, Emáx= 117,03 ± 6.49 %, n = 7) de maneira dependente de concentração e esse efeito não foi atenuado após remoção do endotélio vascular (pD2=5,15 ± 0,09, Emáx= 108,58 ± 6.03 %, n = 6). Esses resultados sugerem que a resposta vasorelaxante induzida pela OXDINH parece ser independente do endotélio vascular. Baseado nessas observações iniciais, os experimentos subseqüentes foram realizados com preparações sem endotélio vascular. Em preparações incubadas com KCl 20 mM, um modulador do efluxo de K+, o efeito vasorelaxante induzido por OXDINH foi alterado (pD2= 4,67 ± 0,08, Emáx= 57,71 ± 1.72%, n = 5), sendo esta uma característicade substâncias que agem por ativar canais para K+. Este efeito foi corroborado após utilização de tetraetilamônio (TEA) 3 mM (Emáx= 44,26 ± 2.41%), que nesta concentração bloqueia não seletivamente os canais para K+. Além disso, o efeito vasodilatador do OXDINH foi significativamente atenuado após incubação com 4- aminopiridina 1 mM (Emáx= 61,17 ± 5,55%), glibenclamida 10 μM (Emáx= 57,00 ± 4,07%), ou BaCl2 30 μM (Emáx= 61,87 ± 7.52%), bloqueadores seletivos dos KV, KATP e KIR, respectivamente. Ao utilizar TEA 1 mM, que nesta concentração é mais seletivo para os BKCa, a vasodilatação também foi atenuada de modo significante (Emáx= 47,31 ± 5.75%), sugerindo a participação destes canais neste efeito. Adicionalmente, quando OXDINH (10-5 e 10-4M) foi incubado em meio despolarizante nominalmente sem Ca2+, as contrações induzidas por CaCl2 não foram alteradas. Porém, estas contrações foram significativamente atenuadas, de maneira dependente de concentração, quando OXDINH (10-4M) foi incubado em solução fisiológica nominalmente sem Ca2+ e na presença de fenilefrina (10μM). Em ratos normotensos não anestesiados, OXDINH (1; 5 e 10 mg.kg-1 i.v., randomicamente) produziu uma hipotensão acompanhada por taquicardia. Interessantemente, na maior dose administrada (30 mg.kg-1) de OXDINH, a resposta foi pressora e taquicárdica, provavelmente por um efeito direto do composto no coração. Em conclusão, esses resultados sugerem que os efeitos biológicos induzidos por OXDINH parecem envolver diretamente a participação de canais para K+, provavelmente pela repolarização/hiperpolarização da membrana e, consequente fechamento dos Cav, impedindo o influxo de Ca2+ através desses canais.

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2456836 bytes, checksum: 09d3f72dc7985812ae8e5dab865bed8c (MD5) Previous issue date: 2013-02-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Solanum paludosum Moric. (Solanaceae), popularly known as "jurubeba roxa" in Brazil Northeast, is used as a substitute for Solanum paniculatum ( jurubeba-verdadeira ) in folk medicine to treat hypertension and gastrointestinal disorder. In previous studies performed by Monteiro (2009) with total alkaloid fraction obtained from the root bark of this species (FAT-SP) was shown that its presented spasmolytic activity on smooth muscle, being more potent on guinea pig ileum and rat aorta. On guinea pig ileum, the relaxing effect involved antimuscarinic activity, and on rat aorta the NO/GC pathways. As the fraction has constituted by glycoalkaloids and many are known to exhibit cytotoxic activity, this activity was assessed in longitudinal layer myocytes from guinea pig ileum. In this work, we found that FAT-SP has no cytotoxic activity in these cells even the highest concentration tested (750 μg/mL), then we proceeded with the investigation of the relaxant action mechanism of FAT-SP on guinea pig ileum and rat aorta until that concentration. FAT-SP showed a relaxant effect on guinea pig ileum resistant simultaneous blockade of cholinergic and adrenergic pathways with guanethidine and atropine, respectively, suggesting there is involvement of NANC pathway; L-NAME (NOS competitive inhibitor) reduced FAT-SP relaxing potency, which was reversed in the presence of L-arginine, the substrate for NOS, suggesting that NO may be via NANC neurotransmitter. However, no reduction of the relaxing potency in the presence of ODQ, selective inhibitor of GC soluble, suggesting no participation of the GC in the FAT-SP relaxant action mechanism on guinea pig ileum. In the other hand, K+ channels participation (BKCa and SKCa) was evidenced by FAT-SP relaxing potency reduction on CsCl 5 mM presence (K+ channels nonselective blocker), TEA+ 1 mM (BKCa selective blocker) or apamin 100 nM (SKCa selective blocker). On rat aorta, it was observed participation pathway NO/cGMP/PKG, as can be evidenced by FAT-SP relaxing potency reduction in L-NAME 3 x 10-4 or 10-4 M presence and by inhibitory effect reversibility in L-arginine presence, as well as relaxing potency reduction in Rp-8-Br-cGMP 3 x 10-5 M presence, PKG selective inhibitor. Also, it was shown endothelial calmodulin participation because FAT-SP relaxing potency was reduced in presence calmidazolium 10-5 M, endothelial calmodulin selective inhibitor. The channel K+ participation (KV, SKCa and KATP) was evidenced by experiments with TEA+ 10 mM (K+ channels nonselective blocker), 4-AP 1 mM (KV selective blocker), apamin 5 x 10-8 M, glibenclamide 10-5 M (KATP selective blocker). Further, was showed partial inhibition of Ca2+ mobilization induced by IP3 of RS, but not by caffeine (20 mM). Thus, FAT-SP relaxing effect involves NO, BKCa and SKCa participation, on guinea pig ileum and endothelial calmodulin, NO/cGMP/PKG pathway and K+ channels (KV, SKCa and KATP) on rat aorta. / Solanum paludosum Moric. (Solanaceae), conhecida popularmente como jurubeba-roxa no Nordeste do Brasil, é utilizada como sucedânea de Solanum paniculatum ( jurubeba-verdadeira ) na medicina popular para tratamento de hipertensão e desordem gastrintestinal. Estudos anteriores, realizados por Monteiro (2009) com a fração de alcaloides totais obtida da casca da raiz desta espécie (FAT-SP) demonstraram que a mesma apresentou atividade espasmolítica em músculos lisos, sendo mais potente em íleo de cobaia e aorta de rato. Em íleo de cobaia, o efeito relaxante envolve atividade antimuscarínica e, em aorta de rato, a participação da via NO/GC. Como a fração possui na sua composição glicoalcaloides e muitos destes são conhecidos por apresentar atividade citotóxica, avaliou-se esta atividade em miócitos da camada longitudinal do íleo de cobaia. Neste trabalho, observou-se que a FAT-SP não apresenta atividade citotóxica nessas células na concentração máxima testada (750 μg/mL), portanto prosseguiu-se com a investigação do mecanismo de ação relaxante da FAT-SP em íleo de cobaia e aorta de rato até essa concentração. A FAT-SP apresentou um efeito relaxante em íleo de cobaia resistente ao bloqueio simultâneo das vias adrenérgica e colinérgica com guanetidina e atropina, respectivamente, sugerindo-se que há a participação da via NANC; o L-NAME (inibidor competitivo da NOS), reduziu a potência relaxante da FAT-SP, que foi revertida na presença da L-arginina, substrato para a NOS, sugerindo que o neurotransmissor da via NANC pode ser o NO. Porém, não houve redução da potência relaxante na presença de ODQ, inibidor seletivo da GC solúvel, o que sugere a não participação da GC no mecanismo de ação relaxante da FAT-SP em íleo de cobaia. Por outro lado, a participação dos canais de K+ (BKCa e SKCa) foi evidenciada pela redução da potência relaxante da FAT-SP na presença de 5 mM de CsCl (bloqueador não seletivo dos canais de K+), de 1 mM de TEA+ (bloqueador seletivo dos BKCa) ou 100 nM de apamina (bloqueador seletivo dos SKCa). Em aorta de rato, observou-se que há a participação da via NO/GMPc/PKG, como evidenciado pela redução da potência relaxante da FAT-SP na presença de 10-4 ou 3 x 10-4 M de L-NAME, e da reversibilidade do efeito inibidor na presença da L-arginina, bem como, da redução da potência relaxante na presença de 3 x 10-5 M de Rp-8-Br-cGMPS, inibidor seletivo da PKG. Ademais, foi demonstrado que há a participação da calmodulina endotelial, pois houve redução da potência relaxante da FAT-SP na presença de 10-5 M de calmidazolium, inibidor seletivo da calmodulina endotelial; participação dos canais de K+ (KV, SKCa e KATP) evidenciado pelos experimentos com 10 mM de TEA+ (bloqueador não seletivo dos canais de K+), 1 mM de 4-AP (bloqueador seletivo dos KV), 5 x 10-8 M de apamina e 10-5 M de glibenclamida (bloqueador seletivo dos KATP). Observou-se ainda a inibição parcial da mobilização do Ca2+ do RS induzida pelo IP3, mas não por cafeína (20 mM). Assim, o efeito relaxante da FAT-SP envolve a participação do NO e dos BKCa e SKCa em íleo de cobaia, e da calmodulina endotelial, bem como da via NO/GMPc/PKG e canais de K+ (KV, SKCa e KATP) em aorta de rato.

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1843957 bytes, checksum: 23eff6067396c6f267138994bec5be02 (MD5) Previous issue date: 2012-02-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The studed Herbal Product is indicated for treatment of intestinal colic and constipation, though there are no scientific data, that prove its efficacy. Thus, this study aimed in preclinical pharmacologic trials to evaluate its laxative and spasmolytic action and elucidate its possible pathway. For this, pharmacological tests were carried out in vivo to evaluate its stimulating effect on the gastrointestinal tract and in vitro assays in order to evaluate its spasmodic activity. The Herbal Product increased small intestinal motility in male mice at doses of 100mg/kg (161.66 ± 14.86%, n=6) and 200mg/kg (151.04 ± 17.17%, n=6) compared to control (100.00 ± 10.49%, n=6). The intestinal transit of animals constipated by loperamide (3mg/kg/day, three days) was reduced to 66.25 ± 7.49% (n=8) compared to the control group (100 ± 5.16%, n=8). In the constipated animals treated with doses of 100 and 200mg/kg (98.42 ± 6.33%, n=7) (99.32 ± 8.47%, n=7) was observed the normalization of the traffic bowel. Similar results were observed for 24 hours in the quantification of rat feces constipated by loperamide (3mg/kg/day, three days). The herbal medicine induced return of quantity of feces normal levels (7.92 ± 1.01g, n=6) in constipated animals (4.01 ± 1.43g, n=6), at dose of 100mg/kg (11.24 ± 2.90g, n=6) and 200mg/kg (8.70 ± 2.01g, n=6). These results demonstrate the stimulating action of this preparation in the intestine of the animals with potential laxative effect. Adding increasing and cumulative (0.01-1000μg/mL) of this product did not significantly alter spontaneous contractions in guinea pig ileum. However, its addition (1-1000μg/mL) caused a relaxation in this organ pre-contracted with 1μM carbachol, Emax= 67.61 ± 6.25%; EC50 269.77μg/mL (215.8 to 337.1), n=6; histamine 1μM (Emax= 58.68 ± 7.17%, EC50= 144.10μg/mL (86.65 to 239.70), n=6, and 40mM KCl (Emax= 50.76 ± 3.79%; EC50= 91.94μg/mL (57.97 to 145.80), n=7, no significant difference in the powers, suggesting an action of this product on a step common to these three agents. The relaxing action of this preparation was attenuated in ileum pre-contracted with 60mM KCl (Emax= 39.28 ± 1.95%, n=7) and the efficacy and potency were also significantly attenuated in the presence of potassium channel blockers, 5mM TEA, Emax= 22.79  2.99%; EC50 93.41μg/mL (54.89 to 159.00), n=5; and 5mM CsCl; Emax= 29.44  6.24%, EC50= 112,60μg/mL (44.09 to 287.80), n=5, suggesting the participation of these channels in relaxation. In contractions induced by 300nM S(-)BayK-8644, Cav channel agonist, the effect induced by phytomedicine, Emax= 39.28 ± 1.95%, EC50= 199.70μg/mL (120.50 to 239.00), n=8, was significantly lower when compared to carbachol, indicating the involvement of Cav in its effect. In preparations pre-incubated with 1μM propranolol (Emax= 34.45 ± 4.97%, n=6), the Emax was attenuated, suggesting also the involvement of β-adrenergic receptors in the effect induced by preparation. Thus, we conclude that the Herbal Product acts stimulating the intestine of rats and mice, especially in constipated animals and has spasmolytic activity in guinea pig ileum probably due to opening of K+ channels, inhibition of Ca2+ channels and activation of β-adrenoceptor. / O Produto Fitoterápico estudado é indicado no tratamento de cólicas intestinais e constipação, entretanto não apresenta dados científicos que comprovem sua eficácia. Assim, este estudo objetivou realizar ensaios farmacológicos pré-clínicos para avaliar sua ação laxante e sua ação espasmolítica, bem como elucidar seu provável mecanismo de ação. Para tal, realizaram-se ensaios farmacológicos in vivo para avaliar seu efeito estimulante sobre o trato gastrointestinal e ensaios in vitro com o intuito de avaliar sua atividade espasmolítica. O Produto Fitoterápico aumentou a motilidade do intestino delgado em camundongos machos, nas doses de 100mg/kg (161,66 ± 14,86%; n=6) e 200mg/kg (151,04 ± 17,17%, n=6) quando comparados ao controle (100,00 ± 10,49%; n=6). O trânsito intestinal de animais constipados por loperamida (3mg/kg/dia, três dias) foi reduzido a 66,25 ± 7,49% (n=8) em comparação ao grupo controle (100 ± 5,16%; n=8). Nos animais constipados e tratados com doses de 100 e 200mg/kg (98,42 ± 6,33%, n=7); (99,32 ± 8,47%; n=7), observou-se a normalização do trânsito intestinal. Resultados semelhantes foram encontrados na quantificação por 24 horas de fezes de ratos constipados por loperamida (3mg/kg/dia, três dias), em que o Produto Fitoterápico induziu o retorno da quantidade de fezes a níveis normais (7,92 ± 1,01g; n=6) de animais constipados (4,01 ± 1,43g; n=6), tanto na dose de 100mg/kg (11,24 ± 2,90g; n=6) como na dose de 200mg/kg (8,70 ± 2,01g; n=6). Estes resultados demonstram a ação estimulante da preparação estudada no intestino destes animais com potencial efeito laxante. A adição crescente e cumulativa (0,01-1000μg/mL) deste produto não alterou significativamente as contrações espontâneas em íleo de cobaia. Entretanto, sua adição (1-1000μg/mL) promoveu relaxamento neste órgão pré-contraído com carbacol 1μM, Emax= 67,61 ± 6,25%; CE50 269,77μg/mL (215,8 337,1); n=6, com histamina 1μM, Emax= 58,68 ± 7,17%; CE50= 144,10 μg/mL (86,65 239,70); n=6, ou com KCl 40mM, Emax= 50,76 ± 3,79%; CE50= 91,94μg/mL (57,97 145,80); n=7, não apresentando diferença estatística nas potências, o que sugere uma ação sobre uma etapa comum a estes três agentes. A ação relaxante desta preparação foi atenuada em íleo pré-contraído com KCl 60mM (Emax= 39,28 ± 1,95%; n=7) e sua eficácia e potência também foram significantemente atenuados na presença de bloqueadores de canais para K+, 5mM TEA, Emax= 22,79  2,99%; CE50 93,41μg/mL (54,89 159,00); n=5, e 5mM CsCl, Emax= 29,44  6,24%; CE50= 112,60μg/mL (44,09 287,80); n=5, sugerindo participação destes canais em seu relaxamento. Em contrações induzidas por 300nM S(-)-BayK 8644, agonista de canais Cav, o efeito induzido pelo Produto Fitoterápico Emax= 39,28 ± 1,95%; CE50= 199,70μg/mL (120,50 239,00); n=8, foi significativamente menor, quando comparado ao carbacol, indicando a participação dos Cav em seu efeito. Em preparações pré-incubadas com 1μM propranolol (Emax= 34,45 ± 4,97%; n=6), o Emax foi atenuado, sugerindo também a participação de receptores β-adrenérgicos no efeito induzido pela preparação. Assim, concluimos que o Produto Fitoterápico age estimulando o intestino de ratos e camundongos, principalmente em animais constipados e apresenta atividade espasmolítica em íleo de cobaia provavelmente pela abertura de canais para K+, inibição de canais para Ca2+ e ativação de β-adrenoceptores.

Submitted by Maike Costa (maiksebas@gmail.com) on 2017-09-12T13:51:31Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2565770 bytes, checksum: 9a17a1e982b430cc6e63bdb785f2ce92 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-12T13:51:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2565770 bytes, checksum: 9a17a1e982b430cc6e63bdb785f2ce92 (MD5) Previous issue date: 2015-03-31 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Lippia microphylla Cham. (Verbenaceae), known as “alecrim-do-mato”, “alecrim-de-tabuleiro” and “alecrim-pimenta”, is populary used as antiseptic or to treat respiratory disorders. From its leaves, the essential oil (LM-OE) was extracted, that, according to Silva (2013), presented tocolytic effect on rat, with a probably indirect inhibition of Ca2+ influx through voltage-gated calcium channels (CaV). Thus, the aim of this work was to characterize the tocolytic action mechanism of LM-OE on rat. Isometric contractions were recorded to determine and compare the relative efficacy and potency (n = 5). Considering that the NO pathway can negatively modulate the CaV, we decided to evaluate this participation on rat uterus pre-contracted by oxytocin. For that, it was employed L-NAME, a non-selective inhibitor of NO synthase (NOS). The results show that the tocolytic potency of LM-OE (EC50 = 2.7 ± 0.6 μg/mL) was approximately 9.5-fold attenuated in the presence of L-NAME (EC50 = 25.6 ± 3.9 μg/mL). Furthermore, this reduction was reversed in the presence of the L-arginine (EC50 = 6.2 ± 1.7 μg/mL), a NOS substrate, and simultaneous presence of the L-arginine and L-NAME (EC50 = 7.2 ± 1.4 μg/mL), confirming the participation of NO pathway in the tocolytic action of LM-OE. Similarly, the relaxant potency of LM-OE was approximately 3.7-fold reduced in the presence of ODQ (EC50 = 10.1 ± 0.9 μg/mL), a soluble guanylate cyclase (sGC) inhibitor, and 3.3-fold in the presence of Rp-8-Br-PET-cGMPS (EC50 = 8.9 ± 0.9 μg/mL), a protein kinase G (PKG) inhibitor. Thus, LM-OE positively modulates the NO/sGC/PKG pathway to promote its tocolytic effect on rat. Given that this pathway can activate the K+ channels, it was questioned if these channels would be involved on tocolytic effect of LM-OE. To confirm this hypothesis, experiments were made in the presence of CsCl, a non-selective K+ channels blocker, and it was observed that the concentration-response curve of LM-OE (EC50 = 2.7 ± 0.6 μg/mL) was rightward shifted with an approximately 4.3-fold reduction on its relaxant potency, confirming the participation of K+ channels on tocolytic effect of essential oil. In order to verify the subtypes involved, it was employed selective blockers of K+ channels. Control concentration-response curve was also shifted to the right and the tocolytic potency of LM-OE was attenuated in the presence of tetraethylammonium (EC50 = 10.5 ± 0.3 μg/mL), apamin (EC50 = 10.0 ± 1.0 μg/mL), 4-aminopyridine (EC50 = 12.4 ± 2.0 μg/mL) and glibenclamide (EC50 = 9.7 ± 0.9 μg/mL), the large (BKCa) and small conductance (SKCa) calcium-activated, voltage-gated (KV) and adenosine triphosphate-sensitive (KATP) potassium channels blockers, respectively. Moreover, LM-OE had its tocolytic potency reduced in the same intensity when these four blockers were simultaneously incubated (EC50 = 16.6 ± 2.6 μg/mL), not observing synergistic effect. Therefore, the tocolytic action mechanism of LM-OE on rat involves the positive modulation of the NO/sGC/PKG/K+ channels pathway, suggesting the blockade of calcium influx through CaV, leading to the relaxation of uterine smooth muscle. / Lippia microphylla Cham. (Verbenaceae), conhecida como “alecrim-do-mato”, “alecrim-de-tabuleiro” e “alecrim-pimenta”, é usada popularmente como antisséptico ou para tratar distúrbios respiratórios. Das folhas dessa espécie foi extraído o óleo essencial (LM-OE) que, de acordo com Silva (2013), apresentou efeito tocolítico em útero isolado de rata, indicando uma provável inibição indireta do influxo de Ca2+ através dos canais de cálcio dependentes de voltagem (CaV). Diante disso, o objetivo deste trabalho foi caracterizar o mecanismo de ação tocolítica do LM-OE em rata. As contrações isométricas foram monitoradas para determinar e comparar a eficácia e a potência relativas (n = 5). Tendo em vista que os CaV podem ser modulados negativamente pela via do óxido nítrico (NO), decidiu-se avaliar a participação dessa via em útero de rata pré-contraído com ocitocina. Para tanto, utilizou-se L-NAME, um inibidor não seletivo de sintase do NO (NOS). Os resultados evidenciaram que a potência tocolítica do LM-OE (CE50 = 2,7 ± 0,6 μg/mL) foi reduzida em aproximadamente 9,5 vezes, na presença de L-NAME (CE50 = 25,6 ± 3,9 μg/mL), sendo essa redução revertida na presença de L-arginina (CE50 = 6,2 ± 1,7 μg/mL), substrato para a NOS, e na presença simultânea de L-arginina e de L-NAME (CE50 = 7,2 ± 1,4 μg/mL), confirmando o envolvimento da via do NO na ação tocolítica do LM-OE. Semelhantemente, a potência relaxante do LM-OE foi reduzida em aproximadamente 3,7 vezes na presença de ODQ (CE50 = 10,1 ± 0,9 μg/mL), inibidor de ciclase de guanilil solúvel (sGC), e 3,3 vezes na presença de Rp-8-Br-PET-cGMPS (CE50 = 8,9 ± 0,9 μg/mL), inibidor de proteína cinase G (PKG). Sendo assim, o LM-OE modula positivamente a via do NO/sCG/PKG para promover seu efeito tocolítico em rata. Uma vez que essa via pode ativar canais de K+, questionou-se se esses canais estariam participando do efeito tocolítico do LM-OE. Para confirmar essa hipótese, foram realizados experimentos na presença de CsCl, bloqueador não seletivo de canais de K+, e observou-se que a curva concentração-resposta do LM-OE (CE50 = 2,7 ± 0,6 μg/mL) foi desviada para a direita com redução da potência relaxante (CE50 = 11,7 ± 1,5 μg/mL) em aproximadamente 4,3 vezes, confirmando a participação dos canais de K+ no efeito tocolítico do óleo essencial. Para verificar quais seriam esses subtipos de canais utilizou-se bloqueadores seletivos. A curva controle concentração-resposta também foi desviada para a direita e a potência tocolítica reduzida na presença de tetraetilamônio (CE50 = 10,5 ± 0,3 μg/mL), de apamina (CE50 = 10,0 ± 1,0 μg/mL), de 4-aminopiridina (CE50 = 12,4 ± 2,0 μg/mL) e de glibenclamida (CE50 = 9,7 ± 0,9 μg/mL), bloqueadores de canais de potássio: ativados por cálcio de grande (BKCa) e de pequena condutância (SKCa), dependentes de voltagem (KV) e sensíveis ao trifosfato de adenosina (KATP), respectivamente. Ademais, o LM-OE teve sua potência tocolítica reduzida quando esses quatro bloqueadores foram pré-incubados simultaneamente (CE50 = 16,6 ± 2,6 μg/mL), não sendo observado efeito sinérgico. Assim, o mecanismo de ação tocolítica do LM-OE em rata envolve a modulação positiva da via NO/sGC/PKG/canais de K+, sugerindo o bloqueio do influxo de cálcio via CaV e, consequentemente, o relaxamento do músculo liso uterino.

A acidez do solo é um dos principais fatores limitantes à produção vegetal. Apesar da toxicidade por alumínio ter sido extensamente investigada, pouca atenção tem sido dada ao estresse causado pelo baixo pH em si. Existem diferenças marcantes entre células quanto à sensibilidade ao pH baixo que dependem do seu estado de crescimento e desenvolvimento celular e que devem ser exploradas para se entender o que determina a sensibilidade e tolerância a pH baixo. Em alguns casos, a suscetibilidade a pH baixo está relacionada a desarranjos na parede de células em crescimento, chegando a causar o rompimento da célula, como já foi demonstrado em pêlos radiculares em expansão. Por outro lado, o metabolismo oxidativo e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) na parede podem influenciar neste processo por romper ou criar ligações dentro ou entre cadeias de polissacarídeos, modulando assim a extensibilidade da parede celular. Em células de tabaco (Nicotiana tabacum) cv. BY-2, há um aumento acentuado na sensibilidade ao pH baixo no final da fase lag da cultura, que ocorrre entre 12 e 24 h de cultivo. Os objetivos deste trabalho foram: a) Investigar se a mudança na sensibilidade pH baixo ocorre durante a retomada do ciclo celular e determinar, com o uso de inibidores do ciclo celular, o período do ciclo em que isto ocorre; b) verificar se o aumento da sensibilidade a pH baixo está relacionado com a expansão celular ou com alterações no potencial osmótico da célula; c) examinar o efeito da aplicação de H2O2 ou ascorbato sobre a resposta de células sensíveis a pH baixo; d) testar a hipótese de que a sensibilidade a pH baixo pode ser revertida por meio de um choque hipo-osmótico prévio; e) avaliar o possível papel da modulação oxidativa da parede celular na reversão de sensibilidade das células a pH baixo expostas ao choque hipo-osmótico. A retomada do ciclo celular é necessária para que ocorra a alteração de sensibilidade a pH baixo, pois a remoção de auxina (2,4-D) ou a adição de bloqueadores de canais de K+ impediu ou atrasou, respectivamente, a alteração na sensibilidade a pH baixo. O uso de inibidores do ciclo celular demonstrou que as células de BY-2 se tornam mais sensíveis a pH baixo durante o final da fase G1 mas antes do ponto de checagem da transição G1/S do ciclo celular. A aplicação de H2O2, diminuiu a suscetibilidade das células a pH baixo, ao contrário da aplicação de ascorbato. Foi demonstrado que a aplicação prévia de tratamento hipo-osmótico por 60 min reverteu a sensibilidade de células a pH baixo. A aplicação de inibidores de NAPDH oxidase da membrana plasmática e de peroxidases revelou a participação destas enzimas na reversão de sensibilidade das células a pH baixo, indicando a possibilidade de geração de ROS e de modulação oxidativa da parede. Embora já tenha sido descrito que ocorre uma explosão oxidativa com choque hipo-osmótico, ainda não havia sido demonstrado a conseqüência disto. Este trabalho fornece indícios de que uma explosão oxidativa poderia modificar a parede tornando-a mais resistente e a célula menos suscetível a pH baixo / Soil acidity is a major factor limiting plant growth worldwide. Although aluminum toxicity, which occurs only at low pH, has been extensively studied, little attention has been given to stress caused by low pH. There are marked differences in the sensitivity of cells to low pH which are contingent on the growth and developmental stage of the cells. These differences should be explored to further the understanding of the factors governing sensitivity and tolerance to low pH. In at least some cases, the susceptibility of cells to low pH is related to derangements in the wall of growing cells, which can cause ruptures or bursting of the cells, as has been clearly demonstrated in expanding root hairs. On the other hand, the oxidative metabolism and generation of reactive oxygen species (ROS) can modulate cell wall extensibility by breaking or making bonds within and between cell wall polymers. In tobacco (Nicotiana tabacum) cv. BY-2 cells, there is a sharp increase in sensitivity to low pH at the end of the lag phase of the cell culture, which occurs between 12 and 24 h of subculture. The objectives of this study were: a) determine if the changes in sensitivity to low pH occurred during the restart of the cell cycle and, by employing cell cycle inhibitors, at which points of the cycle does this occur; b) examine if the changes in sensitivity to low pH are related to cell expansion or changes in osmotic potential of the cell; c) examine how the application of H2O2 or ascorbate affects the response of cells to low pH; d) test the hypothesis that sensitivity of cells to low pH can be reverted by the previous application of a hypo-osmotic shock; e) evaluate the possible role of oxidative modulation of the cell wall in hypo-osmotic-induced reversal of the sensitivity of cells to low pH. The restart of the cell cycle was shown to be necessary for the change in sensitivity to low pH occur, since the absence of auxin (2,4-D) or the addition of K+ channel blockers prevented or delayed this change, respectively. The use of cell cycle inhibitors demonstrated that BY-2 cells become sensitive to low pH at the end of G1 but before the G1/S transition restriction point of the cell cycle. Exogenous H2O2, but not ascorbate, reduced the effect of low pH on sensitive cells. Sensitive cells submitted to 60 min hypo-osmotic treatment became insensitive to low pH. This reversal of sensitivity depended on the activity of plasma membrane NADPH oxidase and peroxidase, as evidenced by the use of DPI and SHAM, inhibitors of these enzymes, respectively. This suggests that ROS is generated and that oxidative modifications of the cell wall occur. Although hypo-osmotic treatments have been shown to generate an oxidative burst, its purpose or implication has not yet been shown. This study provides evidence that an oxidative burst might modify and strengthen the cell wall, making cells less susceptible to low pH

A acidez do solo é um dos principais fatores limitantes à produção vegetal. Apesar da toxicidade por alumínio ter sido extensamente investigada, pouca atenção tem sido dada ao estresse causado pelo baixo pH em si. Existem diferenças marcantes entre células quanto à sensibilidade ao pH baixo que dependem do seu estado de crescimento e desenvolvimento celular e que devem ser exploradas para se entender o que determina a sensibilidade e tolerância a pH baixo. Em alguns casos, a suscetibilidade a pH baixo está relacionada a desarranjos na parede de células em crescimento, chegando a causar o rompimento da célula, como já foi demonstrado em pêlos radiculares em expansão. Por outro lado, o metabolismo oxidativo e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) na parede podem influenciar neste processo por romper ou criar ligações dentro ou entre cadeias de polissacarídeos, modulando assim a extensibilidade da parede celular. Em células de tabaco (Nicotiana tabacum) cv. BY-2, há um aumento acentuado na sensibilidade ao pH baixo no final da fase lag da cultura, que ocorrre entre 12 e 24 h de cultivo. Os objetivos deste trabalho foram: a) Investigar se a mudança na sensibilidade pH baixo ocorre durante a retomada do ciclo celular e determinar, com o uso de inibidores do ciclo celular, o período do ciclo em que isto ocorre; b) verificar se o aumento da sensibilidade a pH baixo está relacionado com a expansão celular ou com alterações no potencial osmótico da célula; c) examinar o efeito da aplicação de H2O2 ou ascorbato sobre a resposta de células sensíveis a pH baixo; d) testar a hipótese de que a sensibilidade a pH baixo pode ser revertida por meio de um choque hipo-osmótico prévio; e) avaliar o possível papel da modulação oxidativa da parede celular na reversão de sensibilidade das células a pH baixo expostas ao choque hipo-osmótico. A retomada do ciclo celular é necessária para que ocorra a alteração de sensibilidade a pH baixo, pois a remoção de auxina (2,4-D) ou a adição de bloqueadores de canais de K+ impediu ou atrasou, respectivamente, a alteração na sensibilidade a pH baixo. O uso de inibidores do ciclo celular demonstrou que as células de BY-2 se tornam mais sensíveis a pH baixo durante o final da fase G1 mas antes do ponto de checagem da transição G1/S do ciclo celular. A aplicação de H2O2, diminuiu a suscetibilidade das células a pH baixo, ao contrário da aplicação de ascorbato. Foi demonstrado que a aplicação prévia de tratamento hipo-osmótico por 60 min reverteu a sensibilidade de células a pH baixo. A aplicação de inibidores de NAPDH oxidase da membrana plasmática e de peroxidases revelou a participação destas enzimas na reversão de sensibilidade das células a pH baixo, indicando a possibilidade de geração de ROS e de modulação oxidativa da parede. Embora já tenha sido descrito que ocorre uma explosão oxidativa com choque hipo-osmótico, ainda não havia sido demonstrado a conseqüência disto. Este trabalho fornece indícios de que uma explosão oxidativa poderia modificar a parede tornando-a mais resistente e a célula menos suscetível a pH baixo / Soil acidity is a major factor limiting plant growth worldwide. Although aluminum toxicity, which occurs only at low pH, has been extensively studied, little attention has been given to stress caused by low pH. There are marked differences in the sensitivity of cells to low pH which are contingent on the growth and developmental stage of the cells. These differences should be explored to further the understanding of the factors governing sensitivity and tolerance to low pH. In at least some cases, the susceptibility of cells to low pH is related to derangements in the wall of growing cells, which can cause ruptures or bursting of the cells, as has been clearly demonstrated in expanding root hairs. On the other hand, the oxidative metabolism and generation of reactive oxygen species (ROS) can modulate cell wall extensibility by breaking or making bonds within and between cell wall polymers. In tobacco (Nicotiana tabacum) cv. BY-2 cells, there is a sharp increase in sensitivity to low pH at the end of the lag phase of the cell culture, which occurs between 12 and 24 h of subculture. The objectives of this study were: a) determine if the changes in sensitivity to low pH occurred during the restart of the cell cycle and, by employing cell cycle inhibitors, at which points of the cycle does this occur; b) examine if the changes in sensitivity to low pH are related to cell expansion or changes in osmotic potential of the cell; c) examine how the application of H2O2 or ascorbate affects the response of cells to low pH; d) test the hypothesis that sensitivity of cells to low pH can be reverted by the previous application of a hypo-osmotic shock; e) evaluate the possible role of oxidative modulation of the cell wall in hypo-osmotic-induced reversal of the sensitivity of cells to low pH. The restart of the cell cycle was shown to be necessary for the change in sensitivity to low pH occur, since the absence of auxin (2,4-D) or the addition of K+ channel blockers prevented or delayed this change, respectively. The use of cell cycle inhibitors demonstrated that BY-2 cells become sensitive to low pH at the end of G1 but before the G1/S transition restriction point of the cell cycle. Exogenous H2O2, but not ascorbate, reduced the effect of low pH on sensitive cells. Sensitive cells submitted to 60 min hypo-osmotic treatment became insensitive to low pH. This reversal of sensitivity depended on the activity of plasma membrane NADPH oxidase and peroxidase, as evidenced by the use of DPI and SHAM, inhibitors of these enzymes, respectively. This suggests that ROS is generated and that oxidative modifications of the cell wall occur. Although hypo-osmotic treatments have been shown to generate an oxidative burst, its purpose or implication has not yet been shown. This study provides evidence that an oxidative burst might modify and strengthen the cell wall, making cells less susceptible to low pH