O fungo Magnaporthe oryzae, agente causal da brusone em trigo e em várias outras gramíneas, desde o seu primeiro relato no Brasil tem sido alvo de inúmeras pesquisas. O entendimento da morfologia, fisiologia e parâmetros bioquímicos deste ascomiceto é o primeiro passo para a adoção de medidas eficientes de controle da doença. Os objetivos deste trabalho foram avaliar os aspectos morfológicos, fisiológicos e bioquímicos relativos à patogenicidade do fungo M. oryzae em trigo, além de determinar in vitro as condições ótimas de temperatura e fotoperíodo para o crescimento e esporulação dos isolados testados, quantificar a pressão de turgor exercida pelo apressório no momento da penetração do substrato, verificar a presença de enzimas extracelulares produzidas pelo patógeno e o papel de cada uma delas na degradação da parede celular e, também, demonstrar a possível produção e ação de metabólitos tóxicos do fungo em plântulas de trigo. Dois isolados do fungo, Py5003 e Py6017, foram repicados para os meios de cultivo cenoura, milho-cenoura, batata-dextrose-ágar (BDA), aveia e V8, incubados, de maneira independente, sob luz contínua, escuro contínuo e fotoperíodo de 12h, por 20 dias, sendo avaliados periodicamente quanto ao crescimento micelial total e esporulação do patógeno. Em seguida, conídios germinados e com apressórios formados foram submetidos a diferentes concentrações de PEG-8000 para a mensuração da pressão de turgor apressorial. Além disso, o teor de proteínas totais foi mensurado e a atividade celulolítica determinada, por espectrofotometria indireta para os isolados cultivados em meio Merlin-Norkrans Modificado (MNM), a partir das enzimas exo e endo-?-1,4-glucanase e ?-glicosidase. A produção de metabólitos tóxicos foi determinada por condutivimetria, após o cultivo dos isolados por 5 e 10 dias em batata-dextrose (BD) e obtenção dos filtrados após esse período, sendo que, a ação destes, foi observada em plântulas de trigo com 25 dias de idade. Os resultados evidenciaram melhor crescimento micelial e esporulação dos isolados em meio de cultivo composto de aveia, incubado a 25 °C e fotoperíodo de 12 h. A pressão de turgor apressorial, tanto para Py5003 quanto para Py6017, concentrouse na faixa dos 7,5 MPa. Não houve diferença estatística entre os teores de proteínas totais apresentados pelo isolados. Os dois isolados exibiram alta atividade celulolítica, com diminuição da atividade observada para endo-?-1,4-glucanase e ?- glicosidase na presença de glicose e celobiose, respectivamente. A exposição de plântulas de trigo aos filtrados dos isolados do fungo M. oryzae provocou alta liberação de eletrólitos, sendo, em termos absolutos, Py5003 maior do que Py6017. Plântulas expostas ao filtrado, autoclavado ou não, e ao extrato bruto obtido a partir da separação dos metabólitos tóxicos em acetato de etila, apresentaram-se cloróticas e/ou necróticas. Os resultados sugerem um mecanismo de parasitismo desenvolvido por M. oryzae no desenvolvimento da brusone em trigo, indo desde a fase de pré-penetração, passando pelo estabelecimento das relações parasitárias estáveis e o aparecimento de sintomas e sinais na planta hospedeira. / The fungus Magnaporthe oryzae, causal agent of blast in wheat and several other grasses, since its first occurrence in Brazil has been the subject of extensive research. The understanding of the morphology, physiology and biochemical parameters of this ascomycete is the first step for the adoption of efficient measures to control the disease. The objectives of this study were to evaluate the morphological, physiological and biochemical aspects related to the pathogenicity of the fungus M. oryzae on wheat. Thus, it were determined in vitro the optimal conditions of temperature and photoperiod for growth and sporulation of the isolates tested, quantified the pressure exerted by appressorium at the time of substrate penetration, verified the presence of extracellular enzymes produced by the pathogen and their role in the degradation of cell wall and also demonstrated the possible production and action of toxic metabolites of the fungus in wheat seedlings. Two isolates of the fungus, Py5003 and Py6017, were grown on carrot, maize-carrot, PDA, oat and V8 media and measure periodically for 20 days and after that period, being evaluated the total mycelia growth and sporulation of the pathogen. Then, germinated conidia and appressoria were subjected to different concentrations of PEG-8000 for the measurement of appressorial turgor pressure. In addition, the concentration of total proteins was measured and enzyme activity (exo and endo-?- 1,4-glucanase, ?-glucosidase) was determined by indirect spectrophotometry, for the isolates grown in Modified Melin-Nokrans (MMN) medium. The production of toxic metabolites was determined after growing the isolates for 5 and 10 days in potatodextrose medium (PD) and obtaining the filtrate. The toxic action was evaluated in wheat seedlings (25 days old) by measuring electrolyte leakage. The results showed better mycelial growth and sporulation of the isolates in oat medium incubated at 25 °C and under a photoperiod of 12 h. Appressorial turgor pressure for both isolates were at the range of 7.5 MPa.There were no statistical differences between the levels of total protein presented by the isolates. The two isolates showed high cellulolytic activity, with decreased activity observed for endo-?-1,4-glucanase and ?- glucosidase in the presence of glucose and celobiose, respectively. The exposure of wheat seedlings to the filtrates of the fungus M. oryzae caused high electrolyte release, being, in absolute terms, Py5003 greater than Py6017. Seedlings exposed to the filtrate, autoclaved or not, and the crude extract obtained from the separation of the toxic metabolites in ethyl acetate, exibited clorotic and/or necrotic. These results suggest a mechanism of parasitism developed by M. oryzae on wheat, ranging from pre-penetration through the establishment of stable parasitic relationships and the appearance of symptoms and signals in the host plant.

O fungo Magnaporthe oryzae, agente causal da brusone em trigo e em várias outras gramíneas, desde o seu primeiro relato no Brasil tem sido alvo de inúmeras pesquisas. O entendimento da morfologia, fisiologia e parâmetros bioquímicos deste ascomiceto é o primeiro passo para a adoção de medidas eficientes de controle da doença. Os objetivos deste trabalho foram avaliar os aspectos morfológicos, fisiológicos e bioquímicos relativos à patogenicidade do fungo M. oryzae em trigo, além de determinar in vitro as condições ótimas de temperatura e fotoperíodo para o crescimento e esporulação dos isolados testados, quantificar a pressão de turgor exercida pelo apressório no momento da penetração do substrato, verificar a presença de enzimas extracelulares produzidas pelo patógeno e o papel de cada uma delas na degradação da parede celular e, também, demonstrar a possível produção e ação de metabólitos tóxicos do fungo em plântulas de trigo. Dois isolados do fungo, Py5003 e Py6017, foram repicados para os meios de cultivo cenoura, milho-cenoura, batata-dextrose-ágar (BDA), aveia e V8, incubados, de maneira independente, sob luz contínua, escuro contínuo e fotoperíodo de 12h, por 20 dias, sendo avaliados periodicamente quanto ao crescimento micelial total e esporulação do patógeno. Em seguida, conídios germinados e com apressórios formados foram submetidos a diferentes concentrações de PEG-8000 para a mensuração da pressão de turgor apressorial. Além disso, o teor de proteínas totais foi mensurado e a atividade celulolítica determinada, por espectrofotometria indireta para os isolados cultivados em meio Merlin-Norkrans Modificado (MNM), a partir das enzimas exo e endo-?-1,4-glucanase e ?-glicosidase. A produção de metabólitos tóxicos foi determinada por condutivimetria, após o cultivo dos isolados por 5 e 10 dias em batata-dextrose (BD) e obtenção dos filtrados após esse período, sendo que, a ação destes, foi observada em plântulas de trigo com 25 dias de idade. Os resultados evidenciaram melhor crescimento micelial e esporulação dos isolados em meio de cultivo composto de aveia, incubado a 25 °C e fotoperíodo de 12 h. A pressão de turgor apressorial, tanto para Py5003 quanto para Py6017, concentrouse na faixa dos 7,5 MPa. Não houve diferença estatística entre os teores de proteínas totais apresentados pelo isolados. Os dois isolados exibiram alta atividade celulolítica, com diminuição da atividade observada para endo-?-1,4-glucanase e ?- glicosidase na presença de glicose e celobiose, respectivamente. A exposição de plântulas de trigo aos filtrados dos isolados do fungo M. oryzae provocou alta liberação de eletrólitos, sendo, em termos absolutos, Py5003 maior do que Py6017. Plântulas expostas ao filtrado, autoclavado ou não, e ao extrato bruto obtido a partir da separação dos metabólitos tóxicos em acetato de etila, apresentaram-se cloróticas e/ou necróticas. Os resultados sugerem um mecanismo de parasitismo desenvolvido por M. oryzae no desenvolvimento da brusone em trigo, indo desde a fase de pré-penetração, passando pelo estabelecimento das relações parasitárias estáveis e o aparecimento de sintomas e sinais na planta hospedeira. / The fungus Magnaporthe oryzae, causal agent of blast in wheat and several other grasses, since its first occurrence in Brazil has been the subject of extensive research. The understanding of the morphology, physiology and biochemical parameters of this ascomycete is the first step for the adoption of efficient measures to control the disease. The objectives of this study were to evaluate the morphological, physiological and biochemical aspects related to the pathogenicity of the fungus M. oryzae on wheat. Thus, it were determined in vitro the optimal conditions of temperature and photoperiod for growth and sporulation of the isolates tested, quantified the pressure exerted by appressorium at the time of substrate penetration, verified the presence of extracellular enzymes produced by the pathogen and their role in the degradation of cell wall and also demonstrated the possible production and action of toxic metabolites of the fungus in wheat seedlings. Two isolates of the fungus, Py5003 and Py6017, were grown on carrot, maize-carrot, PDA, oat and V8 media and measure periodically for 20 days and after that period, being evaluated the total mycelia growth and sporulation of the pathogen. Then, germinated conidia and appressoria were subjected to different concentrations of PEG-8000 for the measurement of appressorial turgor pressure. In addition, the concentration of total proteins was measured and enzyme activity (exo and endo-?- 1,4-glucanase, ?-glucosidase) was determined by indirect spectrophotometry, for the isolates grown in Modified Melin-Nokrans (MMN) medium. The production of toxic metabolites was determined after growing the isolates for 5 and 10 days in potatodextrose medium (PD) and obtaining the filtrate. The toxic action was evaluated in wheat seedlings (25 days old) by measuring electrolyte leakage. The results showed better mycelial growth and sporulation of the isolates in oat medium incubated at 25 °C and under a photoperiod of 12 h. Appressorial turgor pressure for both isolates were at the range of 7.5 MPa.There were no statistical differences between the levels of total protein presented by the isolates. The two isolates showed high cellulolytic activity, with decreased activity observed for endo-?-1,4-glucanase and ?- glucosidase in the presence of glucose and celobiose, respectively. The exposure of wheat seedlings to the filtrates of the fungus M. oryzae caused high electrolyte release, being, in absolute terms, Py5003 greater than Py6017. Seedlings exposed to the filtrate, autoclaved or not, and the crude extract obtained from the separation of the toxic metabolites in ethyl acetate, exibited clorotic and/or necrotic. These results suggest a mechanism of parasitism developed by M. oryzae on wheat, ranging from pre-penetration through the establishment of stable parasitic relationships and the appearance of symptoms and signals in the host plant.

A acidez do solo é um dos principais fatores limitantes à produção vegetal. A toxicidade por alumínio, que ocorre apenas a pH baixo, tem sido extensamente investigada, enquanto o estresse causado pelo pH baixo tem recebido pouca atenção. Os estudos nesta área quase sempre presumem efeitos aditivos, e portanto independentes, da toxicidade por Al3+ e H+. Este provavelmente não é o caso, sendo que o pH baixo pode ser um fator de predisposição das células ao Al3+. As evidências indicam que o pH baixo causa desarranjos na parede de células em crescimento, gerando estresse que pode comprometer a sua funcionalidade e integridade. É provável que a susceptibilidade a este estresse deve ser dependente da pressão de turgor. Por sua vez, o metabolismo oxidativo e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) na parede celular podem modular a sua extensibilidade por romper ou criar ligações dentro ou entre cadeias de polissacarídeo. Há grande interesse em se conhecer se, à semelhança do que ocorre em leveduras, as células vegetais possuem um sistema de percepção e resposta a estresse da parede. Os pêlos radiculares em crescimento são sensíveis a pH baixo e estresse hipo-osmótico e constituem um bom modelo experimental para estes estudos. Os objetivos deste trabalho foram: a) Otimizar um sistema experimental para o estudo de pêlos radiculares de tomateiro (Solanum lycopersicum L. cv Micro-Tom); b) Avaliar as respostas dos pêlos radiculares ao estresse por pH baixo e hipo-osmolaridade; c) Examinar o papel da modulação oxidativa da parede celular nestas respostas; e d) Avaliar a resposta de diferentes mutantes hormonais de Micro-Tom a estes fatores de estresse. Os principais parâmetros avaliados foram a taxa de alongamento (µm.min-1) e a freqüência de rompimento dos pêlos. Tanto o estresse por pH baixo quanto choques hipo-osmóticos resultaram em taxas de alongamento significativamente diminuídos e o rompimento de pêlos radiculares, mas os efeitos dos tratamentos hipo-osmóticos foram mais marcantes. Uma curva de resposta frente à osmolaridade da solução externa revelou que a taxa de alongamento aumentou com a diminuição da osmolaridade até alcançar um limiar em que houve redução drástica da taxa de alongamento e começou-se a observar o rompimento de pêlos. Também se observou uma interação entre hipo-osmolaridade e pH baixo. O emprego do inibidor difenileno iodônio não forneceu evidências do envolvimento de NADPH oxidases da membrana plasmática na resposta de pêlos radiculares a choque hipo-osmótico ou pH baixo. Já no caso do inibidor ácido salicilhidroxâmico, encontrou-se evidências do envolvimento de peroxidases da parede. Nos mutantes hormonais dgt (pouco sensível a auxina) e epi (super produtor de etileno), mas não em not (deficiente em ácido abscísico), os pêlos radiculares apresentaram uma melhor resposta de ajustamento a choque hipo-osmótico do que Micro-Tom, reduzindo o alongamento e o rompimento dos pêlos. Este trabalho fornece fortes evidências de que os pêlos radiculares possuem um mecanismo de percepção e resposta a estresse da parede visando à manutenção de sua integridade e que apresentam bom potencial como sistema modelo nesta linha de pesquisa / Soil acidity is a major factor limiting plant growth worldwide. Aluminum toxicity, which occurs only at low pH, has been extensively studied, whereas low pH stress has received much less attention. Studies on Al3+ and H+ toxicity make the underlying assumption that the effects of these stress factors are additive, and, therefore independent of each other. However, this is most likely not the case and low pH may be a factor which increases susceptibility to further injury by Al3+. There is evidence that low pH causes disruption in cell wall structure of growing cells, which might jeopardize cell wall functionality and integrity. It is likely that turgor pressure plays an important role in cell wall stress caused by low pH. The apoplastic metabolism of reactive oxygen species (ROS) can modulate cell wall extensibility by making or breaking bonds within and between cell wall polysaccharides. A major question is whether, similarly to yeast, plant cells have a cell wall integrity signaling and response system. Growing root hairs are sensitive to low pH and hypo-osmotic stress and are potentially good experimental systems for such investigations. The objectives of this study were: a) Optimize an experimental system to examine tomato (Solanum lycopersicum L. cv Micro-Tom) root hairs; b) Examine the response of root hairs to low pH and hypo-osmotic stress; c) Examine the role of oxidative modulation of the cell wall in these responses; and d) Evaluate the response of different hormonal mutants of Micro-Tom to these stress factors. Root hair elongation rates (µm.min-1) and the frequency of cell bursting were the major experimental parameters which were evaluated. Both low pH and, more markedly, hypo-osmotic stress caused significant reductions in elongation rates and the bursting of root hair tips. In a response curve to varying osmolarities of the external medium, root hair elongation rates increased with decreasing osmolarities until a threshold was reached and elongation rates decreased drastically and the bursting of root hairs began to be observed. Interactions between low pH and hypo-osmolarity were observed. The use of the inhibitor diphenylene iodonium (DPI) did not provide evidence for the involvement of plasma membrane NADPH in the response of root hairs to low pH and hypo-osmotic shock. However, a role for cell wall peroxidases was provided by use of the inhibitor salicylhydroxamic acid (SHAM). Root hairs of the hormonal mutants dgt (low sensitivity to auxin) and epi (ethylene super producer), but not not (deficient in abscisic acid), displayed a more effective response to hypo-osmotic shock than Micro-Tom, by decreasing elongation rates and cell bursting to a greater degree. This study provides strong evidence to suggest that root hairs have a cell wall integrity response system and that root hairs are potentially good cell model systems for such research

A acidez do solo é um dos principais fatores limitantes à produção vegetal. A toxicidade por alumínio, que ocorre apenas a pH baixo, tem sido extensamente investigada, enquanto o estresse causado pelo pH baixo tem recebido pouca atenção. Os estudos nesta área quase sempre presumem efeitos aditivos, e portanto independentes, da toxicidade por Al3+ e H+. Este provavelmente não é o caso, sendo que o pH baixo pode ser um fator de predisposição das células ao Al3+. As evidências indicam que o pH baixo causa desarranjos na parede de células em crescimento, gerando estresse que pode comprometer a sua funcionalidade e integridade. É provável que a susceptibilidade a este estresse deve ser dependente da pressão de turgor. Por sua vez, o metabolismo oxidativo e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) na parede celular podem modular a sua extensibilidade por romper ou criar ligações dentro ou entre cadeias de polissacarídeo. Há grande interesse em se conhecer se, à semelhança do que ocorre em leveduras, as células vegetais possuem um sistema de percepção e resposta a estresse da parede. Os pêlos radiculares em crescimento são sensíveis a pH baixo e estresse hipo-osmótico e constituem um bom modelo experimental para estes estudos. Os objetivos deste trabalho foram: a) Otimizar um sistema experimental para o estudo de pêlos radiculares de tomateiro (Solanum lycopersicum L. cv Micro-Tom); b) Avaliar as respostas dos pêlos radiculares ao estresse por pH baixo e hipo-osmolaridade; c) Examinar o papel da modulação oxidativa da parede celular nestas respostas; e d) Avaliar a resposta de diferentes mutantes hormonais de Micro-Tom a estes fatores de estresse. Os principais parâmetros avaliados foram a taxa de alongamento (µm.min-1) e a freqüência de rompimento dos pêlos. Tanto o estresse por pH baixo quanto choques hipo-osmóticos resultaram em taxas de alongamento significativamente diminuídos e o rompimento de pêlos radiculares, mas os efeitos dos tratamentos hipo-osmóticos foram mais marcantes. Uma curva de resposta frente à osmolaridade da solução externa revelou que a taxa de alongamento aumentou com a diminuição da osmolaridade até alcançar um limiar em que houve redução drástica da taxa de alongamento e começou-se a observar o rompimento de pêlos. Também se observou uma interação entre hipo-osmolaridade e pH baixo. O emprego do inibidor difenileno iodônio não forneceu evidências do envolvimento de NADPH oxidases da membrana plasmática na resposta de pêlos radiculares a choque hipo-osmótico ou pH baixo. Já no caso do inibidor ácido salicilhidroxâmico, encontrou-se evidências do envolvimento de peroxidases da parede. Nos mutantes hormonais dgt (pouco sensível a auxina) e epi (super produtor de etileno), mas não em not (deficiente em ácido abscísico), os pêlos radiculares apresentaram uma melhor resposta de ajustamento a choque hipo-osmótico do que Micro-Tom, reduzindo o alongamento e o rompimento dos pêlos. Este trabalho fornece fortes evidências de que os pêlos radiculares possuem um mecanismo de percepção e resposta a estresse da parede visando à manutenção de sua integridade e que apresentam bom potencial como sistema modelo nesta linha de pesquisa / Soil acidity is a major factor limiting plant growth worldwide. Aluminum toxicity, which occurs only at low pH, has been extensively studied, whereas low pH stress has received much less attention. Studies on Al3+ and H+ toxicity make the underlying assumption that the effects of these stress factors are additive, and, therefore independent of each other. However, this is most likely not the case and low pH may be a factor which increases susceptibility to further injury by Al3+. There is evidence that low pH causes disruption in cell wall structure of growing cells, which might jeopardize cell wall functionality and integrity. It is likely that turgor pressure plays an important role in cell wall stress caused by low pH. The apoplastic metabolism of reactive oxygen species (ROS) can modulate cell wall extensibility by making or breaking bonds within and between cell wall polysaccharides. A major question is whether, similarly to yeast, plant cells have a cell wall integrity signaling and response system. Growing root hairs are sensitive to low pH and hypo-osmotic stress and are potentially good experimental systems for such investigations. The objectives of this study were: a) Optimize an experimental system to examine tomato (Solanum lycopersicum L. cv Micro-Tom) root hairs; b) Examine the response of root hairs to low pH and hypo-osmotic stress; c) Examine the role of oxidative modulation of the cell wall in these responses; and d) Evaluate the response of different hormonal mutants of Micro-Tom to these stress factors. Root hair elongation rates (µm.min-1) and the frequency of cell bursting were the major experimental parameters which were evaluated. Both low pH and, more markedly, hypo-osmotic stress caused significant reductions in elongation rates and the bursting of root hair tips. In a response curve to varying osmolarities of the external medium, root hair elongation rates increased with decreasing osmolarities until a threshold was reached and elongation rates decreased drastically and the bursting of root hairs began to be observed. Interactions between low pH and hypo-osmolarity were observed. The use of the inhibitor diphenylene iodonium (DPI) did not provide evidence for the involvement of plasma membrane NADPH in the response of root hairs to low pH and hypo-osmotic shock. However, a role for cell wall peroxidases was provided by use of the inhibitor salicylhydroxamic acid (SHAM). Root hairs of the hormonal mutants dgt (low sensitivity to auxin) and epi (ethylene super producer), but not not (deficient in abscisic acid), displayed a more effective response to hypo-osmotic shock than Micro-Tom, by decreasing elongation rates and cell bursting to a greater degree. This study provides strong evidence to suggest that root hairs have a cell wall integrity response system and that root hairs are potentially good cell model systems for such research

A acidez do solo é um dos principais fatores limitantes à produção vegetal. Apesar da toxicidade por alumínio ter sido extensamente investigada, pouca atenção tem sido dada ao estresse causado pelo baixo pH em si. Existem diferenças marcantes entre células quanto à sensibilidade ao pH baixo que dependem do seu estado de crescimento e desenvolvimento celular e que devem ser exploradas para se entender o que determina a sensibilidade e tolerância a pH baixo. Em alguns casos, a suscetibilidade a pH baixo está relacionada a desarranjos na parede de células em crescimento, chegando a causar o rompimento da célula, como já foi demonstrado em pêlos radiculares em expansão. Por outro lado, o metabolismo oxidativo e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) na parede podem influenciar neste processo por romper ou criar ligações dentro ou entre cadeias de polissacarídeos, modulando assim a extensibilidade da parede celular. Em células de tabaco (Nicotiana tabacum) cv. BY-2, há um aumento acentuado na sensibilidade ao pH baixo no final da fase lag da cultura, que ocorrre entre 12 e 24 h de cultivo. Os objetivos deste trabalho foram: a) Investigar se a mudança na sensibilidade pH baixo ocorre durante a retomada do ciclo celular e determinar, com o uso de inibidores do ciclo celular, o período do ciclo em que isto ocorre; b) verificar se o aumento da sensibilidade a pH baixo está relacionado com a expansão celular ou com alterações no potencial osmótico da célula; c) examinar o efeito da aplicação de H2O2 ou ascorbato sobre a resposta de células sensíveis a pH baixo; d) testar a hipótese de que a sensibilidade a pH baixo pode ser revertida por meio de um choque hipo-osmótico prévio; e) avaliar o possível papel da modulação oxidativa da parede celular na reversão de sensibilidade das células a pH baixo expostas ao choque hipo-osmótico. A retomada do ciclo celular é necessária para que ocorra a alteração de sensibilidade a pH baixo, pois a remoção de auxina (2,4-D) ou a adição de bloqueadores de canais de K+ impediu ou atrasou, respectivamente, a alteração na sensibilidade a pH baixo. O uso de inibidores do ciclo celular demonstrou que as células de BY-2 se tornam mais sensíveis a pH baixo durante o final da fase G1 mas antes do ponto de checagem da transição G1/S do ciclo celular. A aplicação de H2O2, diminuiu a suscetibilidade das células a pH baixo, ao contrário da aplicação de ascorbato. Foi demonstrado que a aplicação prévia de tratamento hipo-osmótico por 60 min reverteu a sensibilidade de células a pH baixo. A aplicação de inibidores de NAPDH oxidase da membrana plasmática e de peroxidases revelou a participação destas enzimas na reversão de sensibilidade das células a pH baixo, indicando a possibilidade de geração de ROS e de modulação oxidativa da parede. Embora já tenha sido descrito que ocorre uma explosão oxidativa com choque hipo-osmótico, ainda não havia sido demonstrado a conseqüência disto. Este trabalho fornece indícios de que uma explosão oxidativa poderia modificar a parede tornando-a mais resistente e a célula menos suscetível a pH baixo / Soil acidity is a major factor limiting plant growth worldwide. Although aluminum toxicity, which occurs only at low pH, has been extensively studied, little attention has been given to stress caused by low pH. There are marked differences in the sensitivity of cells to low pH which are contingent on the growth and developmental stage of the cells. These differences should be explored to further the understanding of the factors governing sensitivity and tolerance to low pH. In at least some cases, the susceptibility of cells to low pH is related to derangements in the wall of growing cells, which can cause ruptures or bursting of the cells, as has been clearly demonstrated in expanding root hairs. On the other hand, the oxidative metabolism and generation of reactive oxygen species (ROS) can modulate cell wall extensibility by breaking or making bonds within and between cell wall polymers. In tobacco (Nicotiana tabacum) cv. BY-2 cells, there is a sharp increase in sensitivity to low pH at the end of the lag phase of the cell culture, which occurs between 12 and 24 h of subculture. The objectives of this study were: a) determine if the changes in sensitivity to low pH occurred during the restart of the cell cycle and, by employing cell cycle inhibitors, at which points of the cycle does this occur; b) examine if the changes in sensitivity to low pH are related to cell expansion or changes in osmotic potential of the cell; c) examine how the application of H2O2 or ascorbate affects the response of cells to low pH; d) test the hypothesis that sensitivity of cells to low pH can be reverted by the previous application of a hypo-osmotic shock; e) evaluate the possible role of oxidative modulation of the cell wall in hypo-osmotic-induced reversal of the sensitivity of cells to low pH. The restart of the cell cycle was shown to be necessary for the change in sensitivity to low pH occur, since the absence of auxin (2,4-D) or the addition of K+ channel blockers prevented or delayed this change, respectively. The use of cell cycle inhibitors demonstrated that BY-2 cells become sensitive to low pH at the end of G1 but before the G1/S transition restriction point of the cell cycle. Exogenous H2O2, but not ascorbate, reduced the effect of low pH on sensitive cells. Sensitive cells submitted to 60 min hypo-osmotic treatment became insensitive to low pH. This reversal of sensitivity depended on the activity of plasma membrane NADPH oxidase and peroxidase, as evidenced by the use of DPI and SHAM, inhibitors of these enzymes, respectively. This suggests that ROS is generated and that oxidative modifications of the cell wall occur. Although hypo-osmotic treatments have been shown to generate an oxidative burst, its purpose or implication has not yet been shown. This study provides evidence that an oxidative burst might modify and strengthen the cell wall, making cells less susceptible to low pH

A acidez do solo é um dos principais fatores limitantes à produção vegetal. Apesar da toxicidade por alumínio ter sido extensamente investigada, pouca atenção tem sido dada ao estresse causado pelo baixo pH em si. Existem diferenças marcantes entre células quanto à sensibilidade ao pH baixo que dependem do seu estado de crescimento e desenvolvimento celular e que devem ser exploradas para se entender o que determina a sensibilidade e tolerância a pH baixo. Em alguns casos, a suscetibilidade a pH baixo está relacionada a desarranjos na parede de células em crescimento, chegando a causar o rompimento da célula, como já foi demonstrado em pêlos radiculares em expansão. Por outro lado, o metabolismo oxidativo e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) na parede podem influenciar neste processo por romper ou criar ligações dentro ou entre cadeias de polissacarídeos, modulando assim a extensibilidade da parede celular. Em células de tabaco (Nicotiana tabacum) cv. BY-2, há um aumento acentuado na sensibilidade ao pH baixo no final da fase lag da cultura, que ocorrre entre 12 e 24 h de cultivo. Os objetivos deste trabalho foram: a) Investigar se a mudança na sensibilidade pH baixo ocorre durante a retomada do ciclo celular e determinar, com o uso de inibidores do ciclo celular, o período do ciclo em que isto ocorre; b) verificar se o aumento da sensibilidade a pH baixo está relacionado com a expansão celular ou com alterações no potencial osmótico da célula; c) examinar o efeito da aplicação de H2O2 ou ascorbato sobre a resposta de células sensíveis a pH baixo; d) testar a hipótese de que a sensibilidade a pH baixo pode ser revertida por meio de um choque hipo-osmótico prévio; e) avaliar o possível papel da modulação oxidativa da parede celular na reversão de sensibilidade das células a pH baixo expostas ao choque hipo-osmótico. A retomada do ciclo celular é necessária para que ocorra a alteração de sensibilidade a pH baixo, pois a remoção de auxina (2,4-D) ou a adição de bloqueadores de canais de K+ impediu ou atrasou, respectivamente, a alteração na sensibilidade a pH baixo. O uso de inibidores do ciclo celular demonstrou que as células de BY-2 se tornam mais sensíveis a pH baixo durante o final da fase G1 mas antes do ponto de checagem da transição G1/S do ciclo celular. A aplicação de H2O2, diminuiu a suscetibilidade das células a pH baixo, ao contrário da aplicação de ascorbato. Foi demonstrado que a aplicação prévia de tratamento hipo-osmótico por 60 min reverteu a sensibilidade de células a pH baixo. A aplicação de inibidores de NAPDH oxidase da membrana plasmática e de peroxidases revelou a participação destas enzimas na reversão de sensibilidade das células a pH baixo, indicando a possibilidade de geração de ROS e de modulação oxidativa da parede. Embora já tenha sido descrito que ocorre uma explosão oxidativa com choque hipo-osmótico, ainda não havia sido demonstrado a conseqüência disto. Este trabalho fornece indícios de que uma explosão oxidativa poderia modificar a parede tornando-a mais resistente e a célula menos suscetível a pH baixo / Soil acidity is a major factor limiting plant growth worldwide. Although aluminum toxicity, which occurs only at low pH, has been extensively studied, little attention has been given to stress caused by low pH. There are marked differences in the sensitivity of cells to low pH which are contingent on the growth and developmental stage of the cells. These differences should be explored to further the understanding of the factors governing sensitivity and tolerance to low pH. In at least some cases, the susceptibility of cells to low pH is related to derangements in the wall of growing cells, which can cause ruptures or bursting of the cells, as has been clearly demonstrated in expanding root hairs. On the other hand, the oxidative metabolism and generation of reactive oxygen species (ROS) can modulate cell wall extensibility by breaking or making bonds within and between cell wall polymers. In tobacco (Nicotiana tabacum) cv. BY-2 cells, there is a sharp increase in sensitivity to low pH at the end of the lag phase of the cell culture, which occurs between 12 and 24 h of subculture. The objectives of this study were: a) determine if the changes in sensitivity to low pH occurred during the restart of the cell cycle and, by employing cell cycle inhibitors, at which points of the cycle does this occur; b) examine if the changes in sensitivity to low pH are related to cell expansion or changes in osmotic potential of the cell; c) examine how the application of H2O2 or ascorbate affects the response of cells to low pH; d) test the hypothesis that sensitivity of cells to low pH can be reverted by the previous application of a hypo-osmotic shock; e) evaluate the possible role of oxidative modulation of the cell wall in hypo-osmotic-induced reversal of the sensitivity of cells to low pH. The restart of the cell cycle was shown to be necessary for the change in sensitivity to low pH occur, since the absence of auxin (2,4-D) or the addition of K+ channel blockers prevented or delayed this change, respectively. The use of cell cycle inhibitors demonstrated that BY-2 cells become sensitive to low pH at the end of G1 but before the G1/S transition restriction point of the cell cycle. Exogenous H2O2, but not ascorbate, reduced the effect of low pH on sensitive cells. Sensitive cells submitted to 60 min hypo-osmotic treatment became insensitive to low pH. This reversal of sensitivity depended on the activity of plasma membrane NADPH oxidase and peroxidase, as evidenced by the use of DPI and SHAM, inhibitors of these enzymes, respectively. This suggests that ROS is generated and that oxidative modifications of the cell wall occur. Although hypo-osmotic treatments have been shown to generate an oxidative burst, its purpose or implication has not yet been shown. This study provides evidence that an oxidative burst might modify and strengthen the cell wall, making cells less susceptible to low pH