Submitted by LETÍCIA RODRIGUES ALVES null (leticiarodalves@yahoo.com.br) on 2016-08-23T15:29:42Z No. of bitstreams: 1 AlvesLR_DISSERTAÇÃO+CERTIFICADO.pdf: 2471666 bytes, checksum: bbe3b90a7ad821bca3d2ff9e298beb5f (MD5) / Rejected by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: A folha de aprovação deve constar após a ficha catalográfica. A versão submetida por você é considerada a versão final da dissertação/tese, portanto não poderá ocorrer qualquer alteração em seu conteúdo após a aprovação. Corrija esta informação e realize uma nova submissão contendo o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2016-08-24T16:10:04Z (GMT) / Submitted by LETÍCIA RODRIGUES ALVES null (leticiarodalves@yahoo.com.br) on 2016-09-05T16:31:58Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_LR Alves - atualizada2.pdf: 1845174 bytes, checksum: 6d6d5923f6f594ad941d882c5beadab0 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-09-06T12:52:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 alves_l_me_jabo.pdf: 1845174 bytes, checksum: 6d6d5923f6f594ad941d882c5beadab0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-06T12:52:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alves_l_me_jabo.pdf: 1845174 bytes, checksum: 6d6d5923f6f594ad941d882c5beadab0 (MD5) Previous issue date: 2016-06-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A contaminação por metais pesados é um problema mundial e é uma das causas mais severas de estresse abiótico nas plantas, desencadeando perdas na produtividade e risco de contaminação para a saúde humana. A concentração de cádmio aumentou consideravelmente no meio ambiente devido a fatores antropogênicos. As plantas podem absorver o cádmio, levando a alta produção de espécies reativas de oxigênio, o que desencadeia cascatas de oxidação descontroladas, resultando em danos a planta. Com o objetivo de adicionar novas informações nesta área, foi realizada uma discussão sobre a contaminação dos solos agrícolas por metais pesados, os danos causados na homeostase celular, o sistema antioxidante de defesa e o impacto para os consumidores. Além disso, foi feito um estudo sobre a comunicação da raiz para a parte aérea durante uma condição de estresse, interconectando a resposta especifica das espécies reativas de oxigênio e a ação dos hormônios nesta comunicação. Pare este propósito, foi utilizado como ferramenta a enxertia e os mutantes hormonais para investigar a modulação da resposta antioxidante de defesa entre os órgãos. / Heavy metal contamination is a worldwide concern and one of the most severe causes of abiotic stress in plants, triggering losses in crop production and contamination risks to human health. Cadmium concentration have been increased in environment due to several anthropogenic factors. Plants can uptake cadmium, which lead to a high production of reactive oxygen species and trigger an uncontrolled oxidation cascade in cells, resulting in damages to plant. In order to gain new information about this subject, we carried out a deep discussion about heavy metal contamination in agricultural soils, damages in cell homeostasis, antioxidant defense system and the impact to food consumers. Moreover, we studied root-to-shoot communication during stress condition and the specific responses of reactive oxygen species and hormones in this communication. For this propose, we used grafted hormonal mutants as a tool to investigate the modulation of antioxidant stress responses between organs. / FAPESP: 2013/27080-4

Sabe-se que dentre os principais contaminantes ambientais estão os metais pesados, decorrentes da intensa atividade agroindustrial das últimas décadas. Em especial, o cádmio (Cd) é um elemento não essencial que está entre os poluentes ambientais mais tóxicos a humanos, animais e plantas, mesmo em baixas concentrações. Considerando a relevância da problemática da toxicidade por Cd, a caracterização da resposta de um sistema modelo largamente usado como o Micro-Tom, é essencial para o maior conhecimento dos processos fisiológicos, bioquímicos e genéticos envolvendo a toxicidade e a resistência ao Cd. Outro fator a ser considerado é a importância econômica do tomate para a agricultura mundial, aliando as perdas de produtividade à falta de conhecimento sobre os mecanismos de toxicidade. A proposta do projeto foi o estudo do comportamento de plantas de Micro-Tom expostas ao Cd, através do processo de estresse oxidativo decorrente da exposição ao metal. Por meio de todos os parâmetros analisados ao longo do projeto, foi possível caracterizar o modelo Micro-Tom quanto à toxicidade por Cd. Após toda esta parte exploratória de caracterização dos níveis de atividade antioxidativa, foi possível a inclusão de mutantes hormonais (auxina, etileno) já introduzidos nesse cultivar, tornando o estudo mais investigativo com novas perspectivas da relação hormonal com os mecanismos de toxicidade e resistência a fatores de estresse em geral. / It is known that among the main environmental contaminants are included the heavy metals, a result of the intense industrialized activity. Cadmium (Cd) is a non essential element that is among the most dangerous heavy metals, leading to considerable losses in plant productivity and hazardous health effects, even in low concentrations. Considering the high Cd toxicity, the characterization of the responses by a model system like Micro-Tom may be essential to understanding about physiological, biochemistry and genetic processes involved with the toxicity and resistance to Cd. Another major aspect to be considered is the economical importance of tomato in world agriculture and the possible losses of productivity caused by Cd. The main objective of this part of the work was to study Cd-induced oxidative stress in Micro- Tom plants. Through the parameters analysed, it was possible to characterize the Micro-Tom model related to Cd toxicity. After this initial characterization based mainly on antioxidative activities, it was possible to include in the study hormonal mutants (auxin, ethylene, introduced into the Micro-Tom line), in order to investigate whether these mutants respond differently from the wild-type when Cd-induced oxidative stress is concerned.

Sabe-se que dentre os principais contaminantes ambientais estão os metais pesados, decorrentes da intensa atividade agroindustrial das últimas décadas. Em especial, o cádmio (Cd) é um elemento não essencial que está entre os poluentes ambientais mais tóxicos a humanos, animais e plantas, mesmo em baixas concentrações. Considerando a relevância da problemática da toxicidade por Cd, a caracterização da resposta de um sistema modelo largamente usado como o Micro-Tom, é essencial para o maior conhecimento dos processos fisiológicos, bioquímicos e genéticos envolvendo a toxicidade e a resistência ao Cd. Outro fator a ser considerado é a importância econômica do tomate para a agricultura mundial, aliando as perdas de produtividade à falta de conhecimento sobre os mecanismos de toxicidade. A proposta do projeto foi o estudo do comportamento de plantas de Micro-Tom expostas ao Cd, através do processo de estresse oxidativo decorrente da exposição ao metal. Por meio de todos os parâmetros analisados ao longo do projeto, foi possível caracterizar o modelo Micro-Tom quanto à toxicidade por Cd. Após toda esta parte exploratória de caracterização dos níveis de atividade antioxidativa, foi possível a inclusão de mutantes hormonais (auxina, etileno) já introduzidos nesse cultivar, tornando o estudo mais investigativo com novas perspectivas da relação hormonal com os mecanismos de toxicidade e resistência a fatores de estresse em geral. / It is known that among the main environmental contaminants are included the heavy metals, a result of the intense industrialized activity. Cadmium (Cd) is a non essential element that is among the most dangerous heavy metals, leading to considerable losses in plant productivity and hazardous health effects, even in low concentrations. Considering the high Cd toxicity, the characterization of the responses by a model system like Micro-Tom may be essential to understanding about physiological, biochemistry and genetic processes involved with the toxicity and resistance to Cd. Another major aspect to be considered is the economical importance of tomato in world agriculture and the possible losses of productivity caused by Cd. The main objective of this part of the work was to study Cd-induced oxidative stress in Micro- Tom plants. Through the parameters analysed, it was possible to characterize the Micro-Tom model related to Cd toxicity. After this initial characterization based mainly on antioxidative activities, it was possible to include in the study hormonal mutants (auxin, ethylene, introduced into the Micro-Tom line), in order to investigate whether these mutants respond differently from the wild-type when Cd-induced oxidative stress is concerned.

A acidez do solo é um dos principais fatores limitantes à produção vegetal. A toxicidade por alumínio, que ocorre apenas a pH baixo, tem sido extensamente investigada, enquanto o estresse causado pelo pH baixo tem recebido pouca atenção. Os estudos nesta área quase sempre presumem efeitos aditivos, e portanto independentes, da toxicidade por Al3+ e H+. Este provavelmente não é o caso, sendo que o pH baixo pode ser um fator de predisposição das células ao Al3+. As evidências indicam que o pH baixo causa desarranjos na parede de células em crescimento, gerando estresse que pode comprometer a sua funcionalidade e integridade. É provável que a susceptibilidade a este estresse deve ser dependente da pressão de turgor. Por sua vez, o metabolismo oxidativo e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) na parede celular podem modular a sua extensibilidade por romper ou criar ligações dentro ou entre cadeias de polissacarídeo. Há grande interesse em se conhecer se, à semelhança do que ocorre em leveduras, as células vegetais possuem um sistema de percepção e resposta a estresse da parede. Os pêlos radiculares em crescimento são sensíveis a pH baixo e estresse hipo-osmótico e constituem um bom modelo experimental para estes estudos. Os objetivos deste trabalho foram: a) Otimizar um sistema experimental para o estudo de pêlos radiculares de tomateiro (Solanum lycopersicum L. cv Micro-Tom); b) Avaliar as respostas dos pêlos radiculares ao estresse por pH baixo e hipo-osmolaridade; c) Examinar o papel da modulação oxidativa da parede celular nestas respostas; e d) Avaliar a resposta de diferentes mutantes hormonais de Micro-Tom a estes fatores de estresse. Os principais parâmetros avaliados foram a taxa de alongamento (µm.min-1) e a freqüência de rompimento dos pêlos. Tanto o estresse por pH baixo quanto choques hipo-osmóticos resultaram em taxas de alongamento significativamente diminuídos e o rompimento de pêlos radiculares, mas os efeitos dos tratamentos hipo-osmóticos foram mais marcantes. Uma curva de resposta frente à osmolaridade da solução externa revelou que a taxa de alongamento aumentou com a diminuição da osmolaridade até alcançar um limiar em que houve redução drástica da taxa de alongamento e começou-se a observar o rompimento de pêlos. Também se observou uma interação entre hipo-osmolaridade e pH baixo. O emprego do inibidor difenileno iodônio não forneceu evidências do envolvimento de NADPH oxidases da membrana plasmática na resposta de pêlos radiculares a choque hipo-osmótico ou pH baixo. Já no caso do inibidor ácido salicilhidroxâmico, encontrou-se evidências do envolvimento de peroxidases da parede. Nos mutantes hormonais dgt (pouco sensível a auxina) e epi (super produtor de etileno), mas não em not (deficiente em ácido abscísico), os pêlos radiculares apresentaram uma melhor resposta de ajustamento a choque hipo-osmótico do que Micro-Tom, reduzindo o alongamento e o rompimento dos pêlos. Este trabalho fornece fortes evidências de que os pêlos radiculares possuem um mecanismo de percepção e resposta a estresse da parede visando à manutenção de sua integridade e que apresentam bom potencial como sistema modelo nesta linha de pesquisa / Soil acidity is a major factor limiting plant growth worldwide. Aluminum toxicity, which occurs only at low pH, has been extensively studied, whereas low pH stress has received much less attention. Studies on Al3+ and H+ toxicity make the underlying assumption that the effects of these stress factors are additive, and, therefore independent of each other. However, this is most likely not the case and low pH may be a factor which increases susceptibility to further injury by Al3+. There is evidence that low pH causes disruption in cell wall structure of growing cells, which might jeopardize cell wall functionality and integrity. It is likely that turgor pressure plays an important role in cell wall stress caused by low pH. The apoplastic metabolism of reactive oxygen species (ROS) can modulate cell wall extensibility by making or breaking bonds within and between cell wall polysaccharides. A major question is whether, similarly to yeast, plant cells have a cell wall integrity signaling and response system. Growing root hairs are sensitive to low pH and hypo-osmotic stress and are potentially good experimental systems for such investigations. The objectives of this study were: a) Optimize an experimental system to examine tomato (Solanum lycopersicum L. cv Micro-Tom) root hairs; b) Examine the response of root hairs to low pH and hypo-osmotic stress; c) Examine the role of oxidative modulation of the cell wall in these responses; and d) Evaluate the response of different hormonal mutants of Micro-Tom to these stress factors. Root hair elongation rates (µm.min-1) and the frequency of cell bursting were the major experimental parameters which were evaluated. Both low pH and, more markedly, hypo-osmotic stress caused significant reductions in elongation rates and the bursting of root hair tips. In a response curve to varying osmolarities of the external medium, root hair elongation rates increased with decreasing osmolarities until a threshold was reached and elongation rates decreased drastically and the bursting of root hairs began to be observed. Interactions between low pH and hypo-osmolarity were observed. The use of the inhibitor diphenylene iodonium (DPI) did not provide evidence for the involvement of plasma membrane NADPH in the response of root hairs to low pH and hypo-osmotic shock. However, a role for cell wall peroxidases was provided by use of the inhibitor salicylhydroxamic acid (SHAM). Root hairs of the hormonal mutants dgt (low sensitivity to auxin) and epi (ethylene super producer), but not not (deficient in abscisic acid), displayed a more effective response to hypo-osmotic shock than Micro-Tom, by decreasing elongation rates and cell bursting to a greater degree. This study provides strong evidence to suggest that root hairs have a cell wall integrity response system and that root hairs are potentially good cell model systems for such research

A acidez do solo é um dos principais fatores limitantes à produção vegetal. A toxicidade por alumínio, que ocorre apenas a pH baixo, tem sido extensamente investigada, enquanto o estresse causado pelo pH baixo tem recebido pouca atenção. Os estudos nesta área quase sempre presumem efeitos aditivos, e portanto independentes, da toxicidade por Al3+ e H+. Este provavelmente não é o caso, sendo que o pH baixo pode ser um fator de predisposição das células ao Al3+. As evidências indicam que o pH baixo causa desarranjos na parede de células em crescimento, gerando estresse que pode comprometer a sua funcionalidade e integridade. É provável que a susceptibilidade a este estresse deve ser dependente da pressão de turgor. Por sua vez, o metabolismo oxidativo e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) na parede celular podem modular a sua extensibilidade por romper ou criar ligações dentro ou entre cadeias de polissacarídeo. Há grande interesse em se conhecer se, à semelhança do que ocorre em leveduras, as células vegetais possuem um sistema de percepção e resposta a estresse da parede. Os pêlos radiculares em crescimento são sensíveis a pH baixo e estresse hipo-osmótico e constituem um bom modelo experimental para estes estudos. Os objetivos deste trabalho foram: a) Otimizar um sistema experimental para o estudo de pêlos radiculares de tomateiro (Solanum lycopersicum L. cv Micro-Tom); b) Avaliar as respostas dos pêlos radiculares ao estresse por pH baixo e hipo-osmolaridade; c) Examinar o papel da modulação oxidativa da parede celular nestas respostas; e d) Avaliar a resposta de diferentes mutantes hormonais de Micro-Tom a estes fatores de estresse. Os principais parâmetros avaliados foram a taxa de alongamento (µm.min-1) e a freqüência de rompimento dos pêlos. Tanto o estresse por pH baixo quanto choques hipo-osmóticos resultaram em taxas de alongamento significativamente diminuídos e o rompimento de pêlos radiculares, mas os efeitos dos tratamentos hipo-osmóticos foram mais marcantes. Uma curva de resposta frente à osmolaridade da solução externa revelou que a taxa de alongamento aumentou com a diminuição da osmolaridade até alcançar um limiar em que houve redução drástica da taxa de alongamento e começou-se a observar o rompimento de pêlos. Também se observou uma interação entre hipo-osmolaridade e pH baixo. O emprego do inibidor difenileno iodônio não forneceu evidências do envolvimento de NADPH oxidases da membrana plasmática na resposta de pêlos radiculares a choque hipo-osmótico ou pH baixo. Já no caso do inibidor ácido salicilhidroxâmico, encontrou-se evidências do envolvimento de peroxidases da parede. Nos mutantes hormonais dgt (pouco sensível a auxina) e epi (super produtor de etileno), mas não em not (deficiente em ácido abscísico), os pêlos radiculares apresentaram uma melhor resposta de ajustamento a choque hipo-osmótico do que Micro-Tom, reduzindo o alongamento e o rompimento dos pêlos. Este trabalho fornece fortes evidências de que os pêlos radiculares possuem um mecanismo de percepção e resposta a estresse da parede visando à manutenção de sua integridade e que apresentam bom potencial como sistema modelo nesta linha de pesquisa / Soil acidity is a major factor limiting plant growth worldwide. Aluminum toxicity, which occurs only at low pH, has been extensively studied, whereas low pH stress has received much less attention. Studies on Al3+ and H+ toxicity make the underlying assumption that the effects of these stress factors are additive, and, therefore independent of each other. However, this is most likely not the case and low pH may be a factor which increases susceptibility to further injury by Al3+. There is evidence that low pH causes disruption in cell wall structure of growing cells, which might jeopardize cell wall functionality and integrity. It is likely that turgor pressure plays an important role in cell wall stress caused by low pH. The apoplastic metabolism of reactive oxygen species (ROS) can modulate cell wall extensibility by making or breaking bonds within and between cell wall polysaccharides. A major question is whether, similarly to yeast, plant cells have a cell wall integrity signaling and response system. Growing root hairs are sensitive to low pH and hypo-osmotic stress and are potentially good experimental systems for such investigations. The objectives of this study were: a) Optimize an experimental system to examine tomato (Solanum lycopersicum L. cv Micro-Tom) root hairs; b) Examine the response of root hairs to low pH and hypo-osmotic stress; c) Examine the role of oxidative modulation of the cell wall in these responses; and d) Evaluate the response of different hormonal mutants of Micro-Tom to these stress factors. Root hair elongation rates (µm.min-1) and the frequency of cell bursting were the major experimental parameters which were evaluated. Both low pH and, more markedly, hypo-osmotic stress caused significant reductions in elongation rates and the bursting of root hair tips. In a response curve to varying osmolarities of the external medium, root hair elongation rates increased with decreasing osmolarities until a threshold was reached and elongation rates decreased drastically and the bursting of root hairs began to be observed. Interactions between low pH and hypo-osmolarity were observed. The use of the inhibitor diphenylene iodonium (DPI) did not provide evidence for the involvement of plasma membrane NADPH in the response of root hairs to low pH and hypo-osmotic shock. However, a role for cell wall peroxidases was provided by use of the inhibitor salicylhydroxamic acid (SHAM). Root hairs of the hormonal mutants dgt (low sensitivity to auxin) and epi (ethylene super producer), but not not (deficient in abscisic acid), displayed a more effective response to hypo-osmotic shock than Micro-Tom, by decreasing elongation rates and cell bursting to a greater degree. This study provides strong evidence to suggest that root hairs have a cell wall integrity response system and that root hairs are potentially good cell model systems for such research