Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1379485 bytes, checksum: ae907e91268da44815445844aa82dc49 (MD5) Previous issue date: 2008-03-11 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / 8(17),12e,14-labdatrien-18 oic acid (labdane-302), is a diterpene isolated from the stem bark of Xylopia langsdorfiana A. St.-Hil. & Tul. In a preliminary study, Ribeiro (2003) demonstrated that labdane-302 inhibited the phasic contractions induced by carbachol (CCh) or histamine (IC50 = 1.7  0.5 and 0.9  0.2 x 10-5 M, respectively) on guinea-pig ileum. The aim of the present study was to investigate the spasmolytic action mechanism of labdane-302 in that organ. Isometric and isotonic contractions were monitored, and the parameters of relative potency and efficacy were determined from cumulative concentration-response curves. Labdane-302 inhibited (pD´2 = 4.9  0.2; r2 = 0.8  0.1) the cumulative concentration-response curves to histamine, and these were shifted to the right, in a non-parallel manner (Schild plot slope = 4.2  1.4), with depression of the maximal effect (Emax), suggesting a noncompetitive antagonism. Labdane-302 relaxed, in an equipotent manner, the ileum pre-contracted with KCl, CCh or histamine, suggesting that this diterpene could be acting on Cav. This assumption was confirmed by observation that labdane-302 antagonized the CaCl2 induced contractions in the depolarizing medium without Ca2+ (pD´2 = 5.3  0.1; r2 = 0.5  0.05 ), with shift of the concentration-response curve to the right, in a non-parallel manner (Schild plot slope = 2.6  0.5), with depression of Emax. As in the guinea-pig ileum the major CaV subtype is the Cav 1, we decided to investigated its role in the action mechanism of labdane-302, and was verified that the diterpene relaxed (EC50 = 3.6  0.8 x 10-5 M) the ileum pre-contracted with S-(-)-Bay K8644, a selective agonist of the Cav1. As the potent relaxing of labdane-302 was no different when ileum pre-contracted with KCl or S-(-)-Bay K8644, it is suggestive of indirect blockade of the Cav1. Since K+ channels play a major role in the regulation of membrane potential and modulation of CaV, we decided to investigate the participation of K+ channels in the spasmolytic action of labdane-302. The relaxant potency of labdane-302 (EC50 = 1.5  0.3 x 10-5 M) was decreased on 2.4 times in the presence of CsCl, a non-selective K+channels blocker (CE50 = 3,5  0,6 x 10-5 M), suggesting a possible involvement of the K+ channels in the spasmolytic effect caused by labdane-302. In order to verify which subtypes of K+ channels could be involved we used selectives blockers of these channels. The observation that 4-aminopyridine, a selective blocker of Kv, and that TEA+ 1 mM, a selective blocker of the BKca did not change the relaxant effect of labdane-302 suggests that KV and BKca are not involved in its action mechanism. On the other hand, the log concentration-response curve induced by labdane-302 was shifted to the right in the presence of apamine, selective blocker of the SKCa, (EC50 = 3.3  0.4 x 10-5 M) or glibenclamide, selective blocker of the KATP, (EC50 = 3.2  0.3 x 10-5 M), suggesting the involvement of SKCa and KATP in the spasmolytic action mechanism induced by labdane-302 on guinea-pig ileum. In the presence of aminophylline the potency of labdane-302 was increased (EC50 = 0.4 ± 0.03 x 10-5 M), which indicate participation of cyclic nucleotides. These results suggest that the relaxant effect of labdane-302 on guinea-pig ileum, involves the activation of the SKCa and KATP with the consequent blocking of Cav-L and involvement of the cyclic nucleotides. / O ácido 8(17),12e,14-labdatrieno-18-óico (labdano-302) é um diterpeno isolado das cascas do caule de Xylopia langsdorfiana A. St.-Hil. & Tul. Em estudos anteriores Ribeiro (2003) demonstrou que o labdano-302 inibiu as contrações fásicas induzidas por carbacol (CCh) e histamina (CI50 = 1,7  0,5 e 0,9  0,2 x 10-5 M, respectivamente) em íleo de cobaia. O objetivo desse estudo foi investigar o mecanismo de ação espasmolítica do labdano-302 neste órgão. As contrações isométricas e isotônicas foram monitoradas e os parâmetros de potência e eficácia relativas foram determinados a partir de curvas de concentrações-resposta cumulativas. O labdano-302 inibiu (pD´2 = 4,9  0,2; r2 = 0,8  0,1) as curvas cumulativas à histamina e estas foram desviadas para direita, de forma não paralela ( slope de Schild = 4,2  1,4) e com redução do Emax, sugerindo um antagonismo não competitivo. O labdano-302 relaxou, de maneira equipotente, o íleo pré-contraído com KCl, CCh ou histamina sugerindo que este diterpeno deve estar agindo Cav. Essa sugestão foi confirmada pelo fato do labdano-302 ter antagonizado as contrações induzidas por CaCl2 em meio despolarizante nominalmente sem Ca2+ (pD´2 = 5,3  0,1; r2 = 0,5  0,05 ), com desvio da curva concentrações-resposta para direita, de forma não paralela ( slope de Schild = 2,6  0,5) e com redução do Emax. Como em íleo de cobaia o CaV mais expresso é o Cav 1, decidiu-se investigar a sua participação no mecanismo de ação do labdano-302 e foi verificado que o diterpeno relaxou (CE50 = 3,6  0,8 x 10-5 M) o íleo pré-contraído com S-(-)-Bay K8644, um ativador seletivo dos Cav1. Como a potência relaxante do labdano-302 não foi diferente quando o órgão era pré-contraído com KCl ou S-(-)-Bay K8644, isto é sugestivo de bloqueio indireto dos Cav1. Uma vez que os canais de K+ desempenham um papel chave na regulação do potencial de membrana e modulação dos CaV, decidiu-se investigar a participação dos canais de K+ na ação espasmolítica do labdano-302. A potência relaxante de labdano-302 (CE50 = 1,5  0,3 x 10-5 M) foi reduzida em aproximadamente 2,4 vezes na presença de CsCl, bloqueador não seletivo dos canais de K+ (CE50 = 3,5  0,6 x 10-5 M), sugerindo a participação de canais de K+ no efeito do labdano-302. Para verificar qual(is) canal(is) de K+ estariam envolvidos usou-se bloqueadores seletivos desses canais. O fato da 4-aminopiridina, bloqueador seletivo dos Kv, e do tetraetilamônio 1 mM, bloqueador seletivo dos BKca não alterar o efeito relaxante do labdano-302 indica que os KV e os BKca não estão envolvidos em seu mecanismo de ação. Entretanto, a curva de relaxamento induzida pelo labdano-302 foi desviada para direita na presença de apamina, um bloqueador seletivo dos SKCa (CE50 = 3,3  0,4 x 10-5 M) ou de glibenclamida, um bloqueador seletivo dos KATP, (CE50 = 3,2  0,3 x 10-5 M), sugerindo o envolvimento dos SKCa e dos KATP no mecanismo de ação espasmolítica do labdano-302 em íleo isolado de cobaia. Na presença de aminofilina, a potência do labdano-302 foi aumentada (CE50 = 0.4 ± 0.03 x 10-5 M), o que indica a participação de nucleotídeos cíclicos. Esses resultados sugerem que o efeito relaxante do labdano-302 em íleo de cobaia, envolve a ativação dos SKCa e KATP com o conseqüente bloqueio de Cav-L e o envolvimento de nucleotídeos cíclicos.

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:00:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2254187 bytes, checksum: afd8368a3a0714175ddde1bb708cc9f9 (MD5) Previous issue date: 2014-02-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The essential oil extracted from aerial parts of Lippia microphylla Cham. (Verbenaceae) (LM-OE) presents as major compounds thymol and carvacrol. The aim of this study was to investigate and to characterize oil LM-OE spasmolytic effect on guinea pig ileum, as well to verify if this effect is due its major compunds, thymol and carvacrol. Were performed measures of isometric and isotonic contractions and cytosolic calcium. LM-OE inhibited phasic contractions induced by 10-6 M of histamine or carbachol (CCh) (IC50 = 15.8 ± 2.3 e 24.4 ± 2.9 μg/mL, respectively). In a similar manner, thymol, carvacrol and thymol/carvacrol mixture antagonized histamine- (IC50 = 14.2 ± 1.6; 13.6 ± 1.3 e 13 ± 2.1 μg/mL, respectively) ou CCh- (IC50 = 21.3 ± 3.8; 16 ± 2.6 e 27.9 ± 4.8 μg/mL, respectively) induced phasic contractions. Compared with LM-OE, in neither case was difference. In the same way, LM-OE relaxed pre-contracted organ by 40 mM of KCl, 10-5 M of CCh or 10-6 M of histamine (EC50 = 7.6 ± 0.8; 7.2 ± 1.3 e 6.8 ± 0.6 μg/mL, respectively), being equipotent in the three situations. As CaV are common step on pathway of these three contractile agents, we hypothesized that somehow LM-OE would blocking Ca2+ influx by these channels. Once probably the major compounds are biological markers for this specie, we evaluated their effect upon tonic contraction induced by 40 mM of KCl. We found that thymol, carvacrol and thymol/carvacrol mixture relaxed the ileum in a significant and concentration-dependent manner (EC50 = 5.1 ± 1.1; 11.5 ± 1 e 5.1 ± 1.1 μg/mL, respectively), being carvacrol the least potent among the three, they did not showed statistic difference when compared with LM-OE. To confirm the hypothesis of CaV participation on LM-OE spasmolytic action, were performed cumulative concentration-response curves to CaCl2 in a nominal without Ca2+ depolarizing medium in absence (control) and LM-OE presence, witch one antagonize these contractions besides to relaxes the organ when it was pre-contracted by S-(-)-Bay K 8644 (EC50 = 8.5 ± 1.5 μg/mL), a selective CaV 1, agonist confirming that the CaV subtype involved is CaV 1. The fact of CsCl, a K+ channels nonselective blocker, has not changed the relaxing potency of LM-OE oil on ileum pre-contracted with 10-5 M CCh, discard the hypothesis of positive modulation of these channels, which would lead to an indirect blockade of CaV. In experiments with ileum circular layer, LM-OE antagonized phasic contractions induced by 10-6 M of CCh (IC50 = 30.1 ± 1.5 μg/mL), that suggests a negative modulation of the Ca2+ intracellular signaling by LM-OE oil to exert its spasmolytic effect. Viability of layer longitudinal smooth muscle cells was evaluated in the absence and presence of 81 μg/mL LM-OE oil, and no cell death was verify during 2 h of contact with cells LM-OE oil. In the presence of LM-OE oil, the intensity of fluorescence in intestinal guinea pig myocytes stimulated by histamine was reduced as a result of the reduction of calcium cytosolic concentration ([Ca2+]c). In conclusion, the LM-OE oil act by blocking calcium influx through CaV1, possibly by inhibiting intracellular Ca2+ signaling and reducing [Ca2+]c, to promote its spasmolytic effect in guinea pig ileum / O óleo essencial extraído das partes aéreas de Lippia microphylla Cham. (Verbenaceae) (LM-OE) apresenta como componentes majoritários o timol e o carvacrol. O objetivo deste trabalho foi investigar e caracterizar o efeito espasmolítico do óleo LM-OE em íleo de cobaia, bem como verificar se este efeito era devido aos seus constituintes majoritários. Foram realizadas medidas de contrações isotônicas e isométricas e do cálcio citosólico. O óleo LM-OE inibiu as contrações fásicas induzidas por 10-6 M de histamina ou de carbacol (CCh) (CI50 = 15,8 ± 2,3 e 24,4 ± 2,9 μg/mL, respectivamente). Da mesma forma, o timol, o carvacrol e a mistura timol/carvacrol antagonizaram as contrações fásicas induzidas por histamina (CI50 = 14,2 ± 1,6; 13,6 ± 1,3 e 13,0 ± 2,1 μg/mL, respectivamente) ou por CCh (CI50 = 21,3 ± 3,8; 16,0 ± 2,6 e 27,9 ± 4,8 μg/mL, respectivamente). Quando comparado com o óleo, não houve diferença em nenhum dos casos. Do mesmo modo, o óleo LM-OE relaxou, de maneira equipotente, o órgão pré-contraído com 40 mM de KCl, com 10-5 M de CCh ou com 10-6 M de histamina (CE50 = 7,6 ± 0,8; 7,2 ± 1,3 e 6,8 ± 0,6 μg/mL, respectivamente). Como o passo comum na via de sinalização destes agentes contráteis são os canais de cálcio dependentes de voltagem (CaV), hipotetizou-se que de alguma forma o óleo estaria impedindo o influxo de Ca2+ através destes canais. Visto que provavelmente os componentes majoritários são os marcadores biológicos para esta espécie, avaliou-se o efeito dos mesmos sobre a contração tônica induzida por 40 mM de KCl. Observou-se que o timol, o carvacrol e a mistura timol/carvacrol relaxaram o órgão de maneira significante e dependente de concentração (CE50 = 5,1 ± 1,1; 11,5 ± 1 e 5,1 ± 1,1 μg/mL, respectivamente), sendo o carvacrol o menos potente entre os três, os quais se mostraram equipotentes ao óleo LM-OE. Para confirmar a hipótese da participação dos CaV no mecanismo espasmolítico do óleo LM-OE, foram feitas curvas concentrações-resposta cumulativas ao CaCl2 em meio despolarizante nominalmente sem Ca2+ na ausência (controle) e na presença do óleo LM-OE, o qual antagonizou essas contrações, além de relaxar o órgão pré-contraído com S-(-)-Bay K 8644 (CE50 = 8,5 ± 1,5 μg/mL), agonista seletivo dos CaV1, confirmando assim que o subtipo de CaV envolvido é o CaV1. O fato do CsCl, um bloqueador não seletivo dos canais de K+, não ter alterado a potência relaxante do óleo LM-OE no íleo pré-contraído com 10-5 M de CCh, descarta a hipótese da modulação positiva desses canais, o que levaria a um bloqueio indireto dos CaV. Em experimentos utilizando a camada circular do íleo de cobaia, o óleo antagonizou as contrações fásicas induzidas por 10-6 M de CCh (CI50 = 30,1 ± 1,5 μg/mL), o que sugere uma possível inibição da sinalização intracelular de Ca2+ para exercer seu efeito espasmolítico. A viabilidade das células musculares lisas da camada longitudinal foi avaliada na ausência e na presença de 81 μg/mL do óleo LM-OE, não havendo morte celular no período 2 h de contato das células com o óleo LM-OE. Na presença do óleo LM-OE, a intensidade de fluorescência em miócitos intestinais de cobaia estimulados por histamina foi reduzida em consequência da redução da [Ca2+]c. Em conclusão, o óleo LM-OE age por impedir o influxo de cálcio através dos CaV1, por possivelmente inibir a sinalização intracelular de Ca2+ e redução da concentração citosólica desse íon, para promover seu efeito espasmolítico em íleo isolado de cobaia

Made available in DSpace on 2015-05-08T15:00:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1953357 bytes, checksum: 23121995cc00993662a60006ebf50ffe (MD5) Previous issue date: 2010-03-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / From the stem bark of Xylopia langsdorfiana A. St.-Hil. & Tul. (Annonaceae), popularly known as pimenteria da terra , was isolated the diterpene ent-7-α-acetoxytrachyloban-18-oic acid (trachylobane-360) from which it was made a structural modification in which the acetoxy group was substituted by hydroxy generating the ent-7a-hidroxitrachyloban-18-oic acid (trachylobane-318). How there are some reports that show spasmolytic activity of some diterpenes, we aimed to investigate this activity on male rat aorta, rat uterus, guinea-pig trachea and ileum. On rat aorta and rat uterus nor trachylobane-360 or its derivative trachylobane-318 promoted significant spasmolytic effect until the concentration of 10-4 M. However on guinea-pig trachea, only the derivative relaxed this organ pre-contracted with carbachol (CCh) in the presence (EC50 = 3.3 0.9 ± 0.4 x 10-5 M) and absence (EC50 = 3.5 ± x 10-5 M) of functional epithelium, in a equipotent manner, suggesting a possible direct effect on tracheal smooth muscle and that the structural modification was essential for the relaxant effect in this organ. On the other hand, on guinea pig ileum, both diterpenes inhibited the phasic contractions induced by CCh or histamine. When the ileum was pre-contracted with KCl, CCh or histamine, the diterpenes induced relaxation and this effect is not by competitive antagonism of histamine, which was confirmed by the shifted of the cumulative curves to histamine to the right, in a non-parallel manner with reduction of the maximal effect (Emax). How the tonic component of contraction induced by KCl, CCh or histamine is maintained mainly by the opening of CaV, we hypothesized that the trachylobanes could be acting on these channels. The hypothesis was confirmed with the observation that both diterpenes antagonized the CaCl2-induced contractions in depolarizing Ca2+-free solution also relaxed the ileum pre-contracted by S-(-) Bay K 8644, an Cav1 agonist (EC50 = 3.5 ± 0.7 x 10-5 e 5.5 ± 0.3 x 10-5 M, respectively) confirming that the Cav subtype involved is the L-type (Cav1.2). To investigate the involvement of K+ channels to the effect of diterpenes as observed that the relaxation curves of trachylobane-360 (EC50 = 0.5 ± 0.04 x 10-4 M) and trachylobane-318 (EC50 = 2.0 ± 0.5 x 10-5 M) were significantly shifted to the right in the presence of 5 mM TEA+, a non-selective channel blocker for K+, suggesting involvement of these channels in the effects of diterpenes. The effect of trachylobane-360 appears to involve the subtypes of K+ channels (KATP, SKCa, Kv and BKCa,) since the CE50 have not changed in the presence of blockers of these channels. Interestingly the effect of trachylobane-318 appears to involve the activation of the channel type KATP, Kv and SKCa but not BKCa, evidenced by shifts from the relaxation curves to the right in the presence of K+ channels blockers as glibenclamide, apamin and 4-AP, respectively. These results all together suggest that the structural change was essential for these differentiated effects, but not for the involvement of the cyclic nucleotides pathway, since that in the presence of aminophylline the relaxation curves of trachylobanes were not modified. Both diterpenes reduce the intensity of fluorescence on intestinal myocytes of guinea-pig ileum stimulated by histamine which reflect reduction of [Ca2+]c, what would explain the spasmolytic effects of these diterpenes in functional level. / Das cascas do caule da Xylopia langsdorfiana A. St.-Hil. & Tul. (Annonaceae), conhecida popularmente como pimenteira da terra foi isolado o diterpeno ácido ent-7a-acetoxitraquiloban-18-óico (traquilobano-360) que sofreu uma modificação estrutural do grupo acetoxi pelo hidroxi gerando o ácido ent-7a-hidroxitraquiloban-18-óico (traquilobano-318). O objetivo deste trabalho foi realizar um estudo comparativo de uma possível atividade espasmolítica dos diterpenos em aorta de rato, útero de rata, traquéia e íleo de cobaia. Foram realizadas medidas de contrações isotônicas e isométricas e do cálcio citosólico. Em aorta de rato e útero de rata nenhum dos diterpenos promoveu efeito espasmolítico significante até a concentração de 10-4 M. Já em traquéia de cobaia, apenas o traquilobano-318 relaxou este órgão pré-contraído com carbacol (CCh) na presença e na ausência de epitélio funcional, de maneira equipotente, sugerindo um possível efeito direto no músculo liso traqueal e que a modificação estrutural foi essencial para o efeito relaxante neste órgão. Por outro lado, em íleo de cobaia, ambos os diterpenos inibiram as contrações fásicas induzidas por CCh ou por histamina. No íleo pré-contraído com KCl, CCh ou histamina os diterpenos induziram relaxamento e este efeito não se dá por antagonismo competitivo dos receptores histaminérgicos, o que foi confirmado pelo desvio das curvas cumulativas induzidas pela histamina para a direita com redução dos Emax. Como o componente tônico da contração induzida por KCl, CCh ou histamina é mantido principalmente pela abertura dos CaV, hipotetizou-se que os traquilobanos poderiam estar agindo sobre estes canais. Hipótese confirmada com a observação de que ambos diterpenos antagonizaram as contrações induzidas por CaCl2 em meio despolarizante sem Ca2+ além de relaxarem o íleo pré-contraído por S-(-) Bay K 8644, agonista dos Cav1 (CE50 = 3,5 ± 0,7 x 10-5 e 5,5 ± 0,3 x 10-5 M, respectivamente) confirmando assim que o subtipo de Cav envolvido é o Cav1.2. Para investigar a participação dos canais para K+ no efeito dos diterpenos, observou-se que as curvas de relaxamento do traquilobano-360 (CE50 = 0,5 ± 0,04 x 10 -4 M) e do traquilobano-318 (CE50 = 2,0 ± 0,5 x 10-5 M) foram significantemente desviadas para a direita na presença de 5 mM de TEA+, bloqueador não seletivo dos canais para K+, sugerindo a participação destes canais no efeito dos diterpenos. O efeito do traquilobano-360 parece não envolver os subtipos de canais para K+ (KATP, SKCa, Kv e BKCa,) uma vez que o relaxamento não foi alterado na presença dos bloqueadores destes canais. Entretanto, o efeito do traquilobano-318 parece envolver a ativação dos canais do tipo KATP, SKCa e Kv mas não dos BKCa, fato este evidenciado pelos desvios da curva de relaxamento para direita na presença dos bloqueadores de canais para K+ como glibenclamida, apamina e 4-AP, respectivamente. Estes resultados sugerem que a modificação estrutural foi essencial para esses efeitos diferenciados, mas não para o envolvimento da via dos nucleotídios cíclicos, uma vez que na presença da aminofilina as curvas de relaxamento dos traquilobanos não foram alteradas. Os dois diterpenos reduziram a intensidade de fluorescência em miócitos intestinais de íleo de cobaia estimulados por histamina em conseqüência da redução da [Ca2+]c, o que explica os efeitos espasmolíticos destes diterpenos em nível funcional.

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:00:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1953353 bytes, checksum: 1474e81c59d80eee12bba062027ce9d3 (MD5) Previous issue date: 2010-03-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / From the stem bark of Xylopia langsdorfiana A. St.-Hil. & Tul. (Annonaceae), popularly known as pimenteria da terra , was isolated the diterpene ent-7-α-acetoxytrachyloban-18-oic acid (trachylobane-360) from which it was made a structural modification in which the acetoxy group was substituted by hydroxy generating the ent-7a-hidroxitrachyloban-18-oic acid (trachylobane-318). How there are some reports that show spasmolytic activity of some diterpenes, we aimed to investigate this activity on male rat aorta, rat uterus, guinea-pig trachea and ileum. On rat aorta and rat uterus nor trachylobane-360 or its derivative trachylobane-318 promoted significant spasmolytic effect until the concentration of 10-4 M. However on guinea-pig trachea, only the derivative relaxed this organ pre-contracted with carbachol (CCh) in the presence (EC50 = 3.3 0.9 ± 0.4 x 10-5 M) and absence (EC50 = 3.5 x 10-5 M) of functional epithelium, in a equipotent manner, suggesting a possible direct effect on tracheal smooth muscle and that the structural modification was essential for the relaxant effect in this organ. On the other hand, on guinea pig ileum, both diterpenes inhibited the phasic contractions induced by CCh or histamine. When the ileum was pre-contracted with KCl, CCh or histamine, the diterpenes induced relaxation and this effect is not by competitive antagonism of histamine, which was confirmed by the shifted of the cumulative curves to histamine to the right, in a non-parallel manner with reduction of the maximal effect (Emax). How the tonic component of contraction induced by KCl, CCh or histamine is maintained mainly by the opening of CaV, we hypothesized that the trachylobanes could be acting on these channels. The hypothesis was confirmed with the observation that both diterpenes antagonized the CaCl2-induced contractions in depolarizing Ca2+-free solution also relaxed the ileum pre-contracted by S-(-) Bay K 8644, an Cav1 agonist (EC50 = 3.5 ± 0.7 x 10-5 e 5.5 ± 0.3 x 10-5 M, respectively) confirming that the Cav subtype involved is the L-type (Cav1.2). To investigate the involvement of K+ channels to the effect of diterpenes as observed that the relaxation curves of trachylobane-360 (EC50 = 0.5 ± 0.04 x 10-4 M) and trachylobane-318 (EC50 = 2.0 ± 0.5 x 10-5 M) were significantly shifted to the right in the presence of 5 mM TEA+, a non-selective channel blocker for K+, suggesting involvement of these channels in the effects of diterpenes. The effect of trachylobane-360 appears to involve the subtypes of K+ channels (KATP, SKCa, Kv and BKCa,) since the CE50 have not changed in the presence of blockers of these channels. Interestingly the effect of trachylobane-318 appears to involve the activation of the channel type KATP, Kv and SKCa but not BKCa, evidenced by shifts from the relaxation curves to the right in the presence of K+ channels blockers as glibenclamide, apamin and 4-AP, respectively. These results all together suggest that the structural change was essential for these differentiated effects, but not for the involvement of the cyclic nucleotides pathway, since that in the presence of aminophylline the relaxation curves of trachylobanes were not modified. Both diterpenes reduce the intensity of fluorescence on intestinal myocytes of guinea-pig ileum stimulated by histamine which reflect reduction of [Ca2+]c, what would explain the spasmolytic effects of these diterpenes in functional level. / Das cascas do caule da Xylopia langsdorfiana A. St.-Hil. & Tul. (Annonaceae), conhecida popularmente como pimenteira da terra foi isolado o diterpeno ácido ent-7-acetoxitraquiloban-18-óico (traquilobano-360) que sofreu uma modificação estrutural do grupo acetoxi pelo hidroxi gerando o ácido ent-7a-hidroxitraquiloban-18-óico (traquilobano-318). O objetivo deste trabalho foi realizar um estudo comparativo de uma possível atividade espasmolítica dos diterpenos em aorta de rato, útero de rata, traquéia e íleo de cobaia. Foram realizadas medidas de contrações isotônicas e isométricas e do cálcio citosólico. Em aorta de rato e útero de rata nenhum dos diterpenos promoveu efeito espasmolítico significante até a concentração de 10-4 M. Já em traquéia de cobaia, apenas o traquilobano-318 relaxou este órgão pré-contraído com carbacol (CCh) na presença e na ausência de epitélio funcional, de maneira equipotente, sugerindo um possível efeito direto no músculo liso traqueal e que a modificação estrutural foi essencial para o efeito relaxante neste órgão. Por outro lado, em íleo de cobaia, ambos os diterpenos inibiram as contrações fásicas induzidas por CCh ou por histamina. No íleo pré-contraído com KCl, CCh ou histamina os diterpenos induziram relaxamento e este efeito não se dá por antagonismo competitivo dos receptores histaminérgicos, o que foi confirmado pelo desvio das curvas cumulativas induzidas pela histamina para a direita com redução dos Emax. Como o componente tônico da contração induzida por KCl, CCh ou histamina é mantido principalmente pela abertura dos CaV, hipotetizou-se que os traquilobanos poderiam estar agindo sobre estes canais. Hipótese confirmada com a observação de que ambos diterpenos antagonizaram as contrações induzidas por CaCl2 em meio despolarizante sem Ca2+ além de relaxarem o íleo pré-contraído por S-(-) Bay K 8644, agonista dos Cav1 (CE50 = 3,5 ± 0,7 x 10-5 e 5,5 ± 0,3 x 10-5 M, respectivamente) confirmando assim que o subtipo de Cav envolvido é o Cav1.2. Para investigar a participação dos canais para K+ no efeito dos diterpenos, observou-se que as curvas de relaxamento do traquilobano-360 (CE50 = 0,5 ± 0,04 x 10 -4 M) e do traquilobano-318 (CE50 = 2,0 ± 0,5 x 10-5 M) foram significantemente desviadas para a direita na presença de 5 mM de TEA+, bloqueador não seletivo dos canais para K+, sugerindo a participação destes canais no efeito dos diterpenos. O efeito do traquilobano-360 parece não envolver os subtipos de canais para K+ (KATP, SKCa, Kv e BKCa,) uma vez que o relaxamento não foi alterado na presença dos bloqueadores destes canais. Entretanto, o efeito do traquilobano-318 parece envolver a ativação dos canais do tipo KATP, SKCa e Kv mas não dos BKCa, fato este evidenciado pelos desvios da curva de relaxamento para direita na presença dos bloqueadores de canais para K+ como glibenclamida, apamina e 4-AP, respectivamente. Estes resultados sugerem que a modificação estrutural foi essencial para esses efeitos diferenciados, mas não para o envolvimento da via dos nucleotídios cíclicos, uma vez que na presença da aminofilina as curvas de relaxamento dos traquilobanos não foram alteradas. Os dois diterpenos reduziram a intensidade de fluorescência em miócitos intestinais de íleo de cobaia estimulados por histamina em conseqüência da redução da [Ca2+]c, o que explica os efeitos espasmolíticos destes diterpenos em nível funcional.

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On guinea-pig ileum, SA-EtOH extract inhibited the cumulative concentration-response curves to carbachol (CCh) and histamine, and these were shifted to the right, in a non-parallel manner, with depression of the maximal effect (Emax), suggesting a noncompetitive antagonism. SA-EtOH extract relaxed in a significant and concentration dependent manner the ileum pre-contracted with 40 mM KCl (EC50 = 17.4 ± 3.5 μg/mL), 10-6 M CCh (EC50 = 119.4 ± 24.3 μg/mL) or 10-6 M histamine (EC50 = 18.7 ± 4.6 μg/mL), suggesting that SA-EtOH extract could be acting on voltage-gated Ca2+ channels (Cav). This assumption was confirmed by observation that SA-EtOH extract antagonized the CaCl2 induced contractions in the depolarizing medium without Ca2+. The finding that SA-EtOH extract relaxed (EC50 = 187.2 ± 27.3 μg/mL) the guinea-pig ileum pre-contracted with S-(-)-BAY K8644 suggests that the Ca2+ channel subtype involved is the CaV1. As the SA-EtOH extract was more potent in relaxing the body pre-contracted with KCl than by S-(-)-Bay K8644, it is suggestive of indirect blockade of the Cav1. We decided to investigate the participation of K+ channels in the spasmolytic action of SA-EtOH extract. The relaxation curve induced by SA-EtOH extract was rightward displacement only in the presence of tetraethylammonium (TEA+) 1 mM, this concentration is a selective blocker of the large conductance clacium-activated K+ channels (BKca) (EC50 = 37.7 ± 4.9 μg/mL) and 4-aminopyridine, selective blocker of the voltage activated K+ channels (Kv) (EC50 = 48.9 ± 6.2 μg/mL). On rat uterus, SA-EtOH extract inhibited the cumulative concentration-response curves to oxytocin, and these were shifted to the right, in a non-parallel manner, with depression of the maximal effect (Emax) suggesting a noncompetitive antagonism. SA-EtOH extract did not effective at relax the uterus pre-contracted with 60 mM KCl (Emax = 10.5 ± 5.0%), however relaxed in a significant and concentration dependent manner the rat uterus pre-contracted with 10-2 UI/mL (EC50 = 56.3 ± 8.2 μg/mL). Therefore, suggesting that SA-EtOH extract could be promoting its spasmolytic effect of indirect blockade influx Ca2+ by Cav, as observed in guinea-pig ileum. However, the relaxation curve induced by SA-EtOH extract was rightward displacement only in the presence of glibenclamide (EC50 = 124.8 ± 21.0 μg/mL), selective blocker of the ATP-sensitive K+ channels (KATP), different from that observed in guinea-pig ileum. These results suggest that SA-EtOH extract is not promoting the membrane injury on rat erythrocytes and that the spasmolytic action mechanism of SA-EtOH extract involves modulation/activation of BKCa and KV on guinea-pig ileum, and of KATP on rat uterus. / Solanum agrarium Sendtner é conhecida popularmente por babá , gogóia e melancia da praia . O decocto da raiz é empregado popularmente como abortivo (AGRA, 1991). Em estudos anteriores, Santos et al., (2003) demonstraram que o extrato etanólico bruto obtido das partes aéreas de S. agrarium (SA-EtOH) apresentou atividade espasmolítica não seletiva em íleo de cobaia e útero de rata. O objetivo desse estudo foi avaliar o potencial citotóxico do extrato SA-EtOH em eritrócitos de rato e investigar o mecanismo de ação espasmolítica em íleo de cobaia e útero de rata. O extrato SA-EtOH apresentou uma atividade hemolítica moderada apenas nas concentrações de 243 e 500 μg/mL (Emax = 21,2 ± 3,2%). Em íleo de cobaia, o extrato SA-EtOH inibiu as curvas cumulativas ao carbacol (CCh) e à histamina e estas foram desviadas para a direita de maneira não paralela com redução do Emax, sugerindo um antagonismo não competitivo. O extrato SA-EtOH relaxou de maneira dependente de concentração e significante o íleo de cobaia pré-contraído com 40 mM de KCl (CE50 = 17,4 ± 3,5 μg/mL), ou com 10 6 M de CCh (CE50 = 119,4 ± 24,3 μg/mL) ou de histamina (CE50 = 18,7 ± 4,6 μg/mL), sugerindo que o extrato SA-EtOH deve estar agindo bloqueando os canais de Ca2+ dependentes de voltagem (CaV). A confirmação desta hipótese veio com a observação de que o extrato SA-EtOH antagonizou as contrações induzidas por CaCl2 em meio despolarizante nominalmente sem Ca2+. O fato do extrato SA-EtOH ter relaxado (CE50 = 187,2 ± 27,3 μg/mL) o íleo pré-contraído com S-(-)-BAY K 8644 sugere que o canal de Ca2+ envolvido é o tipo CaV1. Como a potência relaxante do extrato SA-EtOH foi maior quando o órgão foi pré-contraído com KCl do que pelo S-(-)-Bay K8644, isto é sugestivo de que há um bloqueio indireto dos Cav1. Decidiu-se investigar a participação dos canais de K+ na ação espasmolítica do SA-EtOH. A curva de relaxamento induzida pelo extrato SA-EtOH foi desviada para direita apenas na presença de tetraetilamônio (TEA+) 1 mM, nessa concentração um bloqueador dos canais de K+ ativados por Ca2+ de grande condutância (BKCa) (CE50 = 37,7 ± 4,9 μg/mL) e na de 4-aminopiridina, bloqueador dos canais de K+ operados por voltagem (KV) (CE50 = 48,9 ± 6,2 μg/mL). Em útero de rata, o extrato SA-EtOH inibiu as curvas cumulativas à ocitocina e esta foi desviada para a direita de maneira não paralela com redução do Emax, sugerindo um antagonismo não competitivo. O extrato SA-EtOH não foi eficaz em relaxar o útero pré-contraído com 60 mM de KCl (Emax = 10,5 ± 5,0%), entretanto relaxou de maneira dependente de concentração o útero pré-contraído com 10-2 UI/mL ocitocina (CE50 = 56,3 ± 8,2 μg/mL). Diante deste fato, pode-se sugerir que o extrato SA-EtOH pode estar promovendo seu efeito espasmolítico pelo bloqueio indireto do influxo de Ca2+ através dos CaV, assim como o observado em íleo de cobaia. Entretanto, a curva de relaxamento induzida pelo extrato SA-EtOH foi desviada para direita apenas na presença de glibenclamida (CE50 = 124,8 ± 21,0 μg/mL), bloqueador seletivo dos canais de K+ sensíveis ao ATP (KATP), diferente do observado em íleo de cobaia. Esses resultados são sugestivos de que o extrato SA-EtOH não esteja promovendo injúrias a membrana dos eritrócitos de ratos e que o mecanismo de ação espasmolítica do extrato SA-EtOH se dá pela modulação/ativação dos BKCa e KV em íleo de cobaia e pelos KATP em útero de rata.