Abstract Background and aims: Stage and grade are the most widely used prognostic parameters for renal cell carcinoma (RCC). The clinical course of this disease is not, however, always predictable by traditional prognostic factors. In the era of new molecular targeted therapies a more accurate prognostication of RCC patient survival is important for the individualization of treatment and follow-up of patients. Despite exhaustive research there are still no prognostic biomarkers for RCC in clinical practice. In order to find novel prognostic tissue markers for RCC, we examined the expression of 14 biomarkers involved in carcinogenesis and clarified their prognostic significance in RCC. Material and methods: Out of 189 consecutive patients who underwent surgery for kidney cancer at Oulu University Hospital in the 1990s, 152 patients with histologically verified RCC were included in this study. The stage distribution was 70 (46%), 12 (8%), 51 (34%) and 19 (12%) patients with stages I-IV, respectively. The majority of the tumours (83 tumours, 55%) were nuclear grade II and 5 (3%), 40 (27%) and 22 (15%) of the tumours were grades I, III and IV, respectively. Clinical and follow-up data were obtained from patient records, the Finnish Cancer Registry and on demand from the Population Register Centre of Finland. The biomarkers studied included markers of the oxidative and neuroendocrine systems as well as proteins related to cell adhesion and migration, invasion, metastasis, inflammation and immune responses. The expression of various biomarkers was characterized via immunohistochemical tests of archival tumour material. The staining intensity was compared to clinicopathological parameters and patient RCC-specific survival. Results: The 5-year RCC-specific survival was 77%. The expression of Toll-like receptor 9 (TLR9) was an independent marker of favourable RCC-specific survival whereas cytoplasmic myosin VI expression was found to be an independent prognostic factor of poor RCC-specific survival. Cell culture experiments showed how cyclooxygenase-2 (COX-2) expression is regulated by HuR in RCC. HuR and COX-2 immunoexpression were also related to decreased RCC-specific survival. Immunostaining of Keap1 was associated with advanced RCC and a marker of a poorer RCC-specific prognosis. The expression of different neuroendocrine markers was evaluated but we could not establish any prognostic value for them. Conclusions: In particular, TLR9, HuR and myosin VI can be regarded as promising novel prognostic biomarkers in RCC. Stage, however, is the most important single prognostic factor for RCC. / Tiivistelmä Munuaissyöpä on vuosikymmenten ajan jatkuvasti yleistynyt. Vaikka se diagnosoidaan nykyisin useimmiten sattumalöydöksenä vatsan alueen kuvantamistutkimuksissa ja hoitomenetelmät ovat viime vuosikymmenten aikana kehittyneet, munuaissyöpäkuolleisuus ei ole laskenut. Munuaissyövän ennusteen määrittäminen voi olla haasteellista. Perinteiset ennustetekijät, levinneisyys ja erilaistumisaste, eivät riitä selittämään kaikkien potilaiden taudinkulkua, eikä munuaissyövälle vielä ole kliinisessä käytössä ennusteellista merkkiainetta. Munuaissyöpähoitojen kehittyessä taudinkulun ennustaminen on yhä tärkeämpää, jotta potilaiden hoito ja seuranta voidaan yksilöidä. Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena oli etsiä uusia ennusteellisia kudosmerkkiaineita munuaissyöpäkasvaimille. Väitöskirjatutkimus perustuu 1990-luvulla Oulun yliopistollisessa sairaalassa leikatun 152 munuaissyöpäpotilaan aineistoon. Lähes puolet aineiston kasvaimista edusti levinneisyysluokkaa I, ja yli puolet munuaissyöpäkasvaimista oli hyvin erilaistuneita (tumagradus I ja II). Tutkimuspotilaista kerättiin kattavat seurantatiedot. Leikkauksessa poistettujen munuaissyöpäkasvainten arkistomateriaalista tutkittiin eri merkkiaineiden ilmenemistä. Tutkitut merkkiaineet käsittivät oksidatiivisen ja neuroendokriinisen järjestelmän merkkiaineita sekä valkuaisaineita, jotka liittyvät keskeisiin syövän ominaisuuksiin, kuten solujen välisiin liitoksiin ja solujen liikkumiseen sekä etäpesäkkeiden syntymiseen. Lisäksi tutkittiin merkkiaineita, jotka liittyvät tulehdusreaktioihin ja immuunipuolustukseen. Väitöskirjatutkimus paljasti useita uusia kudosmerkkiaineita, joiden ilmeneminen munuaissyöpäkasvaimessa on yhteydessä potilaan ennusteeseen. Näistä merkittävimpiä ovat myosiini VI, joka liittyy syöpäkasvainten metastasointiin, sekä immuunipuolustuksessa vaikuttava Tollin kaltainen reseptori 9 (Toll-like receptor 9, TLR9). Molemmat merkkiaineet osoittautuivat itsenäisiksi ennustetekijöiksi munuaissyövässä. Muita ennusteeseen vaikuttavia merkkiaineita ovat tutkimuksen mukaan oksidatiivista stressiä aistiva Keap1 sekä immunologisiin reaktioihin liittyvä syklo-oksigenaasi 2 (COX-2) ja sen ilmenemistä säätelevä HuR.

Abstract Mediators of epithelial permeability, angiogenesis and invasion may serve as prognostic indicators and targets for therapies in esophageal cancer (EC). The expressions of claudins, hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α), vascular endothelial growth factor-A (VEGF), nitric oxide synthases (iNOS, eNOS, nNOS) and toll-like receptor 9 (TLR9) were evaluated by immunohistochemistry in EC. The results were compared with clinicopathological variables, tumor proliferation and apoptosis. All of the claudins were expressed in most of the cancers. Esophageal adenocarcinomas (EAC) displayed more often increased claudin 3 and 5 expression than esophageal squamous cell carcinomas (ESCC). Loss of claudin 3 expression associated with distant metastases in EC and a tendency in this direction was also observed for claudin 4. Cancers with stronger claudin 4 expression showed increased apoptosis in both EAC and ESCC. HIF-1α was present in most of the ECs and like iNOS more often in ESCC than in EAC. Strong HIF-1α expression tended to associate with positive VEGF immunostaining. In ESCC, both strong HIF-1α expression and VEGF positivity tended to associate with increased microvessel density (MVD). In EAC, tumors showing VEGF positivity associated with increased MVD outside the tumor. Patients with strong HIF-1α expression had more often distant metastases than other patients in EC. There was no VEGF expression in normal esophageal mucosa and T3-4 tumors tended to be more often VEGF positive than T1-2 tumors. The expression of TLR9 was more intensive in dysplasia than in normal epithelium and ESCC and abundant TLR9 expression could serve as a marker of squamous cell high grade dysplasia. Intensive TLR9 expression was associated with higher grade tumors and the presence of nodal and distant metastases in ESCC. EC and its progression may be related to increased angiogenesis regulated by VEGF and HIF-1α. In EC, claudin expression varies along with the histology of the tumor. Claudin expression may be associated with apoptosis or proliferation and contribute to tumor behavior. An association was detected between moderate to strong expression of claudin 3 and a high TLR9 histoscore in ESCC. Altered expression of claudin 3 may result to upregulation of endosomal TLR9. TLR9 may serve as a marker for squamous cell dysplasia and ESCC progression. / Tiivistelmä Solukerrosten läpäisevyyttä, verisuonten uudismuodostusta ja kasvainsolujen liikkuvuutta säätelevät tekijät voivat toimia ruokatorvisyövän ennustetekijöinä ja hoidon kohteina. Tässä tutkimuksessa selvitettiin klaudiinien, hypoksia-indusoituvan tekijän 1α (HIF-1α), verisuonen endoteelin kasvutekijän A (VEGF), kolmen typpioksidisyntaasin (iNOS, eNOS ja nNOS) sekä tollin kaltaisen reseptorin 9 (TLR9) ilmentymistä ja merkitystä ruokatorvisyövässä immunohistokemiallisin menetelmin. Tuloksia arvioitiin suhteessa proliferaatioon ja apoptoosiin. Useimmat syöpäkasvaimet ilmensivät jokaista tutkittua klaudiinia. Ruokatorven rauhassyövässä ilmeni levyepiteelisyöpää useammin klaudiineja 3 ja 5. Klaudiinin 3 vähäinen ilmentyminen oli yhteydessä etäpesäkkeiseen tautiin. Sama suuntaus näkyi klaudiinin 4 kohdalla. Apoptoosia todettiin enemmän kasvaimissa, jotka ilmensivät muita enemmän klaudiini 4:ä. Useimmat syöpäkasvaimet ilmensivät HIF-1α:a. Sekä iNOS että HIF-1α ilmentyivät runsaammin levyepiteeli- kuin rauhassyövässä. Tutkimus viittasi yhteyteen voimakkaan HIF-1α:n ilmentymisen ja VEGF:n ilmentymisen välillä. Voimakas HIF-1α:n ilmentyminen ja VEGF:n ilmentyminen vaikuttivat liittyvän ruokatorven levyepiteelisyövän uudissuonituksen lisääntymiseen. Rauhassyövän lisääntynyt uudissuonitus kasvaimen ulkopuolella saattaa liittyä VEGF:n ilmentymiseen. Potilailla, joiden kasvaimissa HIF-1α:n ilmentyminen oli voimakasta, todettiin etäpesäkkeitä muita useammin. VEGF:a ei todettu normaalissa limakalvossa, ja sen ilmentyminen vaikutti olevan yleisempää syvälle kasvavissa kuin pinnallisissa syövissä. TLR9 ilmentyi voimakkaammin levyepiteelin dysplasiassa kuin normaalissa tai kasvainepiteelissä. Huonosti erilaistuvissa ja levinneissä kasvaimissa TLR9 ilmentyi voimakkaammin kuin muissa kasvaimissa. Ruokatorvisyövän synty ja eteneminen voivat liittyä HIF:n ja VEGF:n säätelemään verisuonten uudismuodostukseen. Klaudiinit saattavat vaikuttaa syövän käyttäytymiseen myös apoptoosin ja proliferaation kautta. Tutkimuksessa todettiin yhteys lisääntyneen klaudiinin 3 ilmentymisen ja voimakkaasti ilmentyvän TLR9:n välillä. Muutos klaudiinin 3 ilmentymisessä saattaa lisätä levyepiteelin läpäisevyyttä johtaen TLR9:n aktivoitumiseen. TLR9 voi vaikuttaa ruokatorven levyepiteelin dysplasian ja syövän syntyyn sekä toimia vaikean dysplasian ja aggressiivisen levyepiteelisyövän merkkiaineena.