Existen numerosas evidencias de que la enzima Poli-ADP-ribosa polimerasa-1 (PARP-1) desempeña un importante papel en la modulación de la expresión génica durante el desarrollo y en respuesta a señales celulares específicas, ejerciendo su acción a diferentes niveles. PARP-1 pertenece a una familia de enzimas (PARP) que, usando NAD+ como sustrato, sintetizan y transfieren homopolímeros de ADP-ribosa en residuos de ácido glutámico en proteínas aceptoras principalmente involucradas en la estabilidad de la cromatina y en el metabolismo del DNA. La actividad de PARP-1, responsable de casi el 90% de la poli-ADP-ribosilación en las células, podría modular la expresión génica a través de la poli-ADP ribosilación de otras proteínas o por asociación física con proteínas relevantes como son los factores de transcripción. En este trabajo nos hemos centrado en poner a punto un método cuantitativo de medida de la actividad poli-ADP-ribosa polimerasa en células permeabilizadas utilizando 3H-NAD+ como sustrato. Durante su caracterización, el método ha demostrado tener una buena sensibilidad, precisión, especificidad y exactitud. Una vez optimizado, dicho método se ha empleado en el estudio de las reacciones de poli-ADP-ribosilación mediadas por las enzimas PARP en células del sistema inmune.El estudio de la actividad PARP en timocitos procedentes de ratones deficientes para PARP-1 (Parp-1-/-) y de ratones Parp-2-/- frente a los timocitos procedentes de ratones no modificados genéticamente pone de manifiesto que la actividad de poli-ADP-ribosilación mediada por PARP-2 no sería responsable de la mayor susceptibilidad a apoptosis detectada en los timocitos de los ratones Parp-2-/-, aunque el incremento significativo de la actividad PARP en ausencia de PARP-2 sí que podría, de alguna forma, afectar al fenotipo observado. Dicho incremento de actividad nos sugiere también un efecto de PARP-2 en una posible regulación negativa de la actividad enzimática de PARP-1. Por otra parte los estudios de estimulación de linfocitos T con PMA+ionomicina y anticuerpos anti-CD3 solos y en combinación con anticuerpos anti-CD28, nos han permitido demostrar la activación de PARP en linfocitos T tras la respuesta a estímulos que no producen daño aparente en el DNA.Sin duda alguna, la aplicación de la metodología optimizada en este trabajo puede ser de gran ayuda en el campo de la investigación de las reacciones de poli-ADP-ribosilación y a nivel clínico, si finalmente los ensayos clínicos con inhibidores de PARP en diferentes patologías resultan de utilidad clínica. / Several works report the importance of polyADPribose polymerase-1 in genic expression modulation during development and as an answer of specific cellular signals. PARP-1 is the founder member of a family, the PARP family, that synthesize ADP-ribose homopolymers to modify acceptor proteins related to chromatin stability and DNA metabolism. PARP-1 activity , representing 90% of poly-ADP-ribosilation in cells, could be able to modulate genic expression through ribosilation of other proteins, or by interaction with some other proteins as transcription factors. The aim of this work was the optimization of a quantitative method for measuring PARP activity in permeabilized cells, using NAD+-H-3 as substrate. During the optimization, the method showed good sensibility, accuracy and specificity. Once optimized, we run the method for measurement of PARP activity in inmune cells. The results of PARP activity in thymocytes of Parp-1-/- and Parp-2-/- mice show PARP-2 polyADPribosilation is not the cause of the increased sensibility to apoptosis detected in Parp-2-/- mice, even this increase of PARP activity in ausence of PARP-2 could in some way afect the phenotype observed. Stimulation studies of T lymphocytes with PMA+ionomicine and antibobies anti-CD3 and anti CD-28, demonstrated that PARP activation in T lymphocytes does not damage DNA. The method developed in this work could be very helpful in polyADPribosilation in the field of basic investigation and in a clinical level, if finally clinical trials with PARP inhibitors show clinical application

En el presente trabajo se aborda primeramente el estudio de la modulación farmacológica de la hipersensibilidad retardada, por dos inhibidores de proteinquinasa C (palmitoilcarnitina y trifluoperazina) en dos modelos distintos, uno de contacto inducido por 2,4-dinitro-1-fluorobenceno y otro de tipo tuberculínico inducido por eritrocitos de cordero. Esta parte dio lugar a la publicación del artículo nº 1, "On the activity of trifluoperazine and palmitoylcarnitine in mice: delayed hypersensitivity models" en Life Sciences 66: 183-188 (2000).Tras la selección de dos de los modelos ensayados, se procedió a la evaluación de la actividad en los mismos de varias especies de la familia de las Compuestas. A la vista de los resultados se procedió a la realización de un estudio fitoquímico de la especie Phagnalon rupestre guiado por bioensayo. De éste y tras el empleo de diversas técnicas cromatográficas y análisis espectroscópicos, se aislaron e identificaron de los extractos acetoetílico y butanólico, catorce compuestos fenólicos, seis de los cuales son descritos por nuestro grupo por primera vez en la naturaleza: cuatro prenilhidroquinonas, 2-(3´,3´-dimetilalil)hidreoquinona-1-O-β-glucopiranósido y sus derivados 4´-hidroxilo, 4´´-cafeilo y 2´,3´-dihidro-3´-hidroxilo; un lignano, 7,7´-bis-(4-hidroxi-3,5-dimetoxifenil)-8,8´-dihidroximetil-tetrahidrofuran-4-O-β-glucopiranósido y una acetofenona 9β,12-dihidroxitremetona-12-O-β-glucopiranósido; y los ocho restantes son conocidos: tres flavonoides, luteolina7-O-glucósido, apigenina 7-O-glucósido y luteolina 7-O-glucurónido; la acetofenona piceína; y los ácidos 3,5- y 4,5-dicafeilquínicos, así como los ésteres metílicos de ambos ácidos.Se demostró la actividad antiinflamatoria y antialérgica de Phagnalon rupestre en hipersensibilidad por contacto inducida por dinitrofluorobenceno y determinado como principios responsables de dicha actividad el glucósido de luteolina, las hidroquinonas 4´-hidroxiprenilada y cafeilada, y los derivados ácido 3,5-dicafeilquínico y éster metílico del ácido 4,5-dicafeilquínico.Estos trabajos se detallan en los artículos nº 2, "New prenylhydroquinone glucosides from Phagnalon rupestre" en Journal of Natural Products 64: 1111-1113 (2001), nº 3 " Phagnalon rupestre as a source of compounds active on contact hypersensitivity" en Plata Medica (2002, en prensa) y nº 4 "phenolic glycosides from Phagnalon rupestre" en Phytochemistry 59: 857-860 (2002).Posteriormente se evaluó la actividad antioxidante y antiradicalaria de siete compuestos fenólicos en modelos de peroxidación lipídica, tanto enzimática como no enzimática, captación de la especie radicalaria 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo, así como en la producción de radical superóxido en el sistema hipoxantina/xantina oxidasa. El estudio de la acción de los dos conjugados dicafeil-metilquinatos sobre la enzima xantina oxidasa, nos permitió determinar un potente efecto inhibidor de tipo competitivo y reversible para el éster metílico del ácido 4,5-dicafeilquínico. Este trabajo, "Phenolic methylquinates from Phagnalon rupestre are competitive inhibitors of xanthine oxidase and impair lipid peroxidation", ha sido enviado a Free Radical Research.Finalmente, los mismos compuestos fenólicos fueron ensayados en distintos modelos evaluando diversos parámetros relacionados con la función neutrofílica. Así se estudiaron los siguientes factores: liberación de elastasa, actividad mieloperoxidasa y la producción de leucotrieno B4 y radical superóxido. Se observó que los conjugados dicafeilquínicos redujeron la actividad mieloperoxidasa, inhibieron la liberación de elastasa y de superóxido, resultando la cafeil-hidroquinona inactiva en esta última faceta. Se puede afirmar que la conjugación del ácido cafeico, tanto de la glucosil-hidroquinona como del ácido quínico, es importante para la inhibición de la formación de leucotrieno B4, lo cual otroga a estos compuestos valor como potenciales agentes antiinflamatorios. Este trabajo ha dado lugar al artículo nº 6, "Effects of caffeoyl conjugates of isoprenyl-hydroquinone glucoside and quinic acid on leukocyte function" en Life Sciences (2002, en prensa). / In the first part, the effect of pre- and post-challenge treatments with trifluoperazine and palmitoylcarnitine, two protein kinase C inhibitors, on the inflammation caused by delayed hyperensitivity to dinitrofluorobenzene (DNFB) and sheep red blood cells (SRBC) in mice is reported. The ability of trifluoperazine in inhibiting cutaneous DTH reaction, depending on the treatment schedule and the hapten challenge dose, has been determined.Analysis of the methanolic extract of the aerial parts of Phagnalon rupestre (Asteraceae) had led to the isolation of fourteen phenolic compounds. Six have been identified on the basis of their NMR spectra as new natural compounds: four prenylhydroquinone glucosides 1-O-β-glucopyranosyl-1,4-dihydroxy-2-(3´,3´-dimethylallyl)-benzene, 1-O-β-glucopyranosyl-1,4-dihydroxy-2-(3´-hydroxymethyl-3´-methylallyl)-benzene, 1-O-(4´´-O-caffeoyl)-β-glucopyranosyl-1,4-dihydroxy-2-(3´,3´-dimethylallyl)-benzene and 1-O-β-glucopyranosyl-1,4-dihydroxy-2-(3´-hydroxy-3´-methylbutyl)-benzene; the lignan 7,7´-bis-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-8,8´-dihydroxymethyl-tetrahydrofuran-4-O-β-glucopyranoside; and the acetophenone glucoside 12-O-β-glucopyranosyl-9β,12-dihyroxytremetone. The known flavonoids apigenin 7-O-β-glucopyranoside, luteolin 7-O-β-glucopyranoside, luteolin 7-O-β-glucuronide, the acetophenone picein and 3,5- and 4,5-di-O-caffeoylquinic acid methyl esters and their free carboxyl analogues were also isolated. Eight of them were tested for dinitrofluorobenzene-induced contact hypersensitivity inhibitory activity, being luteolin 7-O-β-glucopyranoside the most active.In order to determine the antioxidant activity of the anti-inflammatory phenolic principles, we studied their effect on lipid peroxidation and superoxide free radical systems. The presence of the caffeoyl moiety is essential for both the antiperoxidative and radical scavenging activities, and the methylation of the quinic carboxyl group enhances the potency on xanthine oxidase inhibitory activity.Finally, the last study undertake the assessment of the "in vitro" activity of the same compounds as above on the neutrophil, a biological system that allows the evaluation of some functions relative to the inflammatory process. The parameters measured were elastase release, myeloperoxidase activity and superoxide and leukotriene B4 production from polymorphonuclear leukocytes.

En esta Tesis se han utilizado diferentes modelos de toxicidad in vitro para estudiar los efectos citotóxicos inducidos por metales. Se han usado cuatro líneas celulares, HaCat, PC12, ES D3 y BALB/3T3, como modelos de dermotoxicidad, neurotoxicidad, embriotoxicidad y carcinogénesis y se han llevado a cabo los siguientes estudios:- HaCata) Determinación de la toxicidad inducida por compuestos de platino ((NH4)2PtCl6, PtCl2, y PtCl4) mediante la medida de la eficiencia en la formación de colonias (CFE). PtCl2 y (NH4)2PtCl6 mostraron un efecto citotóxico mayor que PtCl4 y (NH4)2PtCl4. Las respuestas citotóxicas de los compuestos de platino resultaron dependientes del tiempo de exposición y de la forma química del elemento.b) Estudio del efecto citotóxico inducido por 51 metales a una concentración fija de 100 mM durante 72 horas. Este ensayo permitió clasificar las especies de metales en tres grupos según el grado de la respuesta citotóxica obtenida.- PC12Estudio del efecto citotóxico inducido por 24 metales a una concentración fija de 100 mM durante 24 y 72 horas de exposición y utilizando el MTT como ensayo de citotoxicidad. Los experimentos se llevaron a cabo en células cultivadas en ausencia o presencia de tetraciclina, en modo de favorecer (Tet-on) o impedir (Tet-off) la expresion de la p53. Los metales que afectaron la viabilidad celular fueron Ag, As, Cd, Cr, Pt, Se, y Te.- ES D3Estudio del efecto inducido por metilmercurio en la frecuencia de latido de las células ES. La citotoxicidad del compuesto metálico se evaluó durante la primera fase de diferenciación.- BALB/3T3Estudio del potencial citotóxico y carcinogénico de especies orgánicas e inorgánicas de arsénico. A diferencia de NaAsO2 y Na2HAsO4, las formas orgánicas, arsenobetaina y arsenocolina, no produjeron efectos citotóxicos en las células. Sólo las especies inorgánicas de As dieron resultados positivos en el ensayo morfológico de transformación celular. Estos resultados confirman, por una parte, que los compuestos inórganicos de As son biológicamente más activos que los orgánicos y, por otra, la importancia fundamental de la especiación en la respuesta toxicológica. / The present research concerns the use of in vitro toxicity testing methods for studying the cytotoxic effects of metal compounds induced in four different cell lines such as HaCaT, PC12, ES D3 and BALB/3T3 as models of dermal toxicity, neurotoxicity, embryotoxicity and carcinogenic potential of xenobiotics. The following studies have been carried out:- HaCaTa) Determination of cytoxicity of Pt compounds ((NH4)2PtCl4, (NH4)2PtCl6, PtCl2 and PtCl4) as measured by Colony Forming Efficiency (CFE). PtCl2 and (NH4)2PtCl6 were more cytotoxic compared to PtCl4 and (NH4)2PtCl4. The cytotoxic responses of the four platimun species was dependent of the time of exposure and on the chemical form of the element.b) Screening test of the cytotoxic induced by 100 mM of 51 metal compounds at 72h post-exposure. This allowed a classification of the metal species tested as 3 groups according to the severity of the degree of their cytotoxic response.- PC12Screening test on the cytotoxic response in relation to the exposure to 100 mM of 24 metal compounds for 24h and 72h as determined by MMT test. The study has been carried out on cells that were grown in absence or presence of tetracycline, a technique that makes (Tet-on) or not (Tet-off) possible the expression p53 gene.Metal compounds which affect cell viability are Ag, As, Cd, Cr, Pt, Se and Te.- ES D3Effect of methyl mercury on the beating of ES cells, Cytotoxic effect of the metal compound was observed during the first step of differentiation.- BALB/3T3Inorganic and organoarsenic species have been studied for their cytotoxic and carcinogenic potential. Unlike NaAsO2 and Na2HAsO4 the organoarsenic forms arsenobetaine and arsenocholine failed to induce any significant cytotoxic effect in the cells, the inorganic As species (but not the organic ones) giving positive results in the morphological neoplastic transformation assay. These findings confirm that inorganic As compounds are biologically more active compared to organoarsenic species, and the great importance of the speciation as fundamental factor in determining the toxicological response.

Los productos farmacéuticos son una herramienta esencial en la práctica médica actual, con aplicaciones en el tratamiento y prevención de numerosas patologías humanas. Su utilización se fundamenta sobre el principio básico que han de presentar una relación favorable entre beneficio y riesgo. En este sentido, las posibles ventajas que el paciente pueda obtener de la utilización de un determinado fármaco han de compensar el potencial riesgo de sufrir algún tipo de efecto adverso derivado de su uso.Los ensayos preclínicos de seguridad juegan un papel fundamental en el proceso de valoración de la capacidad de un fármaco para causar efectos adversos. La realización de estos ensayos, que precede y continúa en paralelo a la realización de los ensayos clínicos en humanos, constituye la primera línea de protección frente a la posible inducción de efectos adversos en humanos. La valoración del potencial genotóxico forma parte de este proceso, y es un componente esencial debido a las potenciales consecuencias adversas que para la salud humana se pueden derivar de la exposición a un agente genotóxico, en cuanto a la inducción de efectos hereditarios y cáncer.En esta Tesis Doctoral se presenta una serie de estudios dirigidos a evaluar el potencial genotóxico de un grupo de cuatro fármacos experimentales con afinidad por el receptor σ1, pertenecientes a la clase química de las feniltetrahidropiridinil butilazolinas. Para ello, y de acuerdo con las vigentes normativas reguladoras, los fármacos fueron evaluados mediante la realización de una batería de ensayos in vitro e in vivo de genotoxicidad. Los fármacos experimentales evaluados se identifican como los compuestos A, B, C y E-5842. Se presentan, asimismo, los resultados obtenidos al profundizar en la valoración del potencial genotóxico in vivo del fármaco experimental antipsicótico E-5842, que presentó un resultado positivo en el ensayo in vivo de micronúcleos en eritrocitos de médula ósea de ratón. En estas investigaciones se ha estudiado el posible papel del receptor σ1 en la inducción de condiciones de hipotermia asociadas a incrementos en la formación de micronúcleos en eritrocitos de ratón, así como el posible mecanismo subyacente a la inducción de micronúcleos bajo condiciones de temperatura corporal disminuida.Los resultados obtenidos en los ensayos de genotoxicidad realizados muestran que los fármacos experimentales E-5842, A, B y C carecen de potencial genotóxico, e indican que los ligandos para el receptor σ1 derivados de la feniltetrahidropiridinil butilazolina no parecen presentar, como clase química, riesgo de potencial genotóxico. El receptor σ1 no está implicado en la inducción de condiciones de hipotermia intensa y duradera asociadas a la formación de micronúcleos, lo que descarta la posible existencia de un efecto de clase para este tipo de compuestos en el ensayo de micronúcleos en roedor. Asimismo, nuestros resultados contribuyen al conocimiento sobre los mecanismos subyacentes a la formación de micronúcleos en médula ósea de ratón bajo condiciones de hipotermia, en cuanto que aportan evidencias experimentales que indican que éstos no se producen como consecuencia de una estimulación de la eritropoyesis, y refuerzan la hipótesis de un posible origen aneugénico. / Pharmaceutical compounds are a basic tool in current medical practice, with applications in the treatment and prevention of several human pathologies. Their use is based on the basic principle that they have to show a favourable risk-benefit ratio. To this respect, the possible advantages that the patient could obtain from the use of a given pharmaceutical compound should outweigh the potential risk of suffering any adverse effect from its use.Preclinical safety studies play a major role in the assessment of the potential of a pharmaceutical compound to produce adverse effects. The conduct of these assays, which both precede an run in parallel to the conduct of clinical human assays, represent the first line of defence in front of the possible induction of adverse effects in humans. The assessment of genotoxic potential forms part of this process being a relevant component of it, due to the potential adverse consequences that for human health can be derived from the exposure to a genotoxic agent, in terms of the induction of hereditary effects and cancer.In this Doctoral Thesis we present a series of studies aiming to assess the genotoxic potential of four experimental pharmaceutical compounds with affinity for the σ1 receptor belonging to the phenyltetrahydropyridinyl butylazole chemical class. According to current regulatory requirements, these pharmaceutical compounds were assessed by means of a battery of in vitro and in vivo genotoxicity assays. Tested pharmaceutical compounds were identified as compounds A, B, C and E-5842. We also present the results obtained when further assessing the in vivo genotoxic potential of the experimental antipsychotic compound E-5842, which showed a positive result in the in vivo micronucleus assay in mice bone marrow erythrocytes. In these investigations, the role of the σ1 receptor in the induction of hypothermic conditions associated to increased formation of micronucleated erythrocytes in mice, as well as the possible underlying mechanism to the induction of micronuclei under conditions of decreased body temperature as also assessed.The results obtained in the conducted genotoxicity assays show that the experimental pharmaceutical compounds E-5842, A, B and C lack genotoxic potential, and indicate that phenyltetrahydropyridinyl butylazole derived σ1 receptor ligands do not seem to show, as a chemical class, risk for genotoxic potential. The σ1 receptor is not involved in the induction of marked and long lasting hypothermic conditions associated to formation of micronucleus, ruling out the possible existence of a class effect for this type of compounds in the rodent micronucleus assay. Our results also contribute to the knowledge of the underlying mechanism of micronucleus formation in mice bone marrow under hypothermic conditions, bringing forward experimental evidence showing that they are not formed as consequence of stimulation of erythropoiesis, thus supporting the hypothesis of a possible aneugenic origin.

El arsénico es un contaminante de origen natural, responsable de un importante problema de salud mundial debido a la cantidad de poblaciones expuestas crónicamente al mismo y a la gravedad de los efectos inducidos, incluyendo el incremento de algunos tipos de cáncer. Está ampliamente aceptado su potencial carcinógenico aunque, a diferencia de otros carcinógenos, diversos estudios de genotoxicidad han puesto de manifiesto que el arsénico no es un mutágeno muy potente. Hasta ahora, su mecanismo de acción en el desarrollo del cáncer continúa siendo un misterio, y existe cierta controversia respecto al tipo de daño genotóxico que induce, y el tipo de compuesto arsenical que más influye en su carcinogenicidad. En ausencia de buenos modelos animales para estudiar el mecanismo carcinogénico del arsénico, los estudios in vitro se han convertido en herramientas útiles para dilucidar estos mecanismos. Por lo tanto, con la finalidad de evaluar el potencial genotóxico de seis compuestos de arsénico (arsenito sódico, trióxido de arsénico, MMAV, DMAV, arsenobetaína y cloruro de tetrafenilarsonio), se llevó a cabo inicialmente la puesta a punto del ensayo MLA. Este ensayo se considera como el ensayo in vitro de mutación génica en células de mamífero más sensible y con mayor capacidad de detección de un amplio espectro de mutaciones, tanto puntuales como cromosómicas. De esta manera, se pretendía obtener más información respecto al potencial genotóxico y los mecanismos de acción de distintos compuestos de arsénico. Cuatro de los seis compuestos arsenicales evaluados han presentado efectos genotóxicos, consecuencia de su actividad clastogénica: el arsenito sódico, el trióxido de arsénico, el MMAV y el DMAV. Paradójicamente, en la actualidad el trióxido de arsénico (TOA) se emplea con éxito en el tratamiento de la leucemia promielocítica aguda y existe un especial interés en evaluar su efectividad terapéutica en otros tipos de cáncer. En este contexto, con motivo de estudiar más profundamente el mecanismo de acción de este compuesto, se analizó el espectro mutacional inducido por el TOA empleando los mutantes inducidos en el MLA y técnicas moleculares y citogenéticas. Nuestros resultados revelan que el principal tipo de cambio presente en estos mutantes es la pérdida de heterocigosidad (LOH), pudiendo ser generada tanto por deleción como por recombinación. / Arsenic is an important environmental element causing a world-wide health problem due to large amount of people chronically exposed and the seriousness of its effects, including increase of different types of cancer. Its carcinogenicity is generally accepted, according to epidemiological evidences, and many studies have been carried out to determine its genotoxicity, showing that different from other carcinogens, it is not a potent mutagen. Nevertheless, despite the large amount of literature dealing with both the genotoxic and carcinogenic effects of arsenic, it still remains unclear how arsenic causes cancer (mode of action) and what types of arsenic compounds are most likely associated with carcinogenicity. The lack of appropriate animal models to study arsenic carcinogenicity makes in vitro studies particularly useful tools to figure out its carcinogenic mechanisms. Therefore, we evaluated the genotoxicity potential of six arsenic compounds (sodium arsenite, arsenic trioxide (ATO), MMAV, DMAV, tetraphenylarsenium and arsenobetaine) by the mouse lymphoma assay (MLA), which was optimized in our group. This test is considered the most sensitive and widely applied among the various in vitro mammalian cell gene-mutation assays, and detects a broad spectrum of mutational events, from point mutations to chromosome alterations. This way, we wanted to provide more information about the genotoxic potential and mode of action of several arsenic compounds. Our results show that four of the six arsenic compounds evaluated, sodium arsenite, arsenic trioxide, MMAV and DMAV are genotoxic according to the MLA. Paradoxically, ATO has currently been shown to be effective in inducing complete remission during treatment of patients with acute promyelocytic leukaemia (APL) and it exists a big interest in evaluating its therapeutic effectiveness against other types of cancers. This, together with the open discussion about how arsenic compounds induce genotoxic damage, prompted us to evaluate the mutational spectrum induced by ATO in mouse lymphoma cells. We studied both small and large colonies, using molecular and cytogenetical techniques to clarify the nature of the ATO induced mutations. Our results show that ATO is a strong clastogenic compound mainly inducing loss of heterozygosity (LOH), as a result of deletions and recombinational events.

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Los subproductos de la desinfección del agua de consumo son compuestos químicos que se generan por la reacción entre el desinfecante usado, cloro en la mayoría de los casos, y la materia orgánica e inorgánica presente en el agua a desinfectar. El perfil de estos subproductos es diferente entre las distintas plantas de tratamiento, debido a varios factores involucrados en su formación como son el tipo de desinfectante usado, el desinfectante secundario, el pH, la temperatura y la materia orgánica e inorgánica presente, entre otros factores. Además de la exposición a los SPD mediante el agua de consumo, otra forma de exposición la constituye el uso recreacional del agua de las piscinas. En estas aguas se pueden llegar a encontrarse niveles mayores de SPD, en comparación a los del agua de consumo; este incremento en los niveles de SPD se debe a factores como la recirculación del agua, un mayor tiempo de contacto con el desinfectante y la presencia de precursores orgánicos provenientes de los bañistas.Numerosos estudios epidemiológicos han investigado los efectos adversos que la exposición a estos SPD puede tener en la salud humana, encontrando una posible asociación entre el incremento en el riesgo de cáncer de vejiga y la exposición a estos subproductos.Por lo tanto, con la finalidad de incrementar la información sobre el potencial genotóxico de algunos SPD, se seleccionaron 11 SPD (bromonitrometano, tricloronitrometano, tribromoacetaldehido, hidrato de cloral, ácido mucobrómico, ácido mucoclórico, nitrosodimetilamina, nitrosodietilamina, ácido yodoacético, ácido bromoacético, ácido cloroacético), los cuales se evaluaron en los ensayos del cometa, de micronúcleos y de linfoma de ratón. En función de los resultados obtenidos, la mayoría de los SPD seleccionados pueden ser considerados como genotóxicos (ensayo del cometa), aunque tan sólo uno ha inducido daño clastogénico/aneugénico (ensayo de micronúcleos) y otro se ha mostrado como mutagénico (ensayo de linfoma de ratón).Además, la evaluación del efecto genotóxico del agua de piscina ha corroborado que el proceso de desinfección adicional incrementa su potencial genotóxico, al tiempo que se ha encontrado una posible asociación entre los niveles de ciertos trihalometanos en el aire exhalado de usuarios de piscina y los incrementos en los marcadores de daño genotóxico (frecuencia de micronúcleos). / Disinfection by-products are chemical compounds generated from the reaction of the disinfectant, usually chlorine, with natural organic and inorganic matter present in the source water during the disinfection process. Each water treatment plant has a unique profile of disinfection by-products (DBPs) depending on many factors such as the disinfectant used, secondary disinfectant, pH, temperature, natural organic and inorganic matter content, etc.In addition to the ingestion exposure to DBPs by the consumption of water, the recreational use of swimming pools is another important type of exposure to DBPs. In this water, the levels of DBPs are greater than the ones detect in tap water; this increase in DBPs levels is due to factors like the recirculation of water, the greater time of contact with the disinfectant and the presence of many organic precursors originating from the swimmers.Several epidemiologic studies have investigated the adverse effects of the DBP exposure in the human health, finding a possible association between the increase in the risk of urinary bladder cancer and the exposure of these by-products.Therefore, with the purpose of increasing the information of the genotoxic potential of some DBPs, we selected 11 DBPs (bromonitromethane, trichloronitromethane, tribromoacetaldehyde, chloral hydrate, mucobromic acid, mucochloric acid, nitrosodimethylamine, nitrosodiethylamine, iodoacetic acid, bromoacetic acid, chloroacetic acid) which were evaluated in the comet assay, the micronucleus test and the mouse lymphoma assay. According to our results, almost all of the selected DBPs can be considered as genotoxic agents (comet assay), but only one DBP induced clastogenic/aneugenic damage (micronucleus test) and another DBP was considered as mutagenic (mouse lymphoma assay).The evaluation of the genotoxic effect of swimming pool water has corroborated that the additional disinfection process increased the genotoxic potential of swimming pool water, and also it has been found a possible association between the presence of some trihalomethanes levels in the exhalated air of swimming pools users, and the increase in the biomarkers of genotoxic damage (frequency of micronuclei).

NOTA:- L'arxiu PDF d'aquesta tesi ha estat desconnectat temporalment.- El arxchivo PDF de esta tesis ha sido desconectado temporalmente.La fibromialgia (FM) es un síndrome de dolor crónico pobremente entendido. Diversos investigadores apuntan a una posible relación del curso y cronificación con alta susceptibilidad al estrés; pero falta claridad sobre que variables personales intervienen en la alta susceptibilidad al mismo frente a eventos cotidianos. Se toma como referente la evaluación cognitiva a que hace referencia la teoría transaccional del estrés. El objetivo fue identificar que variables situacionales y psicológicas influyen en la mayor vulnerabilidad al mismo.METODOLOGÍA: Estudio cualitativo con teoría fundamentada, realizado en mujeres con diagnóstico médico de FM según pautas del Colegio Americano de Reumatología. El parámetro para el tamaño muestral fue la saturación de información. Se aplica un cuestionario sociodemográfico y clínico, tests psicológicos sobre emociones, creencias nivel funcional y calidad de vida (STAXI-2, TCI-R, CTI, FIQ, COOP WONKA)y se realizan entrevistas en profundidad. Como criterio de calidad, para la confiabilidad se utilizo la triangulación de datos con un mínimo del 85% de acuerdos. Para la validez la discusión de expertos, diferentes fuentes de información y la persistencia de los conceptos y relaciones entre las diferentes participantes. El programa informático atlas.ti se utilizó como instrumento de análisis. RESULTADOS Y DISCUSIÓN: Se estudian 10 mujeres entre 30 y 63 años, con diagnóstico de FM. Estas valoraron tener bajo apoyo social relacionado con una alteración de tipo funcional poco reconocida socialmente. Situación que aumenta la susceptibilidad al estrés físico y emocional. Revelan estructura de valores con predominio de tradición y benevolencia. La estructura de valores de este grupo difiere con las personas sanas reportado en otros estudios. Las creencias sobre sí mismas se revelan en la misma dirección de sus valores. Hay una resistencia a modificar esas estructuras cognitivas las que entran en conflicto con las condiciones de limitación física, cognitiva y sociales de la FM. Por eso sus creencias y valores se constituyen en la principal fuente de estrés físico y psicológico. Predominan en su vivencia con la FM las emociones estresantes, las principales son ira, tristeza, miedo, culpa, vergüenza; indicando significados de humillación, perdida, autorreproche, fracaso en su identidad social. La experiencia de estrés es mayor en las más jóvenes por la evaluación de mayores demandas sociales y personales.CONCLUSIONESEs importante trabajar en la flexibilización de las expectativas definidas por la estructura de sus valores y por creencias. La educación a la comunidad, las afectadas y su familia sobre aspectos de la FM y modificar factores del medio social, pueden ser caminos para disminuir la susceptibilidad al estrés y cronificación de la FM. / Fibromyalgia (FM) is a syndrome of chronic pain poorly understood. Several researchers point at a possible relation of the course and origin with high susceptibility to stress; but lack clarity about what personal variable take part in the high susceptibility to it front to daily events. It takes as reference the cognitive assessment, referred to the theory transactional of stress. The aim was to identify social and psychological factors that influence in the vulnerability to stress.METHODOLOGY: Qualitative study with grounded theory, conducted in women diagnosed with medical FM according patterns American College of Rheumatology. The parameter for the sample size was information saturation. Interviews are made in depth and a socio-demographic and clinical questionnaire is applied, evaluate psychological variables, functional level and quality of life (STAXI-2, TCI-R, CTI, COOP WONKA, FIQ). As a criterion for quality was taken into account, for reliability were used triangulation of data with a minimum of 85% of agreements. For the validity: the experts discussion, different sources of information and the persistence of concepts and relationships between the various participants., among others. The computer science program, atlas.ti, was used like analysis instrument. RESULTS AND DISCUSSION: We studied 10 women between 30 and 63 years, diagnosed with FM. They assessed as poor the social support, related to an alteration of functional type, little socially recognized. This situation increases the susceptibility to the physical and emotional stress. They reveal a structure of values with tradition and benevolence predominance. The structure of values of this group differs with healthy individuals reported in other studies. The beliefs on themselves are revealed in the same direction of their values. There is a resistance to change these cognitive structures which enter conflict with the terms of limiting physical, cognitive and social aspects of the FM. For that reason their beliefs and values are constituted in the main source of physical and psychological stress. The stressful emotions predominate in their experience with the FM, of these the main ones are wrath, sadness, fear, blames, shame; indicating meant of humiliation, lost, self-reproach, and failure in their social identity. The stress experience is greater in youngest by the evaluation of greater social and personal demands. CONCLUSIONS:It is important to work in the modification of the expectations defined by the structure of their values and beliefs. The education to the community, affected and its family on aspects of the FM, and modify factors of social environment, can be ways to diminish the susceptibility to chronic stress and worse clinical condition.

S'han realitzat dues revisions sistemàtiques de dos símptomes molt freqüents i ben caracteritzats en l'àrea de Traumatologia i Rehabilitació que són el dolor postoperatori, secundari a cirurgia ortopèdica i/o traumatològica (COT), i l'espasticitat, relacionada amb la malaltia neurològica no progressiva (MNNP).-Revisió sistemàtica del tractament amb analgèsics en el dolor postoperatori per COT:Objectiu: avaluar els fàrmacs analgèsics en el tractament del dolor postoperatori per COTDisseny: revisió sistemàtica d'assaigs clínics (AC) aleatoritzats Font de les dades: PubMed, EMBASE, The Cochrane Library i cerques manualsSelecció dels estudis: AC aleatoritzats d'analgèsics administrats per via oral, intramuscular, cubcutània o rectal, comparats amb altres analgèsics o placebo, en pacients sotmesos a COT. Es van avaluar els dissenys dels estudis, les característiques de la població en estudi, els fàrmacs analgèsics avaluats, les puntuacions de la intensitat del dolor i de la milloria del dolor i els esdeveniments adversos.Resultats: es van incloure 92 AC aleatoritzats (9.596 pacients). Quaranta dos (46%) van ser controlats amb placebo i 50 (54%) eren comparacions directes entre no opiacis, opiacis i/o combinacions d'ambdós. La mitjana d'edat dels pacients (de) va ser de 49 anys (18). En la majoria dels AC l'ulcus gastro-intestinal i les malalties del hepàtiques i renals van ser criteris d'exclusió. Només en 30 AC (33%) el cegament va se doble i es van descriure resultats de les variables d'intensitat i milloria del dolor; 19 d'aquests van ser de dosi única, i el seguiment de l'efecte analgèsic no va ser superior a 12 hores en 23 (77%). En general, només 9 AC (10%) van ser amb cegament doble, van descriure les pèrdues i/o retirades, van realitzar anàlisis per intenció de tractar i van descriure la magnitud de l'efecte.Conclusió: l'evidència dels AC aleatoritzats en el tractament del dolor postoperatori per COT per a la presa de decisions clínicques és inadequada. L'avaluació dels analgèsics en el dolor postoperatori per COT s'ha de basar en variables clínicament rellevants, en pacients representatius i amb períodes d'observació més llargs. A més a més, cal incloure comparacions directes entre el fàrmac d'estudi amb diferents fàrmacs i pautes d'administració. -Revisió sistemàtica dels fàrmacs oral pel tractament de l'espasticitat en pacients amb MNNP:Objectiu: Avaluar l'eficàcia dels fàrmacs orals en el tractament de l'espasticitat en pacients amb MNNPDisseny: revisió sistemàtica d'assaigs clínics (AC) aleatoritzats i amb cegament dobleFont de les dades: PubMed, EMBASE, The Cochrane Library i cerques manualsResultats: es van incloure 12 estudis (469 pacients), 6 en ictus, 3 en lesió medul·lar i 3 en paràlisi cerebral. La tizanidina es va avaluar en 4 AC (276 pacients, 142 exposats), el dantrolè en 4 (103, 93), el baclofèn en 3 (70, 55), el diazepam en 2 (127, 76) i la gabapentina en un (28, tots exposats). La majoria dels AC eren fets amb pocs pacients, durant un curt període de temps i llur qualitat metodològica inadequada. Deu AC van ser controlats amb placebo i només 2 eren comparacions directes entre els fàrmacs. Les variables d'eficàcia avaluades van ser heterogènies. Només 4 articles van descriure la magnitud de l'efecte antiespàstic. La incidència d'esdeveniments adversos (mareig, sedació i debilitat muscular) va ser alta.Conclusió: l'evidència en l'eficàcia dels fàrmacs orals pel tractament de l'espasticitat en la MNNP és dèbil i no inclou l'avaluació de la qualitat de vida dels pacients. En cas de que hi hagi alguna eficàcia, aquesta és marginal. Els esdeveniments adversos van ser freqüents. Calen millors instruments metodològics per a l'avaluació del tractament de l'espasticitat. / Two systematic review have been done about two very usual symptoms treated in the Traumatology and Rehabilitation area. Those symptoms are the postoperative pain after traumatic and orthopaedic surgery (TOS), and the spasticity in patients with non-progressive neurological disease.-Systematic review of analgesic drugs in the treatment of the postoperative pain after TOSObjective: To assess analgesic drugs in the treatment of postoperative pain after TOS.Design: Systematic review of randomised clinical trials (RCTs). Data sources: Electronic PubMed, EMBASE, The Cochrane Library, and hand searches.Study selection: RCTs of analgesics administered by oral, intramuscular, intravenous, subcutaneous or rectal route, compared to other analgesics or placebo, in patients under TOS. Study design, characteristics of the study population, analgesic drugs tested, pain intensity and pain relief scores, and adverse effects were assessed. Results: 92 RCTs (9,596 patients) met our inclusion criteria. Forty-two (46%) were placebo-controlled, and 50 (54%) were direct comparisons between non-opioid, opioid, and/or combinations of both. Patients' mean age (SD) was 49 years (18). In most trials, gastrointestinal ulcer, liver and renal diseases were exclusion criteria. Only 30 trials (33%) were double-blind and reported standardised outcomes of pain intensity and pain relief; 19 of these were single-dose, and follow up of analgesic effects lasted no more than 12 hours in 23 (77%). Globally, only nine trials (10%) were double blind, described dropouts or withdrawals, performed analysis by intention to treat, and reported the effects magnitude. Conclusion: Evidence from RCTs on the treatment of postoperative pain after TOS is inadequate for clinical decision making. Assessment of analgesics in pain after TOS should be based on agreed clinically relevant outcomes, in representative patients, and for longer observation periods. In addition, it should include direct comparisons between candidate drugs or their combinations and between various drug administration schedules.-Systematic review of oral antispastic drugs in the treatment of spasticity in patients with non-progressive neurological disease.Objective: To assess the efficacy of oral drugs in the treatment of spasticity in patients with non-progressive neurological disease (NPND). Design: Systematic review of double-blind randomised controlled trials.Data sources: electronic MEDLINE, PubMed, Cochrane Library and hand searches. Results: Twelve studies (469 patients) were included (6 on stroke, 3 on spinal cord diseases, and 3 on cerebral palsy). Tizanidine was assessed in four trials (276 patients, 142 exposed), dantrolene in four (103, 93), baclofen in three (70, 55), diazepam in two (127, 76), and gabapentin in one (28, all exposed). Most trials were of small size, of short duration and their methodological quality was inadequate. Ten trials were controlled with placebo and only two were direct comparisons between drugs. Efficacy outcome variables were heterogeneous. Only four reports described the magnitude of the anti-spastic effect. The incidence of adverse drug effects (drowsiness, sedation and muscle weakness) was high. Conclusion: Evidence on the efficacy of oral anti-spastic drugs in NPND is weak and does not include evaluation of patients' quality of life. If any, efficacy is marginal. Adverse drug reactions were common. Better methodological instruments are needed for the evaluation of anti-spastic treatment.

Més de 40 milions de persones en tot el món estan infectades pel virus de la immunodeficiència humana (VIH). Cinc milions es van infectar de nou i tres milions van morir pel Síndrome de la Immunodeficiència Adquirida (SIDA) el passat 2005. Des de mitjans de la dècada dels 90 el curs de la infecció pel VIH s'ha vist modificat per l'aparició del Tractament Antiretroviral de Gran Activitat (TARGA). La primera droga antiretroviral contra el VIH-1 va ser AZT, un anàleg de nucleòsid amb acció contra l'enzim transcriptasa inversa (RT) del virus. A més dels fàrmacs NRTIs (inhibidors de la transcriptasa inversa anàlegs de nucleòsid) trobem els NNRTIs (inhibidors de la transcriptasa inversa no anàlegs de nucleòsid) i els inhibidors de la proteasa (IPs). La combinació de dos o més fàrmacs d'aquestes famílies va donar lloc a la teràpia combinada del TARGA. Des de l'aparició del primer fàrmac anti-VIH, s'han anat desenvolupant nous agents capaços d'inhibir diferents etapes del seu cicle de replicació. Els últims fàrmacs en incorporar-se a la clínica han estat els inhibidors de la fusió de les membranes cel·lular i viral, com T-20, el maraviroc, un inhibidor del coreceptor CCR5 i els inhibidors de l’integració. En aquesta lluita per desenvolupar noves dianes d'actuació per inhibir l'infecció per VIH, són molts els grups que basen el seu treball en el desenvolupament de noves molècules amb un bon perfil d'inhibició de la infecció. En aquest treball de tesi doctoral es vol determinar el mecanisme d'acció de nous compostos dissenyats per a inhibir la infecció per VIH en diferents etapes del seu cicle, des de l'entrada del virus a la cèl·lula diana a etapes de transcripció inversa. A més es vol determinar si existeix una relació entre l'estructura de les diferents famílies de compostos analitzats i els seus perfils inhibitoris provats en assajos in vitro i in silico. Amb tots aquests estudis l'objectiu final és poder arribar a definir nous hits o molècules potencialment candidates a ser refinades per a acabar formant part de les noves teràpies contra el VIH en la clínica. Per tal de poder dur a terme tots aquests estudis, primer de tot s'ha posat a punt un cribatge a gran escala de compostos mitjançant l'automatització de part de l'assaig. Un cop determinada l'activitat del compost a testar respecte un virus salvatge, es determina l'activitat d'aquest compost en virus amb mutacions que confereixen resistències a inhibidors ja coneguts emprats en la clínica i es realitzen diferents assajos per determinar-ne el lloc i mecanisme d'acció. Finalment, el conjunt d'anàlisis fetes amb els diferents compostos ens permetrà definir un perfil inhibitori per a cada compost i valorar-ne la seva validesa com a possible futur fàrmac anti-VIH. / Over 40 million people worldwide are infected with human immunodeficiency virus (HIV). Five million people were new infected and three million were killed by the Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) on 2005. Since the mid 90's the course of HIV infection has been modified by the emergence of highly active antiretroviral therapy (HAART). The first antiretroviral drug against HIV-1 was AZT, a nucleoside analogue with action against the reverse transcriptase (RT) enzyme of the virus. In addition to NRTIs drugs (nucleoside reverse transcriptase inhibitors), there are NNRTIs (Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors) and protease inhibitors (PIs). The combination of two or more families of these drugs resulted in the combinated therapy of HAART. Since the appearance of the first anti-HIV drug, have been developing new agents capable of inhibiting various stages of its replication cycle. The latest drugs in joining the clinic were the membrane fusion inhibitors, like T-20, maraviroc, a CCR5 inhibitor and the integration imhibitors. In this struggle to develop new targets for action to inhibit HIV infection, many groups that base their work on the development of new molecules with a good infection inhibition profile. The aim of this doctoral thesis is to determine the mechanism of action of new compounds designed to inhibit HIV infection at different stages of their cycle, since the entry of the virus to target cell to reverse transcription. We also want to determine if there is a relationship between the structure of the different families of compounds analyzed and their tested inhibitory profiles in vitro and in silico. With all these studies the goal is to get hits or molecules to define new potential candidates to be refined to be part of the new HIV therapies in the clinic. In order to perform these studies, first of all we have worked in a large-scale screening of compounds by automating part of the trial. Once determined the anti-HIV activity of the tested compounds against a wild virus, we determine the activity of these compounds against mutant viruses with resistance to known inhibitors used in the clinic to perform various tests to determine the site and mechanism of action of each compound. Finally, the set of tests made with different compounds will allow us to define an inhibitory profile for each compound and assess its validity as a possible future anti-HIV drug.