Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Neospora caninum and Toxoplasma gondii are two obligate intracellular protozoa and can infect a wide variety of hosts, including birds. Domestic chickens can be considered as sentinels of infection, since they have potential exposure to oocysts in the soil, serving as indicators of environmental contamination, also acting as an efficient source of T. gondii infection. In addition, chickens infected with T. gondii oocysts may contain virulent strains of this parasite in different tissues, without any clinical signs. Therefore, the objectives of this study were (1) to determine the presence of anti-T. gondii and anti-N. caninum in domestic chickens raised extensively in rural areas, (2) evaluate the association of risk factors for infection by T. gondii present in properties in one of the study regions (3) isolating of the parasite T. gondii from tissues of chickens antibody positive (4) genotypically characterize the T. gondii from rural area of the municipality of Santa Maria, Rio Grande do Sul State, Brazil. Firstly, in May 2011 were collected 137 blood samples in some farms in the state and were tested by indirect immunofluorescence (IFA) for antibodies anti-T. gondii and anti-N. caninum and were detected in 74.4% (102/137) and 36.5% (50/137) of chickens, respectively. Later in the period from March 2013 to February 2014 were collected 597 blood samples from 74 properties in the rural area of Santa Maria, RS. The samples were tested by IFA, where 49.2% (294/597) were positive for antibodies anti-T. gondii infection, with titers ranging from 16 to 4096. From bioassay of 12 positive tissues chickens were obtained nine isolates of the parasite. Genotypic characterization of isolates was performed by PCR-RFLP, using 12 genetic markers, SAG1, 5'-3'SAG2, alt. SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1, apical. The result of analysis of the genotype of individual of this study revealed the presence of five genotypes according to ToxoDB (# 11, # 55, # 64, # 140 and # 163) plus two new ones, not previously described in literature. The high prevalence of antibodies found in this study suggests a major environmental contamination, and thus a potential risk to human and animal health .From the results in genotypic characterization, it can be observed that there is a wide genetic diversity of T. gondii in the study region, which confirms previous studies in Brazil. / Toxoplasma gondii e Neospora caninum são dois protozoários intracelulares obrigatórios e podem infectar uma grande variedade de hospedeiros, incluindo aves. Galinhas domésticas podem ser consideradas sentinelas da infecção, já que as mesmas têm potencial à exposição aos oocistos presente no solo, servindo como indicadores de contaminação ambiental, atuando também como eficiente fonte de infecção do T. gondii. Além disso, galinhas infectadas com oocistos de T. gondii podem albergar cepas virulentas deste parasito em diferentes tecidos, sem apresentar sinais clínicos. Diante disso, os objetivos deste estudo foram (1) determinar a presença de anticorpos anti-T. gondii e anti-Neospora caninum em galinhas domésticas criadas extensivamente em zona rural, (2) avaliar a associação dos fatores de risco para infecção por T. gondii presentes nas propriedades em uma das regiões de estudo (3) isolar o protozoário T. gondii a partir de tecidos de galinhas anticorpo positivas e (4) caracterizar genotipicamente os isolados de T. gondii de galinhas em área rural do município de Santa Maria, Rio Grande do Sul, Brasil. Primeiramente, em Maio de 2011 foram coletadas 137 amostras de sangue de galinhas em algumas propriedades rurais do estado e foram testadas por Imunofluorescência indireta (RIFI) para anticorpos anti-T. gondii e anti-N. caninum, sendo detectados 74.4% (102/137) e 36.5% (50/137) das galinhas, respetivamente. Posteriormente, no período de março de 2013 a fevereiro 2014 foram coletadas 597 amostras de sangue de galinhas em 74 propriedades da zona rural de Santa Maria, RS.. As amostras foram testadas por RIFI, onde 49,2% (294/597) foram positivas para anticorpos anti-T. gondii, com títulos variando de 16 a 4096. A partir do bioensaio de tecidos de 12 galinhas positivas, obteve-se nove isolados do protozoário. A caracterização genotípica dos isolados foi realizada através da técnica de PCR-RFLP, utilizando os 11 marcadores genéticos, SAG1, 5 -3 SAG2, alt. SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1, Apico. O resultado da análise genotípica dos isolados de galinhas do presente estudo revelou a presença de cinco genótipos de acordo com o ToxoDB (#11, #55, #64, #140 e #163), além de dois outros novos, não descritos anteriormente na literatura. A elevada prevalência de anticorpos encontrada neste estudo, sugere uma grande contaminação ambiental, sendo assim um risco potencial para a saúde humana e animal. A partir dos resultados obtidos na caracterização genotípica, pode-se observar que há uma ampla diversidade genética do T. gondii na região de estudo, o que confirma os estudos já realizados no Brasil.