Introdução. A resistência bacteriana é facilitada pela pressão seletiva do uso de antimicrobianos na clínica e em outras atividades, como a agricultura e pecuária, além de poder ser disseminada para a natureza por meio do lançamento inadequado do esgoto ou pela aplicação do lodo de esgoto na agricultura. As -lactamases de espectro estendido (ESBL) são uma das formas mais prevalentes de resistência em Gram negativos no mundo, e seus genes codificadores são disseminados por meio de diversos elementos genéticos, principalmente transposons e integrons mobilizados para plasmídios. Objetivo. Identificar e caracterizar genes codificadores de ESBL, bem como suas prováveis formas de mobilização, em enterobactérias isoladas de fontes ambientais e clínicas. Material e Métodos. Quarenta e cinco cepas isoladas de um hospital público em 2004 e 2005, responsáveis por infecções hospitalares (14), infecções comunitárias (7) e colonizações (24), e 7 isoladas de estações de tratamento de esgoto (ETE) em 2009, em São Paulo, geneticamente distintas e produtoras de ESBL da família Enterobacteriaceae, foram estudadas. A técnica de PCR seguida de sequenciamento foi utilizada para a identificação dos genes blaESBL, triagem de elementos móveis e mapeamento do ambiente genético de blaESBL. A identificação dos grupos de incompatibilidade plasmidial (Inc) foi realizada pela técnica de PBRT, e a determinação dos tamanhos dos plasmídios pela técnica de S1-PFGE. Resultados. Os genes blaESBL identificados foram: amostras clínicas - blaTEM-15, blaTEM-197, blaSHV-5, blaSHV-12, blaSHV-27, blaSHV-28, blaSHV-45, blaSHV-55, blaSHV-110, blaCTX-M-2, blaCTX-M-59 e blaCTX-M-131; amostras ambientais blaSHV-28, blaCTX-M-15 e blaCTX-M-8. Os genes blaTEM- 15 e blaTEM-197 estavam associados aos elementos Tn2* e Tn3, respectivamente. Os genes blaSHV-5 e blaSHV-12 estavam associados à IS26, e não foi possível determinar o ambiente genético dos demais genes blaSHV. Os genes blaCTX-M-2, blaCTX-M-59 e blaCTXM- 131 estavam inseridos em integrons de classe 1 complexos, blaCTX-M-15 estava associado à ISEcp1 interrompida pela IS26, e blaCTX-M-8 estava associado à IS10, também interrompida pela IS26. Os principais grupos Inc detectados foram IncA/C (37 por cento ) e IncF (30,4 por cento ). Exceto por 7 cepas clínicas, todas apresentavam plasmídios de alto peso molecular, entre 48,5kb e 388kb. Conclusões. Este estudo detectou 15 genes blaESBL diferentes, dos quais dois são genes novos (blaTEM-197 e blaCTX-M-131) e três são inéditos no Brasil (blaTEM-15, blaSHV-55 e blaSHV-110). A maioria das cepas deste estudo possuía genes blaESBL associados a elementos mobilizáveis, bem como continham plasmídios de grupos Inc envolvidos na disseminação da resistência antimicrobiana. Além disso, carreavam plasmídios provavelmente conjugativos. Os resultados deste estudo mostram genes de resistência associados a elementos mobilizáveis em cepas contendo elementos transferíveis. As cepas foram isoladas tanto em uma instituição de saúde como nas ETEs da Grande São Paulo, mostrando o potencial de disseminação da resistência da clínica para o ambiente em nossa região. / Introduction. Bacterial resistance is facilitated by selective pressure of antimicrobial use in clinical and other activities, as agriculture and livestock, and can be spread to nature through the inadequate discharge of sewage or by the use of sludge in agriculture. Extended-spectrum -lactamases (ESBL) are the most prevalente forms of resistance in Gram-negative bacteria in the world, and their encoding genes are disseminated through several genetic elements, especially transposons and integrons mobilized to plasmids. Objective. To identify and characterize ESBL-encoding genes, as well as their probable mobilization pathways, in enterobacteria isolated from clinical and environmental sources. Material and Methods. Forty-five strains isolated from a public hospital in 2004 and 2005, responsible for hospital infections (14), community-acquired infections (7) and colonizations (24), and 7 isolated from sewage treatment plants (ETE) in 2009, in São Paulo, genetically distinct and ESBL producers from Enterobacteriaceae family, were studied. PCR technique followed by sequencing was used for blaESBL genes identification, mobile elements screening and blaESBL genetic environment mapping. Plasmid incompatibility groups (Inc) were identified by PBRT technique, and plasmid sizes were determined by S1-PFGE technique. Results. The blaESBL genes identified were: clinical samples - blaTEM-15, blaTEM-197, blaSHV-5, blaSHV-12, blaSHV-27, blaSHV-28, blaSHV-45, blaSHV-55, blaSHV-110, blaCTX-M-2, blaCTX-M-59 and blaCTX-M-131; environmental samples blaSHV-28, blaCTX-M-15 and blaCTX-M-8. Genes blaTEM-15 and blaTEM-197 were associated to the elements Tn2* and Tn3, respectivelly. Genes blaSHV-5 and blaSHV-12 were associated to IS26, and it was not possible to detect the genetic environment of the other blaSHV genes. Genes blaCTX-M-2, blaCTX-M-59 and blaCTX-M-131 were inserted in complex class 1 integrons, blaCTX-M-15 was associated to ISEcp1 interrupted by IS26, and blaCTX-M-8 was associated to IS10, also interrupted by IS26. The most common Inc grups detected were IncA/C (37 per cent ) and IncF (30,4 per cent ). Except for 7 clinical strains, all isolates showed high molecular weight plasmids, rangng from 48,5kb to 388kb. Conclusions. This study detected 15 different blaESBL genes, from which 2 are new genes (blaTEM-197 e blaCTX-M-131) and 3 are still unpublished in Brazil (blaTEM-15, blaSHV-55 and blaSHV-110). Most of the strains from this study had blaESBL genes associated to mobile elements, as well as they had plasmids from Inc groups involved in the spread of antimicrobial resistance. Moreover, the strains probably carried conjugative plasmids. Results from the present work show resistance genes associated to mobile elements in strains carrying transferable elements. The strains were isolated either from a healthcare institution or from ETEs in São Paulo, which shows the spread potential of resistance from the clinic to the environment in our region.

Orientador: Marcelo Lancellotti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T23:59:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Andrade_AliceTavaresReis_M.pdf: 3292132 bytes, checksum: ee5318f5b87992964c9d97bedc343f00 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Em 1998, foi relatada a transferência lateral do gene sodC do gênero Haemophilus para a espécie Neisseria meningitidis. Sabe-se que, nestes dois grupos a dinâmica deste gene é bastante distinta. Este trabalho tem por objetivo estimar árvores filogenéticas que possam apontar qual a espécie do gênero Haemophilus compartilhou o gene sodC com a espécie N. meningitidis. Testes de seleção positiva foram empregados no intuito de avaliar quais forças evolutivas estão subjacentes ao processo de diversificação molecular do gene nestas espécies ao longo do tempo. Além disso, foi realizada uma modelagem protéica computacional por homogia para avaliar quais substituições de aminoácidos tinham impacto no processo adaptativo da enzima nas espécies consideradas. Ao se reconstruir uma filogenia para o gene sodC, foi constatado que a origem deste gene na espécie H. influenzae é distinta. Um grupo de linhagens recebeu o gene, provavelmente por transferência lateral, da espécie H. haemolyticus, enquanto o outro grupo recebeu o gene da espécie H. parainfluenzae. Neste grupo, o gene sofreu pseudogeneização. Foi observado também que as sequências de N. meningitidis agrupam com as sequências que compartilham um ancestral comum com a espécie H. haemolyticus, porém as sequências do meningococo formam um ramo distinto dentro deste clado. Dada à alta clonalidade das sequências de N. meningitidis, foi constatado que o evento de transferência lateral de genes foi muito recente na escala do tempo. O teste de seleção positiva demonstrou que seleção positiva está atuando especificamente no ramo da árvore que compartilha um ancestral comum com a espécie H. haemolyticus, através da modificação de uma alanina por uma serina na posição 72, embora a nota geral da árvore tenha sido menor que 1. Sabe-se que pseudogenes, por não codificarem uma proteína ativa e, portanto, por não estarem sob nenhum tipo de restrição funcional, estão sob uma ação maior da deriva genética. Portanto, diferentes forças evolutivas estão governando a evolução deste gene nas espécies consideradas. A modelagem protéica concluiu que tal modificação contribuiu para o aumento do potencial redox do sítio ativo. Desta forma, a ação da seleção positiva sob um único resíduo de aminoácido foi benéfica para a função da enzima como um todo / Abstract: In 1998, it was reported the lateral transfer of the sodC gene from the genus Haemophilus to Neisseria meningitidis. It is known that this two groups show a quite distinct dynamics of this gene. This study aims to estimate phylogenetic trees that might point to which species of the genus Haemophilus shared the sodC gene with N. meningitidis. In addition, tests of positive selection were employed in order to assess which evolutionary forces are governing the process of molecular diversification of the gene in these species through time. Moreover, we performed a computational protein modeling by homology to asses which amino acids substitutions had an impact on the adaptative process of the enzyme in the species considered. A phylogeny of the sodC gene was reconstructed and it was found that this gene in H. influenzae has two different origins. A group of lineages has received the gene, probably by lateral transfer, from H. haemolyticus, whereas the other group has received the gene from H. parainfluenzae. In the latter, the gene has become a pseudogene. It was also observed that the sequences from N. meningitides group together with those sequences that share a common ancestor with H. haemolyticus, but they form a distinct branch within this clade. Given the high clonality of the sequences from N. meningitidis, it was found that the lateral gene transfer event is very recent in the time scale. A test of positive selection showed that positive selection is acting specifically in the branch that shares a common ancestor with H. haemolyticus through the substitution of an alanine to a serine at position 72, though the overall score of the tree is less than one. It is known that pseudogenes do not encode active proteins and therefore they are not under any kind of functional constraints, so they are under greater influence of genetic drift. Thus, it was concluded that different forces are driving the evolution of this gene in the species considered here. Protein modeling concluded that this modification contributed to the increase in the redox potencial of the active site. Thus the action of positive selection under a single amino acid residue was beneficial to the function of the enzyme as whole / Mestrado / Bioquimica / Mestra em Biologia Funcional e Molecular