Der Hefepilz Candida albicans ist ein harmloser Kommensale auf den Schleimhäuten des Gastrointestinal- und Urogenitaltrakts der meisten gesunden Menschen. Bei einer Störung der natürlichen Mikroflora oder des Wirtsimmunsystems kann der Pilz jedoch auch oberflächliche und sogar systemische Infektionen verursachen. C. albicans weist eine Reihe von Eigenschaften auf, die zur Virulenz des Erregers beitragen. Dazu gehören die Adhärenz an unterschiedliche Wirtsoberflächen, die morphologische Variabilität des Pilzes und die Sekretion von Aspartatproteasen. Die Expression vieler dieser Virulenzfaktoren wird unter anderem durch die Verfügbarkeit von Stickstoff reguliert. Unter Stickstoffmangelbedingungen wechselt C. albicans vom Wachstum als sprossende Hefe zum filamentösen Wachstum, und dieser Wechsel wird durch die Ammoniumpermease Mep2p reguliert. Wie die Induktion des filamentösen Wachstums durch Mep2p kontrolliert wird, ist jedoch weitgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Mutationsanalyse von Mep2p durchgeführt, um Aminosäuren zu identifizieren, die an der Signalfunktion dieser Permease beteiligt sind. Die C-terminale cytoplasmatische Domäne von Mep2p wird für den Ammoniumtransport nicht benötigt, ist jedoch essentiell für die Signaltransduktion. Progressive C-terminale Verkürzungen von Mep2p zeigten, dass ein MEP2DC433-Allel immer noch in der Lage war, das filamentöse Wachstum zu induzieren, wohingegen die Deletion einer weiteren Aminosäure die Morphogenese blockierte. Das Tyrosin an Position 433 (Y433) ist deshalb die letzte Aminosäure, die für die Signalfunktion von Mep2p essentiell ist. Um besser zu verstehen, wie die Signalaktivität von Mep2p durch die Verfügbarkeit und den Transport von Ammonium reguliert wird, wurden verschiedene hochkonservierte Aminosäuren mutiert, die vermutlich an der Bindung oder dem Transport von Ammonium in die Zelle beteiligt sind. Die Mutation von D180, von dem postuliert wurde, dass es den initialen Kontakt mit extrazellulärem Ammonium ermöglicht, oder der im Transportkanal lokalisierten Histidine H188 und H342 hatte zur Folge, dass Mep2p nicht mehr exprimiert wurde, so dass diese Aminosäuren vermutlich für die Proteinstabilität wichtig sind. Die Mutation von F239, das zusammen mit F126 eine extracytosolische Pforte zur Transportpore bildet, verhinderte trotz korrekter Membranlokalisation sowohl den Ammoniumtransport als auch das filamentöse Wachstum. Allerdings führte auch die Mutation von W167, das vermutlich zusammen mit Y122, F126 und S243 an der Rekrutierung des Ammoniumions an der extrazellulären Seite der Membran beteiligt ist, zur Blockierung des filamentösen Wachstums, obwohl der Ammoniumtransport kaum beeinflusst war. Dies zeigte, dass die intrazelluäre Signaltransduktion durch extrazelluläre Veränderungen in Mep2p beeinflusst werden kann. Die Mutation von Y122 reduzierte die Ammoniumaufnahme weitaus starker als die Mutation von W167, erlaubte jedoch immer noch ein effizientes filamentöses Wachstum. Die Signalaktivität von Mep2p ist deshalb offensichtlich nicht direkt mit der Transportaktivität des Proteins korreliert. Ein wichtiger Aspekt in der Fähigkeit von Mep2p, die Morphogenese zu stimulieren, ist die vergleichsweise starke Expression des Proteins. Um die Regulation der MEP2-Expression aufzuklären, wurden die cis-regulatorischen Sequenzen und die trans-aktivierenden Faktoren, die die MEP2-Induktion unter Stickstoffmangel vermitteln, identifiziert. Eine Promotoranalyse zeigte, dass zwei mutmaßliche Bindungsstellen für GATA-Transkriptionsfaktoren eine zentrale Rolle in der MEP2-Expression haben, da die Deletion oder Mutation dieser GATAA-Sequenzen die Expression von MEP2 stark reduzierte. Um die Rolle der GATA-Transkriptionsfaktoren Gln3p und Gat1p bei der Regulation der MEP2-Expression zu untersuchen, wurden Mutanten hergestellt, in denen die entsprechenden Gene deletiert waren. Die Expression von Mep2p war in gln3D und gat1D Einzelmutanten stark verringert und in gln3D gat1D Doppelmutanten nicht mehr nachweisbar. Die Deletion von GLN3 hatte auch eine starke Reduktion des filamentösen Wachstums zur Folge, die durch die konstitutive Expression von MEP2 unter Kontrolle des ADH1-Promotors aufgehoben wurde. Dagegen hatte die Deletion von GAT1 keinen Einfluss auf das filamentöse Wachstum. Überraschenderweise war das filamentöse Wachstum in den gat1D Mutanten teilweise unabhängig von Mep2p, was darauf hinwies, dass in Abwesenheit von GAT1 andere Signalwege aktiviert werden, die die Morphogenese stimulieren. Diese Ergebnisse zeigten, dass die GATA-Transkriptionsfaktoren Gln3p und Gat1p die Expression der Ammoniumpermease MEP2 kontrollieren und dass Gln3p auch ein wichtiger Regulator des durch Stickstoffmangel induzierten filamentösen Wachstums von C. albicans ist. Mutanten, in denen die beiden GATA-Transkriptionsfaktoren Gln3p und Gat1p fehlten, waren nicht mehr in der Lage, in einem Medium zu wachsen, das bovines Serumalbumin (BSA) als einzige Stickstoffquelle enthält. Die Fähigkeit von C. albicans, Proteine als einzige Stickstoffquelle zum Wachstum zu verwenden, wird durch die sekretierte Aspartatprotease Sap2p, die die Proteine zu Peptiden abbaut, und durch Oligopeptidtransporter, die diese Peptide in die Zelle aufnehmen, vermittelt. Der Wachstumsdefekt der gln3D gat1D Doppelmutanten war hauptsächlich durch einen Defekt in der SAP2-Expression verursacht, da die Expression von SAP2 unter Kontrolle des konstitutiven ADH1-Promotors die Fähigkeit zum Wachstum auf BSA wieder herstellte. Es zeigte sich, dass Gln3p und Gat1p die Expression des Transkriptionsfaktors STP1, der für die Induktion von SAP2 in Gegenwart von Proteinen notwendig ist, regulieren. Bei einer Expression von STP1 unter Kontrolle des induzierbaren Tet-Promotors waren Gln3p und Gat1p nicht mehr notwendig für das Wachstum auf Proteinen. Wenn bevorzugte Stickstoffquellen verfügbar sind, wird SAP2 auch in Gegenwart von Proteinen reprimiert, und diese Stickstoff-Katabolitrepression korrelierte mit einer reduzierten STP1-Expression. Die Expression von STP1 unter Kontrolle des Tet-Promotors hob diese Repression auf, was zeigte, dass die Regulation der STP1-Expression durch die GATA-Transkriptionsfaktoren eine Schlüsselrolle sowohl bei der positiven als auch bei der negativen Kontrolle der SAP2-Expression spielt. Eine regulatorische Kaskade, in der die Expression des spezifischen Transkriptionsfaktors Stp1p durch die allgemeinen Regulatoren Gln3p und Gat1p kontrolliert wird, stellt die Expression von SAP2 in C. albicans deshalb unter Stickstoffkontrolle und gewährleistet eine angepasste Expression dieses Virulenzfaktors. Die Ergebnisse dieser Arbeit illustrieren, dass die GATA-Faktoren Gln3p und Gat1p zum Teil überlappende aber auch spezifische Funktionen in der Anpassung von C. albicans an die Verfügbarkeit verschiedener Stickstoffquellen haben. Diese Anpassungsmechanismen spielen auch eine Rolle in der Pathogenität des Pilzes, wobei die relative Bedeutung von Gln3p und Gat1p vom Zielgen und der Stickstoffquelle abhängt. Diese Erkenntnisse geben einen vertieften Eiblick in die molekularen Grundlagen der Anpassung von C. albicans an unterschiedliche Umweltbedingungen. / The yeast Candida albicans is a member of the normal microflora on the mucosal surfaces of the gastrointestinal and urogenital tract in healthy persons. However, it is an opportunistic pathogen that can cause a range of infections from superficial to disseminated, in response to perturbation of the normal microflora or alterations in the host immunity. C. albicans exhibits a variety of characteristics such as adhesion, morphogenetic switching and secreted aspartic protease production that contribute to its virulence. Expression of many of these virulence factors is controlled by the availability of essential element, nitrogen. C. albicans undergoes morphogenetic transition to form filaments under nitrogen starvation conditions and this switch is controlled by the ammonium permease Mep2p. However, little is known about how this signaling function of Mep2p is regulated. Mutational analysis of Mep2p was carried out to identify the residues that confer signaling activity to this permease. The C-terminal cytoplasmic tail of Mep2p contains a signaling domain that is dispensable for ammonium transport but essential for the signaling activity of Mep2p. In this work, progressive C-terminal truncations analysis demonstrated that a MEP2DC433 allele was still able to induce filamentation while nitrogen starvation-induced filamentous growth was abolished in cells expressing a MEP2DC432 allele. Therefore, tyrosine at position 433 (Y433) is the last amino acid in Mep2p that is essential for signaling. To gain insights into how the signaling activity of Mep2p is regulated by ammonium availability and transport, conserved residues that have been implicated in ammonium binding or uptake were mutated. Mutation of D180, which has been proposed to mediate initial contact with extracellular ammonium, or the pore-lining residues H188 and H342 abolished Mep2p expression, indicating that these residues are important for protein stability. Mutation of F239, which together with F126 is predicted to form an extracytosolic gate to the conductance channel, abolished both ammonium uptake and Mep2p-dependent filamentation, despite proper localization of the protein. On the other hand, mutation of W167, which is assumed to participate along with Y122, F126, and S243 in the recruitment and coordination of the ammonium ion at the extracytosolic side of the cell membrane, also abolished filamentation without having a strong impact on ammonium transport, demonstrating that extracellular alterations in Mep2p can affect intracellular signaling. Mutation of Y122 reduced ammonium uptake much more strongly than mutation of W167 but still allowed efficient filamentation, indicating that the signaling activity of Mep2p is not directly correlated with its transport activity. An important aspect in the ability of Mep2p to stimulate filamentation in response to nitrogen limitation is its high expression levels. The cis-acting sequences and trans-acting regulators that mediate MEP2 induction in response to nitrogen limitation were identified. Promoter analysis revealed that two putative binding sites for GATA transcription factors have a central role in MEP2 expression, as deletion of the region containing these sites or mutation of the GATAA sequences in the full-length MEP2 promoter strongly reduced MEP2 expression. To elucidate the roles of the GATA transcription factors GLN3 and GAT1 in regulating MEP2 expression, mutants lacking one or both of these transcription factors were constructed. Mep2p expression was strongly reduced in gln3D and gat1D single mutants and virtually abolished in gln3D gat1D double mutants. Deletion of GLN3 strongly inhibited filamentous growth under limiting nitrogen conditions, which could be rescued by constitutive expression of MEP2 from the ADH1 promoter. In contrast, inactivation of GAT1 had no effect on filamentation. Surprisingly, filamentation became partially independent of the presence of a functional MEP2 gene in the gat1D mutants, indicating that the loss of GAT1 function results in the activation of other pathways that induce filamentous growth. These findings demonstrated that the GATA transcription factors Gln3p and Gat1p control expression of the MEP2 ammonium permease and that GLN3 is also an important regulator of nitrogen starvation-induced filamentous growth in C. albicans. C. albicans mutants lacking both the GATA transcription factors Gln3p and Gat1p were unable to grow in a medium containing an alternative nitrogen source, bovine serum albumin (BSA) as the sole nitrogen source. The ability to utilize proteins as sole source of nitrogen for growth of C. albicans is conferred by the secreted aspartic protease Sap2p, which degrades the proteins, and oligopeptide transporters that mediate uptake of the proteolytic products into cell. The growth defect of gln3D gat1D mutants was mainly caused by their inability to express the SAP2 gene, as SAP2 expression from the constitutive ADH1 promoter restored the ability of the mutants to grow on BSA. Expression of STP1, which encodes a transcription factor that is required for SAP2 induction in the presence of proteins, was regulated by Gln3p and Gat1p. Forced expression of STP1 from a tetracycline-inducible promoter bypassed the requirement of the GATA transcription factors for growth of C. albicans on proteins. When preferred nitrogen sources are available, SAP2 is repressed and this nitrogen catabolite repression of SAP2 was correlated with downregulation of STP1 under these conditions. Tetracycline-induced STP1 expression abolished nitrogen catabolite repression of SAP2, demonstrating that regulation of STP1 expression levels by the GATA transcription factors is a key aspect of both positive and negative regulation of SAP2 expression. Therefore, by using a regulatory cascade in which expression of the specific transcription factor Stp1p is controlled by the general regulators Gln3p and Gat1p, C. albicans places SAP2 expression under nitrogen control and ensures proper expression of this virulence determinant. In summary, the present study illustrated how GATA factors, Gln3p and Gat1p, play partially overlapping, but distinct roles, in mediating the appropriate responses of C. albicans to the availability of different nitrogen sources. These responses are also determinants of pathogenicity of the fungus. The relative contributions of Gln3p and Gat1p vary with their target genes and the availability of nitrogen source. Overall, these findings provide us with a better understanding of the molecular basis of some of the important processes that help in adaptation of C. albicans to various environmental conditions. The yeast Candida albicans is a member of the normal microflora on the mucosal surfaces of the gastrointestinal and urogenital tract in healthy persons. However, it is an opportunistic pathogen that can cause a range of infections from superficial to disseminated, in response to perturbation of the normal microflora or alterations in the host immunity. C. albicans exhibits a variety of characteristics such as adhesion, morphogenetic switching and secreted aspartic protease production that contribute to its virulence. Expression of many of these virulence factors is controlled by the availability of essential element, nitrogen. C. albicans undergoes morphogenetic transition to form filaments under nitrogen starvation conditions and this switch is controlled by the ammonium permease Mep2p. However, little is known about how this signaling function of Mep2p is regulated. Mutational analysis of Mep2p was carried out to identify the residues that confer signaling activity to this permease. The C-terminal cytoplasmic tail of Mep2p contains a signaling domain that is dispensable for ammonium transport but essential for the signaling activity of Mep2p. In this work, progressive C-terminal truncations analysis demonstrated that a MEP2DC433 allele was still able to induce filamentation while nitrogen starvation-induced filamentous growth was abolished in cells expressing a MEP2DC432 allele. Therefore, tyrosine at position 433 (Y433) is the last amino acid in Mep2p that is essential for signaling. To gain insights into how the signaling activity of Mep2p is regulated by ammonium availability and transport, conserved residues that have been implicated in ammonium binding or uptake were mutated. Mutation of D180, which has been proposed to mediate initial contact with extracellular ammonium, or the pore-lining residues H188 and H342 abolished Mep2p expression, indicating that these residues are important for protein stability. Mutation of F239, which together with F126 is predicted to form an extracytosolic gate to the conductance channel, abolished both ammonium uptake and Mep2p-dependent filamentation, despite proper localization of the protein. On the other hand, mutation of W167, which is assumed to participate along with Y122, F126, and S243 in the recruitment and coordination of the ammonium ion at the extracytosolic side of the cell membrane, also abolished filamentation without having a strong impact on ammonium transport, demonstrating that extracellular alterations in Mep2p can affect intracellular signaling. Mutation of Y122 reduced ammonium uptake much more strongly than mutation of W167 but still allowed efficient filamentation, indicating that the signaling activity of Mep2p is not directly correlated with its transport activity. An important aspect in the ability of Mep2p to stimulate filamentation in response to nitrogen limitation is its high expression levels. The cis-acting sequences and trans-acting regulators that mediate MEP2 induction in response to nitrogen limitation were identified. Promoter analysis revealed that two putative binding sites for GATA transcription factors have a central role in MEP2 expression, as deletion of the region containing these sites or mutation of the GATAA sequences in the full-length MEP2 promoter strongly reduced MEP2 expression. To elucidate the roles of the GATA transcription factors GLN3 and GAT1 in regulating MEP2 expression, mutants lacking one or both of these transcription factors were constructed. Mep2p expression was strongly reduced in gln3D and gat1D single mutants and virtually abolished in gln3D gat1D double mutants. Deletion of GLN3 strongly inhibited filamentous growth under limiting nitrogen conditions, which could be rescued by constitutive expression of MEP2 from the ADH1 promoter. In contrast, inactivation of GAT1 had no effect on filamentation. Surprisingly, filamentation became partially independent of the presence of a functional MEP2 gene in the gat1D mutants, indicating that the loss of GAT1 function results in the activation of other pathways that induce filamentous growth. These findings demonstrated that the GATA transcription factors Gln3p and Gat1p control expression of the MEP2 ammonium permease and that GLN3 is also an important regulator of nitrogen starvation-induced filamentous growth in C. albicans. C. albicans mutants lacking both the GATA transcription factors Gln3p and Gat1p were unable to grow in a medium containing an alternative nitrogen source, bovine serum albumin (BSA) as the sole nitrogen source. The ability to utilize proteins as sole source of nitrogen for growth of C. albicans is conferred by the secreted aspartic protease Sap2p, which degrades the proteins, and oligopeptide transporters that mediate uptake of the proteolytic products into cell. The growth defect of gln3D gat1D mutants was mainly caused by their inability to express the SAP2 gene, as SAP2 expression from the constitutive ADH1 promoter restored the ability of the mutants to grow on BSA. Expression of STP1, which encodes a transcription factor that is required for SAP2 induction in the presence of proteins, was regulated by Gln3p and Gat1p. Forced expression of STP1 from a tetracycline-inducible promoter bypassed the requirement of the GATA transcription factors for growth of C. albicans on proteins. When preferred nitrogen sources are available, SAP2 is repressed and this nitrogen catabolite repression of SAP2 was correlated with downregulation of STP1 under these conditions. Tetracycline-induced STP1 expression abolished nitrogen catabolite repression of SAP2, demonstrating that regulation of STP1 expression levels by the GATA transcription factors is a key aspect of both positive and negative regulation of SAP2 expression. Therefore, by using a regulatory cascade in which expression of the specific transcription factor Stp1p is controlled by the general regulators Gln3p and Gat1p, C. albicans places SAP2 expression under nitrogen control and ensures proper expression of this virulence determinant. In summary, the present study illustrated how GATA factors, Gln3p and Gat1p, play partially overlapping, but distinct roles, in mediating the appropriate responses of C. albicans to the availability of different nitrogen sources. These responses are also determinants of pathogenicity of the fungus. The relative contributions of Gln3p and Gat1p vary with their target genes and the availability of nitrogen source. Overall, these findings provide us with a better understanding of the molecular basis of some of the important processes that help in adaptation of C. albicans to various environmental conditions.

p8 ist ein erstmals im Zusammenhang mit akuter Pankreatitis beschriebenes Protein, das im exokrinen und endokrinen Pankreas mit vermehrtem Zellwachstum assoziiert ist. Bei der Analyse seiner Primärstruktur wurde ein speziesübergreifend hoch konservierter Abschnitt, eine sogenannte NLS, ausgemacht, der HMG-Y/I-Proteinen ähnelt. Da HMG-Proteine oft als Transkriptionsfaktoren wirken, wurde die Hypothese formuliert, auch p8 sei ein HMG-Y/I-Protein und wirke als Transkriptionsfaktor im Nukleus. Um die Bedeutung der rp8-NLS näher zu charakterisieren, wurde in INS-1 beta-Zellen ein rp8(NLS-)-EGFP Fusionsprotein ektopisch exprimiert, um dessen subzelluläre Lokalisation zu untersuchen. Es zeigte sich, ähnlich wie bei Kontrollzellen mit ektoper Expression von EGFP allein, eine gleichmäßige Verteilung von rp8(NLS-)-EGFP zwischen Zytoplasma und Nukleus. Da rp8(NLS-) trotz fehlender NLS dennoch in den Kern translozieren kann, scheint die NLS für diesen Vorgang nicht essentiell zu sein. Diese Annahme wird gestützt durch die Beobachtung, dass einzeln exprimiertes rp8(NLS-) seine Proliferation induzierende Wirkung nicht verliert. In Zellzählungsexperimenten zeigte sich, dass ein rp8- bzw. p8(NLS-)-EGFP Fusionsprotein keinen proliferationsfördernden Einfluss in INS-1 und hMSC-TERT Zellen hat. Bei ektoper Expression von rp8 bzw. rp8(NLS-) und hrGFP als Einzelproteine konnte jedoch eine zwischen beiden rp8-Varianten ähnliche und insgesamt signifikante Stimulation der Zellvermehrung beobachtet werden. Dies belegt, dass die Fusion von rp8 an EGFP dessen biologische Funktion inhibiert, während die Deletion der NLS keinen Einfluß darauf hat. Da der proliferative Stimulus von p8 in menschlichen hMSC-TERT Zellen unabhängig von der Herkunft von p8 aus Ratte oder Mensch ist, scheint p8 bei Säugern hoch konserviert zu sein und speziesübergreifend zu wirken. Aus der hier vorgestellten Arbeit geht hervor, dass der molekulare Mechanismus, über den p8 glukoseabhängig proliferationsinduzierend in INS-1 beta-Zellen wirkt, nicht über die NLS vermittelt wird. Weitere Untersuchungen der Wirkungsweise von p8 auf molekularer Ebene könnten in Zukunft einen Ansatz zur in vitro-Generierung ausreichender Mengen an beta-Zellen zur Zelltherapie des Diabetes mellitus bilden. / The protein p8 was first described as a proliferative factor in the exocrine and endocrine pancreas during an acute pancreatitis. An analysis of the amino acid sequence showed a highly conserved area with strong similarities to a nuclear localisation sequence (NLS) of HMG-Y/I proteins. These proteins act very often as transcription factors and therefore it was hypothesized that p8 also acts as transcription factor. In order to explore the functionality of the rat p8 NLS sequence, an rp8(NLS-)-EGFP fusion protein was transfected into INS1 beta cells and the sub cellular localisation of the protein analyzed. This experiment showed an equal distribution of the fusion protein between nucleus and cytoplasm as it was also observed for control cells which were only transfected with EGFP. It seems that the NLS sequence is not essential for the translocation of rp8 to the nucleus. This is also supported by the observation that rp8(NLS-) still has its proliferative function. Cell counting experiments showed that rp8 and rp8(NLS-)-EGFP fusion proteins had no proliferative effect in INS-1 or hMSC-TERT cells whereas the expression of rp8 and rp8(NLS-) as single proteins caused a significant proliferation augmentation. This led to the conclusion that the fusion protein of p8 and EGFP has lost its biological function whereas the NLS is not essential for the function of p8 as a single protein. The independence of the proliferative effect in hMSC-TERT cells from rat or human p8 may indicate a highly conserved role for p8 in mammals. This work showed that the proliferative effect of p8 in glucose stimulated INS-1 beta cells is independent of its supposed nuclear localisation sequence. The molecular mechanisms of p8 function has still to be revealed by further experiments but once elucidated it may lead to in-vitro generation of beta cells for a cell therapy of diabetes mellitus.

Der transkriptionelle Koaktivator BOB.1/OBF.1 spielt eine wichtige Rolle in der oktamer-abhängigen Transkription in B-Lymphozyten. Mäuse, denen dieser Koaktivator fehlt, zeigen verschiedene Defekte in der B-Zellentwicklung. Besonders auffällig ist hierbei das völlige Fehlen der Keimzentren. Übereinstimmend mit diesem Phänotyp zeigten B-Zellen des Keimzentrums eine stark erhöhte BOB.1/OBF.1-Expression im Vergleich zu ruhenden B-Zellen. Im Gegensatz zu primären B-Zellen unterschiedlicher Entwicklungsstadien zeigen transformierte korrespondierende B-Zellen keine Regulation der BOB.1/OBF.1-Expression. T-Zellen exprimieren im Gegensatz dazu BOB.1/OBF.1 erst nach Stimulation mit PMA und Ionomycin. Um die unterschiedliche Regulation in B-Zellen versus T-Zellen zu untersuchen wurde der BOB.1/OBF.1-Promotor kloniert. Die Analyse der Promotor-Sequenz ergab Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren CREB, NF-AT und ein SRY-Motiv. In Transfektionsstudien konnte eine deutliche Zellspezifität des Promotors gezeigt werden. Die erwartete induzierbare Aktivierung in T-Zellen war hingegen nur schwach. Die Analyse der BOB.1/OBF.1-Regulation in B-Zellen des Keimzentrums ergab, daß die verstärkte BOB.1/OBF.1-Expression nur partiell auf eine erhöhte Expression des BOB.1/OBF.1-Transkriptes zurück zu führen ist. Vielmehr zeigte sich eine deutliche Regulation des BOB.1/OBF.1-Proteins. In einem "yeast-two hybrid screen" mit der amino-terminalen Domäne von BOB.1/OBF.1 als "bait" (Köder) konnten die beiden Proteine SIAH1 und SIAH2 als Interaktionspartner identifiziert werden. Eine beschriebene Funktion von SIAH1 und SIAH2 liegt in der Regulation der Proteinstabilität ihrer Interaktionspartner. In Ko-Transfektionsexperimenten konnte gezeigt werden, daß SIAH1 die BOB.1/OBF.1-Proteinstabilität vermindert, ohne die transkriptionelle Expression zu beeinflussen. Die Inhibition des Proteasoms führt hierbei zu einer stark verminderten BOB.1/OBF.1-Degradation. Abschließend konnte gezeigt werden, daß die Aktivierung des B-Zellrezeptors zu einer Degradation von BOB.1/OBF.1 durch SIAH1 führt und folglich die transkriptionelle Aktivierung BOB.1/OBF.1-abhängiger Reporterkonstrukte vermindert wird. In einem zweiten "yeast-two hybrid screen" mit der carboxy-terminalen Domäne von BOB.1/OBF.1 als "bait", konnten die Interaktionspartner ABP 280 und Mcm7 identifiziert werden. Besonders die Rolle von Mcm7 in der Transkription könnte neue Aufschlüsse über die Wirkungsweise des transkriptionellen Aktivators BOB.1/OBF.1 geben. / The BOB.1/OBF.1 coactivator is critically involved in mediating octamer-dependent transcriptional activity in B lymphocytes. Mice lacking this coactivator show various defects in B cell development most notably they completely lack germinal centers. Consistent with this phenotype, BOB.1/OBF.1 levels are massively upregulated in germinal center B cells as compared to resting B cells. In contrast to primary B cells, all transformed B cell lines express BOB.1/OBF.1 in comparable amounts. In T cells, BOB.1/OBF.1 expression can be induced by stimulation with PMA and ionomycin. To analyse the different regulation in B cells versus T cells, I cloned the BOB.1/OBF.1 promoter. Analyses of the promoter sequence showed binding sites for the transcription factors CREB, NF-AT and SRY/SOX-protein. Transfection experiments revealed a clear cell type specificity of the promoter. However the promoter was only poorly inducible in stimulated T-cells. I have addressed the mechanism of BOB.1/OBF.1 upregulation in germinal center B cells and found that only a minor part of this regulation can be attributed to increased levels of BOB.1/OBF.1-specific mRNA. Apparently, BOB.1/OBF.1 is also regulated at the protein level. In support of this suggestion I have been able to identify two related BOB.1/OBF.1 interacting proteins, SIAH1 and SIAH2, in a yeast two-hybrid screen using the amino-terminal domain as "bait". SIAH1 and SIAH2 are known regulators of protein stability. Cotransfection experiments revealed that coexpression of SIAH results in a destabilisation of BOB.1/OBF.1 protein without affecting mRNA levels. Furthermore, proteasome inhibitors block the degradation of BOB.1/OBF.1 protein. Finally B cell receptor cross-linking also resulted in the degradation of BOB.1/OBF.1 via SIAH1 and consequently reduced transcriptional activation of BOB.1/OBF.1-dependent reporters. Using the carboxy-terminal domain of BOB.1/OBF.1 as "bait", I identified in a second yeast-two hybrid screen the proteins ABP 280 and Mcm7 as potential interaction partners. Especially the role of Mcm7 in transcription could give new insights as to how BOB.1/OBF.1 is able to function as a transcriptional activator.

B lymphocyte induced maturation protein-1 (Blimp-1) und X-box-binding protein-1” (XBP-1) sind als Transkriptionsfaktoren unverzichtbar für die terminale Differenzierung von B-Lymphozyten zu Immunglobulin (Ig)-sezernierenden Plasmazellen. Ebenso stellen die unfolded protein response (UPR) und das Spleißen von XBP-1, beides ausgelöst durch erhöhte Ig-Produktion, entscheidende Schritte auf dem Weg zur Plasmazellentstehung dar. Allerdings ist das Molekül/ sind die Moleküle nach wie vor unbekannt, die diesen beiden Ereignissen in der Signalkaskade vorgeschaltet sind. Da die ektope Expression von Blimp-1 in B-Zellen hinreicht, diese zu Plasmazellen zu differenzieren, erscheint es plausibel, dass Blimp-1 das Molekül sein könnte, das die Auslösung einer UPR und das Spleißen von XBP-1 steuert. Dieser Möglichkeit wurde durch ektope Expression von Blimp-1 in der Maus-B-Zell-Lymphomlinie WEHI 231 und in primären B-Zellen aus der Milz von Mäusen nachgegangen. Die ektope Expression von Blimp-1 führte in beiden Zelltypen zur Erhöhung der Ig Produktion, zum Spleißen von XBP-1 und zur Sekretion von Immunglobulinen. Interessanterweise war der N-terminale Anteil von Blimp-1, bestehend aus den Aminosäuren 1-751, hinreichend, um diese Effekte auszulösen, während der C-Terminus, der die Aminosäuren 465-856 umfaßte, keinen Effekt hatte. Darüberhinaus, wurde die Expression von BIP, dessen Gen ein UPR-Zielgen ist, durch ektope Expression von Blimp-1 bzw. dessen N-Terminus in primären B-Zellen erhöht. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass Blimp-1, speziell dessen N-terminale Domäne, hinreichend ist, um eine UPR und die Prozessierung von XBP-1 auszulösen, was zur Ig-Sekretion von B-Zellen führt. / B lymphocyte induced maturation protein-1 (Blimp-1) and X-box-binding protein-1 (XBP-1) are indispensible transcription factors required for B lymphocyte terminal differentiation into Ig secreting plasma cells. Occurrence of an unfolded protein response (UPR) and XBP-1 splicing, due to elevated Ig levels, are critical events during plasma cell generation. However, the upstream molecule sufficient to trigger these events remain elusive. Because ectopic expression of Blimp-1 in B cells is sufficient to generate plasma cells, it is plausible that Blimp-1 might be the upstream molecule, sufficient for the induction of UPR and XBP-1 splicing. The results from the current study indicate that ectopic expression of Blimp-1 or its N-terminal domain, in B cells, is sufficient to induce XBP-1 splicing, UPR and Ig (immunoglobulin) secretion. Further more Blimp-1 is able to directly repress the antiapoptotic gene A1, by binding to specific DNA elements in A1 promoter. This repression of A1 by Blimp-1 seems to be an important prerequisite for Plasma cell differentiation because ectopic expression of A1 in primary B cells resulted in reduced immunoglobulin secretion.

Pluripotency describes the ability of stem cells to form every cell type of the body.. Pluripotent stem cells are e.g. embryonic stem cells (ESCs), but also the so called induced pluripotent stem cells (IPS cells), that are generated by reprogramming differentiated somatic cells into a pluripotent state. Furthermore, it has been shown that spermatogonia (SG) derived from adult testes of mouse or human are pluripotent. Because of their ability to differentiate into every somatic cell type, pluripotent stem cells have a unique status in research and regenerative medicine. For the latter, they offer a valuable opportunity to replace destroyed tissues or organs. For basic research, stem cells represent a useful system to study differentiation or developmental processes that are difficult to access in the physiological situation e.g. during embryogenesis. Both applications, however, require methods that allow efficient and directed differentiation of stem cells into defined specialized cell types. This study first aims to investigate the differentiation potential of SG derived from the teleost fish medaka (Oryzias latipes). My results demonstrate that medaka SG are able to form different somatic cell types, namely adipocytes, melanocytes, osteoblasts, and neurons. This indicates that medake SG have retained a broad differentiation potential suggesting that pluripotency is not restricted to mouse and human SG but might be conserved among vertebrates. Next, I wanted to establish a differentiation method that is solely based on ectopic expression of genes known to be essential for the formation of certain somatic cell types – so called master regulators (MRs). My findings show that ectopic expression of the melanocyte-specific transcription factor mitf-m that has previously been shown to induce differentiation of medaka ESCs into pigment cells resulted in the formation of the same cell type in medaka SG. This approach could be used to generate other somatic cell types. Thus, ectopic expression of the MRs cbfa1 and mash1 in MF-SG was sufficient to induce differentiation into osteoblasts and neurons, respectively. Interestingly, these differentiation processes included the activation of genes that are expressed earlier during embryogenesis than the differentiation-inducing MR. Furthermore, my findings show that the approach of MR-induced differentiation can be transferred to mammalian stem cell systems. Ectopic expression of the neural transcription factor ngn2 was sufficient to induce efficient and rapid differentiation of neurons in mouse ESCs. This differentiation process also included the induction of genes that in vivo are activated at earlier stages that ngn2. By generating a transgenic cell line allowing induction of ectopic ngn2 expression, it was possible to obtain a relatively pure culture of functional neurons. Ngn2-induced differentiation did not require any additional signals and occurred even under pluripotency promoting conditions. Moreover, ectopic expression of ngn2 did also induce the formation of cells with neuronal morphology in IPS cells indicating that MR-induced differentiation is operative in different stem cell types. Furthermore, protein transduction of Ngn2 into mouse ESCs also resulted in a neuronal differentiation process up to the appearance of neural precursor cells. Last, my results show that MR-induced differentiation can also be used to generate other cell types than neurons from mouse ESCs. Myoblasts and macrophage-like cells were generated by ectopic expression of the MRs myoD and cebpa, respectively. Using transgenic cell lines enabling induction of MR expression it was possible to obtain mixed cultures with two different differentiation processes occurring in parallel. Altogether this study shows that ectopic expression of single genes is sufficient to induce directed differentiation of stem cells into defined cell types. The feasibility of this approach was demonstrated for different MRs and consequently different somatic cell types. Furthermore, MR induced differentiation was operative in different stem cell types from fish and mouse. Thus, one can conclude that certain genes are able to define cell fates in in vitro stem cell systems and that this cell fate defining potential appears to be a conserved feature in vertebrates. These findings therefore provide new insights in the role of MRs in cell commitment and differentiation processes. Furthermore, this study presents a new method to induce directed differentiation of stem cells that offers several advantages regarding efficiency, rapidness, and reproducibility. MR-induced differentiation therefore represents a promising tool for both stem cell research and regenerative medicine. / Pluripotenz bezeichnet die Fähigkeit einer Stammzelle, jede Zelle des Körpers zu bilden. Zu den pluripotenten Stammzellen gehören embryonale Stammzellen (ESZ), aber auch so genannte induzierte pluripotente Stammzellen (IPS Zellen), die durch Rückprogrammierung ausdifferenzierter Körperzellen in einen pluripotenten Status gewonnen werden. Außerdem wurde gezeigt, dass adulte Spermatogonien (SG) in Maus und Mensch pluripotent sind. Pluripotente Stammzellen sind von großer Wichtigkeit für Forschung und regenerative Medizin. Für letztere bieten diese Zellen aufgrund ihrer Fähigkeit, jede Körperzellen zu bilden, eine vielversprechende Möglichkeit, zerstörte Gewebe oder Organe zu ersetzen. In der Forschung stellen sie ein nützliches System dar, um Entwicklungs- und Differenzierungsprozesse zu untersuchen, die in der physiologischen Situation z.B. der Embryonalentwicklung – schwer zugänglich sind. Eine wichtige Grundlage für diese Anwendungen sind jedoch Methoden, die die effiziente und gerichtete Differenzierung von Stammzellen in einen bestimmten Zelltyp erlauben. In dieser Arbeit wird zunächst das Differenzierungspotential von SG der Fischspezies Medaka (Oryzias latipes) untersucht, um festzustellen, ob Pluripotenz von SG, die bisher nur in Maus und Mensch gezeigt wurde, auch in anderen Wirbeltieren außerhalb der Säuger erhalten ist. Meine Ergebnisse zeigen, dass Medaka-SG fähig sind verschiedene somatische Zelltypen zu bilden. Das zweite Ziel dieser Studie ist die Entwicklung einer Differenzierungsmethode, die nur auf der Expression einzelner so genannter Masterregulatoren (MR) beruht – Gene, die als essentiell für die Entwicklung bestimmter Zelltypen bekannt sind. Meine Ergebnisse zeigen, dass der Pigmentzell-spezifische Transkriptionsfaktor Mitf-M, von dem gezeigt wurde, dass er die Differenzierung von Medaka-ESZ in Pigmentzellen induzieren kann, die Bildung desselben Zelltyps in Medaka-SG induziert. Dieser Ansatz ermöglichte auch die Bildung anderer somatischer Zelltypen. So führte Überexpression der MR cbfa1 und mash1 in Medaka SG zur Differenzierung in Osteoblasten bzw. Neuronen. Interessanterweise wurde bei diesen Differenzierungsprozessen die Aktivierung von Genen beobachtet, die während der Embryonalentwicklung vor dem Differenzierung-auslösenden MR aktiviert werden. Weiterhin zeigen meine Ergebnisse, dass der Ansatz einer gerichteten Differenzierung, ausgelöst durch einzelne MR, auch auf Säuger-Stammzellen übertragen werden kann. So wurde durch Überexpression des neuronalen Genes ngn2 in murinen ESZ die effiziente und schnelle Bildung von Nervenzellen induziert, wobei auch hier die Aktivierung von Genen beobachtet wurde, deren Expression in der Embryogenese der von ngn2 vorangeht. Die Herstellung einer transgenen Zelllinie, in der die Überexpression von ngn2 aktiviert werden kann, erlaubte die Entstehung einer fast reinen Kultur funktionaler Neuronen. Der durch ngn2 ausgelöste Differenzierungsprozess war unabhängig von zusätzlichen Faktoren und lief sogar unter Bedingungen ab, die normalerweise den pluripotenten Zustand unterstützen. Außerdem führte Überexpression von ngn2 auch in IPS Zellen zur Bildung von Zellen mit neuronalem Phenotyp. Weiterhin konnte auch durch Transduktion des Ngn2-Proteins in murine ESZ neuronale Differenzierung ausgelöst werden, und zwar die Bildung neuronaler Vorläuferzellen. Zuletzt wird bewiesen, dass gerichtete Differenzierung von murinen ESZ durch einzelne MR Gene neben neuronalen Zelltypen auch die Bildung anderer somatischer Zellen erlaubt: Überexpression der Gene myoD oder cebpa induzierte die Differenzierung in Muskelzellen bzw. Macrophagen-ähnliche Zellen. Unter Verwendung transgener Zelllinien, die die Aktivierung jeweils eines MRs erlauben, war es möglich, gemischte Kulturen zu erhalten, in denen zwei verschiedene Differenzierungsprozesse parallel abliefen. Diese Studie zeigt, dass die Überexpression einzelner Gene ausreichend ist, um gerichtete Differenzierungsprozesse in einen bestimmten Zelltyp auszulösen. Die erfolgreiche Durchführung dieses Ansatzes wird nicht nur mit verschiedenen Genen und somit verschiedenen resultierenden Zelltypen nachgewiesen, sondern auch in verschiedenen Stammzelltypen aus Fisch und Maus. Dies erlaubt die Schlussfolgerung, dass bestimmte Gene in vitro das Schicksal von Stammzellen festlegen können und dass diese Fähigkeit eine konservierte Eigenschaft in Wirbeltieren zu sein scheint. Somit präsentiert diese Arbeit neuen Erkenntnisse über die Rolle von MR bei der Festlegung von Zellidentitäten und in Differenzierungsprozessen. Weiterhin wird eine neue Methode zur Induktion gerichteter Differenzierung in Stammzellen aufgezeigt, die mehrere Vorteile in Bezug auf Effizienz, Geschwindigkeit und Reproduzierbarkeit hat. Auslösung von Differenzierung durch MR Gene bietet somit einen neuen vielversprechenden Ansatz mit potentieller Anwendung sowohl in Stammzellforschung, als auch in regenerativer Medizin.

LASP-1 (LIM und SH3 Domänen Protein) ist ein in Zellen ubiquitär vorkommendes Protein, welches in verschiedenen Tumorgeweben eine pathophysiologische Überexpression aufweist. Das Protein besitzt eine LIM Domäne, zwei Aktinbindungsregionen sowie eine SH3 Domäne und bindet einerseits an dynamischen Aktinstrukturen wie den fokalen Kontakten, Lamellopodien und Membranfortsätzen, kann andererseits aber auch in den Zellkern translokalisieren. Für Aktinstrukturen wirkt LASP-1 als Gerüstprotein und ist wichtig für die Migration und Proliferation der Zellen. Die Funktion von LASP-1 im Zellkern ist noch nicht bekannt, da aber in Tumorzellen eine erhöhte nukleare Akkumulation von LASP-1 beobachtet werden konnte, deren Intensität mit der Tumorgröße sowie dem Langzeitüberleben der Patientinnen korreliert, ist LASP-1, zusätzlich zu seiner Funktion als Strukturprotein, vermutlich auch ein Transkriptionsfaktor oder ein transkriptioneller Kofaktor. Eine Herunterregulation von LASP-1 in verschiedenen Tumorentitäten führt zur Inhibition der Proliferation und Migration. In dieser Arbeit konnte der bisher unbekannte Zellkernimport und -export von LASP-1 aufgeklärt werden. Maßgeblich daran beteiligt ist ein durch Pulldown Experimente neu identifizierter LASP-1 Bindungspartner: das Zonula Occludens 2 Protein (ZO-2). Mittels Immunpräzipitationen und Immunfluoreszenzen wurde diese Interaktion bestätigt. Nach Phosphorylierung von LASP-1 an Ser-146 durch Aktivierung der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) kommt es zu einer partiellen Ablösung des LASP-1/ZO-2 Komplexes aus den fokalen Kontakten hin zu einer vermehrten Kernlokalisation beider Proteine. Dies lässt sich durch Kern/Zytosol Trennungen belegen. Dabei ist die Bindung von LASP-1 an ZO-2 essentiell für die Translokation in den Zellkern, da bei einem ZO-2 Knockdown auch nach PKA Aktivierung LASP-1 zytosolisch lokalisiert bleibt. Wie Mutationsanalysen zeigen, findet die Interaktion zwischen der C-terminalen SH3 Domäne im LASP-1 und der Prolin-reichen SH3-Bindungssequenz im Bereich der Aminosäuren 1103-1121 am C-Terminus im ZO-2 statt. Die Translokation des Komplexes in den Kern erfolgt dabei über das Kernlokalisationssignal im ZO-2, da die LASP-1 Sequenz selbst keine nukleare Importsequenz aufweist. Im Zellkern konnte die direkte Interaktion von LASP-1 und ZO-2 mittels Duolink® Proximity Ligation Assay sichtbar gemacht werden. Der Export der Proteine erfolgt über das Protein CRM1. Eine Inhibition der Kernexportmaschinerie mit Leptomycin B erhöht die Konzentration beider Proteine im Zellkern. Das nukleare Exportsignal (NES) im LASP-1 konnte durch Punktmutationen N-terminal der Leucin-reichen Aminosäuresequenz 70-77 zugeordnet werden (NLRLKQQS). Im letzten Schritt dieses Zyklus erfolgt die Relokalisation von LASP-1 zurück an die Zellmembranstrukturen. Der neu gefundene Signalweg dient wahrscheinlich zur Weiterleitung von externen Stimuli in den Kern und zur Genregulation - mit LASP-1 als Transkriptionsfaktor oder transkriptionellen Kofaktor. / LASP-1 (LIM and SH3 protein) is ubiquitously expressed at basal levels, but was found to be pathophysiologically overexpressed in several cancer entities. LASP-1 exhibits one LIM domain, two actin binding domains and one SH3 domain. On the one hand, LASP-1 is predominantly localized at focal contacts, lamellopodia and membrane ruffles, on the other hand a nuclear localization is observed. LASP-1 works as actin-binding scaffolding protein and is essential for migration and proliferation. Silencing of LASP-1 by RNA- interference in various cancer cell lines results in a strong inhibition of proliferation and migration. However, in tumor cells, an additional striking nuclear localization of the protein was observed, which significantly correlates with tumor size and a poor long term survival of the patients. Therefore, LASP-1 might act additionally as transcription factor or transcriptional co-factor In this work, a novel LASP-1 binding partner, zonula occludens protein 2 (ZO-2), was identified and its role in the signal transduction pathway of LASP-1 nucleo-cytoplasmic shuttling was established. Upon LASP-1 phosphorylation at Ser-146 by activated cAMP-dependent protein kinase A (PKA), LASP-1 binding to Zyxin and F-actin decreases and the protein detaches, in complex with ZO-2, from the plasma membrane and translocates into the nucleus. These results were confirmed by nuclear and cytosolic separation assays. Pull-down assays with mutants revealed that ZO-2 binds with its proline-rich sequence (amino acids 1103-1121) to the SH3 domain in LASP-1. LASP-1 exhibits no nuclear localization signal and requires ZO-2 to shuttle into the nucleus. In situ proximity ligation assay confirmed the direct binding between LASP-1 and ZO-2 and visualized the shuttling. Inhibition of the nuclear export system by Leptomycin B results in an accumulation of both proteins in nuclei. Nuclear export is regulated by the newly identified nuclear export signal in LASP-1 (amino acids 70-77) and mediated by CRM1. Finally LASP-1 relocalizes to focal contacts. This new identified pathway serves presumably as a signal transductor from the focal contacts to the nucleus for gene regulation.

The transcription factor NFATc1 has been shown to regulate the activation and differentiation of T-cells and B-cells, of DCs and megakaryocytes. Dysregulation of NFAT signaling was shown to be associated with the generation of autoimmune diseases, malignant transformation and the development of cancer [71]. The primary goal of this work was to gain insights on Nfatc1 induction and regulation in lymphocytes and to find new direct NFATc1 target genes. Three new BAC -transgenic reporter mouse strains (tgNfatc1/Egfp, tgNfatc1/DE1 and tgNfatc1/DE2) were applied to analyze Nfatc1 induction and regulation in primary murine B- and T-cells. As a result, we were able to show the persistent requirement of immunoreceptor-signaling for constant Nfatc1 induction, particularly, for NFATc1/αA expression. Furthermore, we showed that NF-κB inducing agents, such as LPS, CpG or CD40 receptor engagement, in combination with primary receptor-signals, positively contributed to Nfact1 induction in B-cells [137]. We sought to establish a new system which could help to identify direct NFATc1 target genes by means of ChIP and NGS in genom-wide approaches. We were able to successfully generate a new BAC-transgene encoding a biotinylatable short isoform of NFATc1, which is currently injected into mice oocyte at the TFM in Mainz. In addition, in vivo biotinylatable NFATc1–isoforms were cloned and stably expressed in the murine B-cell lymphoma line WEHI-231. The successful use of these cells stably overexpressing either the short NFATc1/αA or the long NFATc1/βC isoform along with the bacterial BirA biotin ligase was confirmed by intracellular stainings, FACS analysis, confocal microscopy and protein IP. By NGS, we detected 2185 genes which are specifically controlled by NFATc1/αA, and 1306 genes which are exclusively controlled by NFATc1/βC. This shows that the Nfatc1 locus encodes “two genes” which exhibit alternate, in part opposite functions. Studies on the induction of apoptosis and cell-death revealed opposed roles for the highly inducible short isoform NFATc1/αA and the constantly expressed long isoform NFATc1/βC. These findings were confirmed by whole transcriptome-sequencing performed with cells overexpressing NFATc1/αA and NFATc1/βC. Several thousand genes were found to be significantly altered in their expression profile, preferentially genes involved in apoptosis and PCD for NFATc1/βC or genes involved in transcriptional regulation and cell-cycle processes for NFATc1/αA. In addition we were able to perform ChIP-seq for NFATc1/αA and NFATc1/βC in an ab-independent approach. We found potential new target-sites, but further studies will have to address this ambitious goal in the future. In individual ChIP assays, we showed direct binding of NFATc1/αA and NFATc1/βC to the Prdm1 and Aicda promoter regions which are individually controlled by the NFATc1 isoforms. / Der Transkriptionsfaktor NFATc1 wurde als Regulator der Aktivierung und Differenzierung für T-Zellen, B-Zellen, Dendritische-Zellen und Megakaryozyten beschrieben. Autoimmunerkrankungen und die Entstehung von Krebs wurden mit Fehlregulationen der NFAT-Signalwege in Verbindung gebracht [71]. Ziel dieser Arbeit war der Gewinn neuer Erkenntnisse über die Induktion und Regulation von NFATc1 in Lymphozyten. Darüber hinaus sollten Gene, welche direkt durch NFATc1 gebunden und reguliert werden, identifiziert werden. Um die Induktion und Regulation von NFATc1 in primären T- und B-Zellen untersuchen zu können, wurden drei BAC transgene Reporter Maus Linien (tgNfatc1/Egfp, tgNfatc1/DE1 and tgNfatc1/DE2) verwendet. Dadurch war es uns möglich zu zeigen, dass es einer ununterbrochenen Antigen-Rezeptor Stimulation bedarf, um NFATc1, im Besonderen die Transkription der kurzen Isoform NFATc1/αA, dauerhaft zu induzieren. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass Induktoren wie LPS, CpG oder auch die Stimulation des CD40-Rezeptors, die die Expression des Transkriptionsfaktors NF-B zur Folge haben, einen positiven Einfluss auf die Nfatc1-Induktion haben [137]. Unser Interesse lag darin, ein System zu etablieren, dass es uns ermöglichen sollte, neue NFATc1-Zielgene durch ChIP assays und Genom-weite Sequenzierungen zu ermitteln. Es ist uns gelungen, ein neues BAC-Transgen, welches für eine in vivo biotinylierbare Variante des NFATc1/αA Proteins kodiert, zu erzeugen. Dieses Konstrukt wird zum gegenwärtigen Zeitpunkt - in Zusammenarbeit mit der Universität Mainz (TFM) - in die Vorkerne von Maus-Eizellen injiziert. Ferner wurden biotinylierbare NFATc1-Isoformen kloniert und mit Hilfe retroviraler Plasmide stabil in WEHI-231 B-Lymphom-Zellen integriert. Durch intrazellulare Färbungen, FACS-Analysen, Konfokalmikroskopie und Immunpräzipitationen konnten wir eine erfolgreiche in vivo Biotinylierung in NFATc1/αA- und NFATc1/βC-exprimierenden WEHI-231 Zellen nachweisen. Mittels Next-Generation-Sequencing, in Kollaboration mit TRON, Univ. Mainz, konnten wir 2185 Gene, die spezifisch durch NFATc1/αA kontrolliert wurden, und 1306 Gene, die ausschließlich durch die Überexpression von NFATc1/βC reguliert wurden, identifizieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass im Nfatc1 Locus „zwei Gene“ mit alternativer, zum Teil gegensätzlicher Funktion, kodiert sind. Untersuchungen zu Apoptose und Zelltod haben entgegengesetzte Eigenschaften der stark induzierbaren, kurzen Isoform NFATc1/αA und der stetig exprimierten langen Isoform NFATc1/βC aufgezeigt. Daten von Sequenzierungen des gesamten Transkriptoms, die mit NFATc1/αA und -βC überexprimierenden WEHI-231 Zellen durchgeführt wurden (TRON, Mainz), bestätigten diese Befunde. Es zeigte sich, dass es wesentliche Veränderungen der Expressionsprofile Tausender von Genen gab. In WEHI-231-Zellen, die NFATc1/βC überexprimierten, waren viele dieser Gene an Apoptose und Zelltod beteiligt. Demgegenüber waren in NFATc1/αA-Zellen vor allem Gene betroffen, die an transkriptionaler Regulation und dem Zellzyklus beteiligt waren. Überdies war es uns möglich, ChIPseq Assays für NFATc1/αA und NFATc1/βC in einem Antikörper-unabhängigen Ansatz durchzuführen. Dadurch konnten wir neue NFATc1-Bindungstellen identifizieren. Es bedarf jedoch noch weiterer Untersuchungen, um diese Ergebnisse der Genom-weiten ChIPseq Assays zu bestätigen. Durch weitere ChIP Experimente konnten wir eine direkte Bindung von NFATc1/αA und NFATc1/βC an die regulatorischen Regionen der Prdm1- und Aicda-Gene nachweisen. Die Transkription beider Gene wurde durch die Überexpression von NFATc1/αA und -βC deutlich reguliert und spielt offenbar bei der Bildung von Plasma-B-Zellen, die für die Antikörper-Produktion verantwortlich sind, eine wesentliche Rolle.

Krebserkrankungen bleiben auch im Jahr 2012 die zweithäuftigste Todesursache in der industralisierten Welt. Zusätzlich hat die Etablierung der Krebsstammzell-Hypothese grundsätzliche Auswirkungen auf die Erfolgsaussichten konventioneller Krebstherapie, wie Chemotherapie oder Strahlentherapie. Deswegen ist es von gröβter Notwendigkeit, dass neue Ansätze zur Krebstherapie entwickelt werden, die den Ausgang der Behandlung verbessern und zu weniger Nebenwirkungen führen. Diverse vorklinische Studien haben gezeigt, dass die onkolytische Virotherapie mit Vaccinia-Viren ein potentes und gut tolerierbares neues Werkzeug in der Krebstherapie darstellt. Die Effizienz des Vaccinia-Virus als Therapeutikum allein oder in Kombination mit Strahlen- oder Chemotherapie wird aktuell in mehreren klinischen Studien der Phasen I & II getestet. Krebsstammzellen und Stammzellen teilen eine Vielzahl von Eigenschaften, wie die Fähigkeit zur Selbst-Erneuerung und Pluripotenz, Stilllegung der Zellproliferation, Resistenz gegen Medikamente oder Bestrahlung, die Expression von diversen Zelloberflächen-molekülen, die Aktivierung und Hemmung spezifischer Signaltransduktionswege oder die Expression von Stammzell-spezifischen Genen. In dieser Arbeit wurden zwei neue rekombinante Vaccinia-Viren entwickelt, welche die Stammzell-Transkriptionsfaktoren Nanog (GLV-1h205) und Oct4 (GLV-1h208) exprimieren, um tiefere Einblicke in die Rolle dieser Masterregulatoren in der Entstehung von Krebs und ihrem Einfluss auf die onkolytische Virotherapie zu gewinnen. Das Replikationspotential beider Virusstämme in menschlichen A549-Zellen und PC-3-Zellen wurde anhand von Replikations-Assays bestimmt. Die Expression der Virus-spezifischen Markergene Ruc-GFP und beta-Galaktosidase, wie auch die Expression der Transkriptionsfaktoren Nanog und Oct4 wurde mit Hilfe von RT-PCR, SDS-PAGE und Western blotting, sowie immunozytochemischen Experimenten nachgewiesen. Des Weiteren wurde der Einfluss einer GLV-1h205-Infektion von A549-Zellen auf den Zellzyklus untersucht. Zudem wurde die Bedeutung der Virus-vermittelten Transkriptionsfaktor-Expression auf die Behandlung von subkutanen A549-Tumoren in einem Xenograft-Modell untersucht. Zur Untersuchung, ob die beobachteten Vorteile in der Behandlung von Lungenadenokarzinomen in Mäusen mit GLV-1h205 Promoter- oder Transkriptionsfaktor-abhängig sind, wurde ein Kontroll-Virus (GLV-1h321) hergestellt, dass für eine unfunktionale Nanog-Mutante codiert. Mittels SDS-PAGE und Western blotting sowie Immunozytochemie wurde die Transgen-Expression analysiert. Ein weitere Aspekt dieser Arbeit war die Fragestellung, ob sich das onkolyische Vaccinia-Virus GLV-1h68 eignet, als neues und weniger invasives Therapeutikum effizient Darmkrebszellen zu infizieren um sich in ihnen zu replizieren und diese anschlieβend zu lysieren. Ein derartiger Therapieansatz würde besonders im Hinblick auf spät diagnostizierten, metastasierenden Darmkrebs eine interessante Behandlungsalternative darstellen. Virale Markergen-expression wurde anhand von Fluoreszenzmikroskopie und FACS-Analyse untersucht. Desweiteren wurde gezeigt, dass die einmalige Administration von GLV-1h68 in mindestens zwei verschiedenen Darmkrebszelllinien zu einer signifikanten Inhibierung des Tumorwachstums in vivo und zu signifikant verbessertem Überleben führt. Der Transkriptionsfaktor Klf4 wird zwar stark in ruhenden, ausdifferenzierten Zellen des Darmepithels exprimiert, ist hingegen bei Darmkrebs generell dramatisch herabreguliert. Die Expression von Klf4 führt zu einem Stop der Zellproliferation und inhibiert die Aktivität des Wnt-Signalweges, indem es im Zellkern an die Transaktivierungsdomäne von beta-Catenin bindet. Um die Behandlung von Darmkrebs mit Hilfe onkolytischer Virotherapie weiter zu verbessern, wurden verschiedene Vaccinia-Viren (GLV-1h290-292) erzeugt, die durch verschiedene Promoterstärken die Expression unterschiedlicher Mengen an Tumorsuppressor Klf4 vermitteln. Die anfängliche Charakterisierung der drei Virusstämme mittels Replikations-Assay, Zytotoxizitätstudien, SDS-PAGE und Western blotting, Immunozytochemie sowie die Analyse der Proteinfunktion mit Hilfe von qPCR- und ELISA-Analysen zur Bestimmung von zellulärem beta-Catenin, zeigten eine Promoter-abhängige Expression und Wirkung von Klf4. Für weitere Analysen wurde das Virus GLV-1h291 gewählt, welches nach Infektion die gröβte Menge an Klf4 produziert und zusätzlich durch die C-terminale Fusion einer TAT Transduktionsdomäne Membran-gängig gemacht (GLV-1h391). Die erhaltenen Befunde machen das Klf4-TAT-kodierende Vaccinia-Virus GLV-1h391 zu einem vielversprechenden Kandidaten für eine Behandlung von Darmkrebs beim Menschen. / Cancer remains the second leading cause of death in the industrialized. The data from many different studies investigating the nature of cancer-initiating cells coined the description ‘cancer stem cells’ and has major implications on conventional cancer therapy. Thus, to improve the outcome of cancer treatment and to lower negative side effects, the development of novel therapeutic regimens is indispensable. It has been demonstrated in many preclinical studies that oncolytic virotherapy using vaccinia virus may provide a powerful and well-tolerable new tool in cancer therapy which is currently investigated in several clinical trials (Phase I & II) as stand-alone treatment or in combination with conventional cancer therapy. Cancer-initiating cells and stem cells share a variety of characteristics like the ability to self-renew, differentiation potential, quiescence, drug and radiation resistance, activation and inhibition of similar signaling pathways as well as expression of cell surface markers and stem cell-related genes. In this work, two new recombinant vaccinia viruses expressing the transcription factors Nanog (GLV-1h205) and Oct4 (GLV-1h208) were engineered to provide deeper insight of these stem cell master regulators in their significance of cancer-initiation and their impact on oncolytic virotherapy. Both viruses were analyzed for their replication potential in A549 and PC-3 human cancer cells. Marker gene expression was assessed by RT-PCR, SDS-PAGE and Western blotting, ELISA or immunocytochemistry.Furthermore, the effect of GLV-1h205 infection on the cell cycle in A549 cells was analyzed. Next, the effects of virus-mediated expression of stem cell transcription factors on therapeutic efficacy and survival rates in A549 xenograft mouse models was analyzed. A non-functional Nanog mutant-expressing virus strain (GLV-1h321) was engineered to analyze whether the observed therapeutic benefits were promoter- or payload-driven. Furthermore, this study analyzed the potential of GLV-1h68 to infect, replicate in, and lyse colorectal cancer cell lines to study whether oncolytic vaccinia viruses can be potential new and less invasive treatment regimens for late stage colorectal cancer. Marker gene expression was assessed by fluorescence microscopy and FACS. The transcription factor Klf4 is highly expressed in quiescent, terminally differentiated cells in the colonic epithelium whereas it is dramatically downregulated in colon cancers. Klf4 expression leads to cell growth arrest and inhibits Wnt signaling by binding to beta-catenin. To further improve the treatment of colorectal cancers, new recombinant vaccinia viruses (GLV-1h290-292) mediating the expression of differing amounts of the tumor suppressor Klf4 by using different promoter strengths were engineered. Initial characterization of recombinant vaccinia viruses expressing Klf4 by replication assay, cell viability assay, SDS-PAGE and Western blotting, immuncytochemistry and analysis of protein functionality by qPCR and ELISA analysis for cellular beta-catenin expression, demonstrated promoter strength-dependent expression of and impact of Klf4. To further boost the effects of tumor suppressor Klf4, a vaccinia virus strain expressing Klf4 with a C-terminal fusion of the TAT transduction domain (GLV-1h391) was engineered. Treatment of HT-29 non-responder tumors in vivo with GLV-1h291 and GLV-1h391 led to significant tumor growth inhibition and improved overall survival compared to GLV-1h68. This makes the Klf4-TAT expressing GLV-1h391 a promising candidate for the treatment of colorectal cancer in man.

Peritonitis is a common disease in man, frequently caused by fungi, such as Candida albicans; however, in seldom cases opportunistic infections with Saccharomyces cerevisiae are described. Resident peritoneal macrophages (prMΦ) are the major group of phagocytic cells in the peritoneum. They express a broad range of surface pattern recognition receptors (PRR) to recognize invaders. Yeast infections are primarily detected by the Dectin-1 receptor, which triggers activation of NFAT and NF-κB pathways. The transcription of the Nfatc1 gene is directed by the two alternative promoters, inducible P1 and relatively constitutive P2 promoter. While the role of P1-directed NFATc1α-isoforms to promote survival and proliferation of activated lymphocytes is well-established, the relevance of constitutively generated NFATc1β-isoforms, mainly expressed in resting lymphocytes, myeloid and non-lymphoid cells, remains unclear. Moreover, former work at our department indicated different roles for NFATc1α- and NFATc1β-proteins in lymphocytes. Our data revealed the functional role of NFATc1 in peritoneal resident macrophages. We demonstrated that the expression of NFATc1β is required for a proper immune response of prMΦ during fungal infection-induced acute peritonitis. We identified Ccl2, a major chemokine produced in response to fungal infections by prMΦ, as a novel NFATc1 target gene which is cooperatively regulated through the NFAT- and canonical NF-κB pathways. Consequently, we showed that NFATc1β deficiency in prMΦ results in a decreased infiltration of inflammatory monocytes, leading to a delayed clearance of peritoneal fungal infection. We could further show that the expression of NFATc1β-isoforms is irrelevant for homeostasis of myeloid and adaptive immune system cells and that NFATc1α- (but not β-) isoforms are required for a normal development of peritoneal B1a cells. In contrast to the situation in myeloid cells, NFATc1β deficiency is compensated by increased expression of NFATc1α-isoforms in lymphoid cells. As a consequence, NFATc1ß is dispensable for activation of the adaptive immune system. Taken together our results illustrate the redundancy and indispensability of NFATc1-isoforms in the adaptive and innate immune system, indicating a complex regulatory system for Nfatc1 gene expression in different compartments of the immune system and likely beyond that. / Peritonitis ist eine alltägliche Erkrankung des Menschen, die häufig durch Pilze wie Candida albicans verursacht wird. In seltenen Fällen sind opportunistische Infektionen mit Saccharomyces cerevisiae beschrieben. Residente peritoneale Makrophagen (prMΦ) stellen die größte Gruppe phagozytischer Zellen im Peritoneum dar. Sie exprimieren eine Vielzahl an Oberflächenrezeptoren (PRR), mit denen sie Eindringlinge erkennen. Hefeinfektionen werden dabei vorrangig durch den Dectin-1 Rezeptor erkannt, der die Signalkaskaden von NFAT und NF-κB aktiviert. Die Transkription des Nfatc1 Gens wird von zwei Promotoren gelenkt, dem induzierbaren P1-Promotor und dem relativ konstitutiven P2-Promotor. Während die Funktionen der vom P1-Promotor erzeugten NFATc1α-Isoformen beim Überleben und der Proliferation von aktivierten Lymphozyten wohl bekannt sind, blieb die Rolle der NFATc1β-Isoformen, die vor allem in ruhenden lymphoiden, myeloiden und nicht-lymphoiden Zellen exprimiert sind, bisher ungeklärt. Unser Labor konnte zudem zeigen, dass NFATc1α- und NFATc1β- Proteine unterschiedliche Funktionen in Lymphozyten haben. Unsere Daten lassen die Funktion von NFATc1 in peritonealen Makrophagen erkennen. Wir konnten zeigen, dass während einer pilzinduzierten Peritonitis die Expression von NFATc1β für eine vollständige Immunantwort der prMΦ erforderlich ist. Wir haben Ccl2, das am stärksten von prMΦ als Antwort auf Pilzinfektionen produzierte Chemokin, als neues NFATc1 Zielgen identifiziert, welches kooperativ von den NFATc1- und NF-κB-Signalwegen reguliert wird. Folglich konnten wir zeigen, dass das Fehlen von NFATc1β in prMΦ zu einer Abnahme der eindringenden entzündlichen Monozyten führt, was eine verspätete Abwehr von peritonealen Pilzinfektionen zur Folge hat. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass die Expression von NFATc1β-Isoformen irrelevant für die Homöostase von myeloiden und adaptiven Immunzellen ist, und dass NFATc1α- (aber nicht β-) Isoformen für die normale Entwicklung von B1a-Zellen erforderlich sind. In lymphoiden Zellen wird das Fehlen von NFATc1β, im Gegensatz zur Situation in myeloiden Zellen, durch eine erhöhte Expression von NFATc1α kompensiert. Demzufolge ist NFATc1β entbehrlich für die Aktivierung des adaptiven Immunsystems. Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse die Redundanz und die Unentbehrlichkeit der NFATc1-Isoformen im adaptiven und natürlichen Immunsystem, welche auf ein komplexes regulatorisches System der Genexpression von NFATc1 in den verschiedenen Kompartimenten des Immunsystems und wahrscheinlich darüber hinaus hinweist.

Multiple Sklerose (MS) ist eine Autoimmunkrankheit, welche durch Infiltration autoreaktiver Immunzellen in das Zentrale Nervensystem (ZNS) gekennzeichnet ist. Hierbei gelten insbesondere Th1- und Th17-Zellen als wichtige Mediatoren der ZNS-Entzündungsreaktion. Beide T-Helfer-Zellarten können durch regulatorische T-Zellen (Tregs) in ihrer Funktion supprimiert werden. NFAT(Nuclear Factors of Activated T cells)-Transkriptionsfaktoren werden nach TCR-Antigen-Stimulation induziert und regeln – als pleiotrope Transkriptionsfaktoren – viele funktionelle Prozesse in T-Zellen. Um die Rolle dieser Faktoren bei der Immunpathogenese von MS zu analysieren, wurden unterschiedliche NFAT-defiziente Mausstämme auf den Krankheitsverlauf des Tiermodells Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) hin untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl der einzelne Verlust von NFATc1 und NFATc2 in CD4+ T-Zellen als auch das Fehlen einer spezifischen C-terminalen Proteinmodifikation von NFATc1, die SUMOylierung, sich abmildernd auswirkten. Der verminderte klinische Ausgang der EAE beruhte allerdings je nach knock-out auf unterschiedlichen Mechanismen. Im Fall des T-Zell-spezifischen Verlustes von NFATc1 (Nfatc1fl/fl x Cd4cre+ Mäuse), erwies sich die EAE aufgrund einer stark eingeschränkten Aktivierung und Effektorzellentwicklung von CD4+ T-Zellen als vermindert. Dies konnte durch eine reduzierte Produktion an pathogenen Effektorzytokinen, wie IFNγ, IL-17A, GM-CSF sowie IL-22 und weniger an IL-17A+ IFNγ+ Doppelproduzenten im ZNS gezeigt werden. Der Verlust von NFATc2 resultierte in einer starken Th2-Antwort im ZNS von Nfatc2-/- EAE-Mäusen einhergehend mit protektiven IL-4- und IL-10-Produzenten. Interessanterweise konnten auch mehr nicht-pathogene Th17-Zellen nachgewiesen werden. Nfatc1/CΔSUMO CD4+ T-Zellen sezernierten sowohl nach in vitro als auch nach in vivo Stimulation erhöhte Mengen von IL-2. In vitro Kulturen von Th1- und Th17-Zellen wiesen neben dieser erhöhten IL-2-Sekretion eine verminderte Produktion von IFNγ und IL-17A auf. In Übereinstimmung mit diesen in vitro Befunden zeigte sich auch in der EAE ein reduziertes Krankheitsbild mit weniger Th1- und Th17-Zellen, dafür aber eine IL-2-geförderte Erhöhung der Treg-Population. Anhand der Erkenntnis, dass NFAT-Faktoren die (Auto)-Immunreaktion entscheidend beeinflussen, könnte die Inhibition einzelner NFAT-Faktoren ein neues Ziel für eine MS-Therapie darstellen. / Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory autoimmune disease affecting the central nervous system (CNS). T helper cells, in particular Th1 and Th17 cells, are important mediators of this progress and are antagonized by regulatory T cells (Tregs). Members of the transcription factor family “Nuclear Factors of Activated T cells” (NFAT) are induced in response to TCR stimulation and act as pleiotropic regulators of T cell function. To investigate the role of single NFAT factors in the pathophysiology of MS we used several NFAT deficient mice in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), the animal model of the human disease. We could show that not only the deficiency of NFATc1 or NFATc2, but also the absence of the C-terminal (specific) SUMOylation of NFATc1 reduces the clinical severity of EAE. Regardless of a comparable influence on the disease, the reasons are distinct. In case of T cell specific loss of NFATc1 (Nfatc1fl/fl x Cd4cre+ mice) the clinical score was diminished due to impaired effector functions of CD4+ T cells lacking all NFATc1 isoforms. This was demonstrated by lower levels of pathogenic effector cytokines producing CD4+ T cells, such as IFNγ, IL-17A, GM-CSF, IL-22 producers as well as IL-17A+ IFNγ+ double producers in the CNS of Nfatc1fl/fl x Cd4cre+ mice compared to wild type siblings. Also the course of EAE in Nfatc2-/- mice was found to be ameliorated. The deficiency of NFATc2 resulted in a striking defect of CD4+ T cells in producing IFN-γ, but an enhanced immune responses with Th2-like characteristics. CD4+ T-cells in the ZNS of Nfatc2-/- EAE-diseased mice showed a profound production of protective IL-4 and IL-10 lymphokines. Interestingly, also more non-pathogenic IL-17A producers were found. CD4+ T cells from Nfatc1/CΔSUMO mice produce significantly more IL-2 in vitro and in vivo, whereas cultured Th1 and Th17 cells express less IFNγ and IL-17A, respectively. Consistently, the MOG35-55-induced EAE in Nfatc1/CΔSUMO mice revealed an ameliorated clinical disease severity compared to wild type controls with a robust IL-2-driven increase in Tregs and a reduction in effector T helper cells producing lymphokines. In summary, we could show that individual NFAT factors and their modifications play a distinct role in the pathogenesis of MS. Therefore, targeting or modulating specific NFAT factors could be a therapeutic approach to inhibit undesired NFAT functions in the respective human disease context of MS.