Les systèmes cholinergique et dopaminergique jouent un rôle prépondérant dans les fonctions cognitives. Ce rôle est exercé principalement grâce à leur action modulatrice de l’activité des neurones pyramidaux du cortex préfrontal. L’interaction pharmacologique entre ces systèmes est bien documentée mais les études de leurs interactions neuroanatomiques sont rares, étant donné qu’ils sont impliqués dans une transmission diffuse plutôt que synaptique. Ce travail de thèse visait à développer une expertise pour analyser ce type de transmission diffuse en microscopie confocale. Nous avons étudié les relations de microproximité entre ces différents systèmes dans le cortex préfrontal médian (mPFC) de rats et souris. En particulier, la densité des varicosités axonales en passant a été quantifiée dans les segments des fibres cholinergiques et dopaminergiques à une distance mutuelle de moins de 3 µm ou à moins de 3 µm des somas de cellules pyramidales. Cette microproximité était considérée comme une zone d’interaction probable entre les éléments neuronaux. La quantification était effectuée après triple-marquage par immunofluorescence et acquisition des images de 1 µm par microscopie confocale. Afin d’étudier la plasticité de ces relations de microproximité, cette analyse a été effectuée dans des conditions témoins, après une activation du mPFC et dans un modèle de schizophrénie par déplétion des neurones cholinergiques du noyau accumbens. Les résultats démontrent que 1. Les fibres cholinergiques interagissent avec des fibres dopaminergiques et ce sur les mêmes neurones pyramidaux de la couche V du mPFC. Ce résultat suggère différents apports des systèmes cholinergique et dopaminergique dans l’intégration effectuée par une même cellule pyramidale. 2. La densité des varicosités en passant cholinergiques et dopaminergiques sur des segments de fibre en microproximité réciproque est plus élevée comparé aux segments plus distants les uns des autres. Ce résultat suggère un enrichissement du nombre de varicosités axonales dans les zones d’interaction. 3. La densité des varicosités en passant sur des segments de fibre cholinergique en microproximité de cellules pyramidales, immunoúactives pour c-Fos après une stimulation visuelle et une stimulation électrique des noyaux cholinergiques projetant au mPFC est plus élevée que la densité des varicosités de segments en microproximité de cellules pyramidales non-activées. Ce résultat suggère un enrichissement des varicosités axonales dépendant de l’activité neuronale locale au niveau de la zone d'interaction avec d'autres éléments neuronaux. 4. La densité des varicosités en passant des fibres dopaminergiques a été significativement diminuée dans le mPFC de rats ayant subi une déplétion cholinergique dans le noyau accumbens, comparée aux témoins. Ces résultats supportent des interrelations entre la plasticité structurelle des varicosités dopaminergiques et le fonctionnement cortical. L’ensemble des donneès démontre une plasticité de la densité locale des varicosités axonales en fonction de l’activité neuronale locale. Cet enrichissement activité-dépendant contribue vraisemblablement au maintien d’une interaction neurochimique entre deux éléments neuronaux. / The cognitive functions of the rat medial prefrontal cortex (mPFC) are modulated by ascending modulatory systems such as the cholinergic and dopaminergic afferent systems. However, despite the well-documented pharmacological interactions between the cholinergic and dopaminergic afferents and pyramidal cells in the PFC, there is only scarce neuroanatomical data on the reciprocal interrelationships between these neuronal elements in the mPFC. This might be due to the diffuse rather than synaptic transmission mode of intercellular communication of the cholinergic system in the mPFC. For these reasons, the neuroanatomical relationships between the cholinergic and dopaminergic systems and pyramidal cells in the mPFC are examined, with an emphasis on the local density of the cholinergic and dopaminergic axon varicosities. To analyze the plasticity of these interrelationships, the two systems were examined in condition of increased neuronal activity in the mPFC, or of decrease dopaminergic activity in a model of schizophrenia. The microproximity relationships between cholinergic and dopaminergic fibers as well as with pyramidal cells were studied in the mPFC of rats and mice. In particular, the number of axon varicosities in cholinergic and dopaminergic fiber segments within 3 µm from each other or from pyramidal cells were quantified. This microproximity was considered as a possible interaction zone between two neuronal elements. Quantification was performed using triple immunofluorescence labeling and acquisition of 1 µm optic sections using confocal microscopy. To assess the plasticity of these relationships, the analysis has been performed in control condition as well as after a cortical activation or a decreased dopaminergic input in a schizophrenia model. Our results demonstrate a neuroanatomical convergence of cholinergic and dopaminergic fibers on the same pyramidal cell from layer V (output) of mPFC, suggestinggests the integration of different types of inputs by the same pyramidal cell, which may be transmitted to subcortical areas to execute prefrontal cognitive control. Close apposition between cholinergic and dopaminergic fibers could also be seen in the mPFC. There was an increase of the density of cholinergic and dopaminergic en passant varicosities on those fiber segments within microproximity of each other, compared to those outside the reciprocal microproximity, supporting functional importance of the close apposition between those two ascending neuromodulatory systems into the mPFC. There was enrichment of cholinergic en passant varicosities on the fiber segments within microproximity of c-Fos activated pyramidal cells in the mPFC of visually and HDB electrically stimulated rats, indicating association between axonal varicosity density and the local neuronal activity. There was decrease of dopaminergic en passant varicosities in the mPFC of rats with ChAT depletion in the N.Acc., compared to controls. This evidence supports the association between dopaminergic axonal varicosities and relevant neuronal activity in a complex neuronal network. This thesis shows that the density of cholinergic and dopaminergic axonal varicosity density in the mPFC is influenced by and contributes to the relevant local neuronal activity from the interactions of different transmitter systems. Such interactions of different systems in a complex and intricate prefrontal neuronal network endeavour to maintain the delicate balance for cognitive processes.

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Une sous-population des neurones à dopamine (DA) du mésencéphale ventral du rat et de la souris étant connue pour exprimer l'ARN messager du transporteur vésiculaire 2 du glutamate (VGLUT2), nous avons eu recours à l'immunocytochimie en microscopie électronique, après simple ou double marquage de l'enzyme de synthèse tyrosine hydroxylase (TH) et de VGLUT2, pour déterminer la présence de l'une et/ou l'autre protéine dans les terminaisons (varicosités) axonales de ces neurones et caractériser leur morphologie ultrastructurale dans diverses conditions expérimentales. Dans un premier temps, des rats jeunes (P15) ou adultes (P90), ainsi que des rats des deux âges soumis à l'administration intraventriculaire cérébrale de la cytotoxine 6-hydroxydopamine (6-OHDA) dans les jours suivant la naissance, ont été examinés, afin d'étayer l'hypothèse d'un rôle de VGLUT2 au sein des neurones DA, au cours du développement normal ou pathologique de ces neurones. Chez le jeune rat, ces études ont montré: i) la présence de VGLUT2 dans une fraction importante des varicosités axonales TH immunoréactives du coeur du noyau accumbens ainsi que du néostriatum; ii) une augmentation de la proportion de ces terminaisons doublement marquées dans le noyau accumbens par suite de la lésion 6-OHDA néonatale; iii) le double marquage fréquent des varicosités axonales appartenant à l'innervation DA aberrante (néoinnervation), qui se développe dans la substance noire, par suite de la lésion 6-OHDA néonatale. Des différences significatives ont aussi été notées quant à la dimension des terminaisons axonales marquées pour la TH seulement, VGLUT2 seulement ou TH et VGLUT2. Enfin, à cet âge (P15), toutes les terminaisons doublement marquées sont apparues dotées d'une spécialisation membranaire synaptique, contrairement aux terminaisons marquées pour la TH ou pour VGLUT2 seulement. Dans un deuxième temps, nous avons voulu déterminer le devenir du double phénotype chez le rat adulte (P90) soumis ou non à la lésion 6-OHDA néonatale. Contrairement aux observations recueillies chez le jeune rat, nous avons alors constaté: i) l'absence complète de terminaisons doublement marquées dans le coeur du noyau accumbens et le néostriatum d'animaux intacts, de même que dans les restes de la substance noire des animaux 6-OHDA lésés; ii) une très forte baisse de leurnombre dans le coeur du noyau accumbens des animaux 6-OHDA lésés. Ces observations, suggérant une régression du double phénotype TH/VGLUT2 avec l'âge, sont venues renforcer l'hypothèse d'un rôle particulier d'une co-libération de glutamate par les neurones mésencéphaliques DA au cours du développement. Dans ces conditions, il est apparu des plus intéressants d'examiner l'innervation DA méso-striatale chez deux lignées de souris dont le gène Vglut2 avait été sélectivement invalidé dans les neurones DA du cerveau, ainsi que leurs témoins et des souris sauvages. D'autant que malgré l'utilisation croissante de la souris en neurobiologie, cette innervation DA n'avait jamais fait l'objet d’une caractérisation systématique en microscopie électronique. En raison de possibles différences entre le coeur et la coque du noyau accumbens, l'étude a donc porté sur les deux parties de ce noyau ainsi que le néostriatum et des souris jeunes (P15) et adultes (P70-90) de chaque lignée, préparées pour l'immunocytochimie de la TH, mais aussi pour le double marquage TH et VGLUT2, selon le protocole précédemment utilisé chez le rat. Les résultats ont surpris. Aux deux âges et quel que soit le génotype, les terminaisons axonales TH immunoréactives des trois régions sont apparues comparables quant à leur taille, leur contenu vésiculaire, le pourcentage contenant une mitochondrie et une très faible incidence synaptique (5% des varicosités, en moyenne). Ainsi, chez la souris, la régression du double phénotype pourrait être encore plus précoce que chez le rat, à moins que les deux protéines ne soient très tôt ségréguées dans des varicosités axonales distinctes des mêmes neurones DA. Ces données renforcent aussi l’hypothèse d’une transmission diffuse (volumique) et d’un niveau ambiant de DA comme élément déterminant du fonctionnement du système mésostriatal DA chez la souris comme chez le rat. / Knowing that a subset of rat and mouse mesencephalic dopamine (DA) neurons expresses the mRNA of the vesicular glutamate transporter type 2 (VGLUT2), we used electron microscopic immunocytochemistry, after single or double labeling of the biosynthetic enzyme tyrosine hydroxylase (TH) and of VGLUT2, to determine the presence of one and/or both proteins in axon terminals (varicosities) of these neurons and characterize their ultrastructural morphology under various experimental conditions. At first, young (P15) or adult (P90) rats, subjected or not to cerebro-ventricular administration of the cytotoxin 6-hydroxydopamine (6-OHDA) a few days after birth, were examined in order to investigate the role of VGLUT2 in DA neurons during normal and pathological development of these neurons. In the young rats, these studies revealed: i) the presence of VGLUT2 in a significant fraction of TH immunoreactive varicosities in the core of the nucleus accumbens and the neostriatum; ii) an increase in the proportion of dually labeled terminals in the nucleus accumbens following neonatal 6-OHDA lesion; iii) frequent double labeling of TH varicosities belonging to the aberrant DA innervation (neoinnervation) which develops in the substantia nigra following neonatal 6-OHDA lesion. Significant differences were also noted in the size of the axon terminals labeled for TH only, VGLUT2 only, or TH and VGLUT2. Finally, at this age (P15), all the dually labeled terminals appeared equipped with a synaptic membrane specialization, unlike the terminals labeled for TH or for VGLUT2 only. In a second step, we sought to determine the fate of the dual phenotype in adult rats (P90) subjected or not to the neonatal 6-OHDA lesion. In contrast with the observations made in young rats, we found: i) a complete absence of dually labeled terminals in the core of the nucleus accumbens and striatum of intact animals, as well as in the remains of the substantia nigra after neonatal 6-OHDA lesion; ii) a sharp decline of their number in the core of the nucleus accumbens of 6-OHDA-lesioned animals. These findings, suggesting a regression of the dual TH/VGLUT2 phenotype with age, reinforced the hypothesis of a specific role of the co-release of glutamate from midbrain DA neurons during development. Under these conditions, it was of considerable interest to examine the DA meso-striatal innervation in two strains of mice whose Vglut2 gene has been selectively invalidated in DA neurons, as well as in their control littermates and wild-type mice. This issue was particularly relevant with the increasing use of genetically modified mice in neurobiology; indeed, this DA innervation had never been systematically characterized by electron microscopy. Because of possible differences between the core and shell of the nucleus accumbens, the study included both parts of this nucleux as well as the striatum of young (P15) and adult (P70-90) mice of each strain, prepared for TH immunocytochemistry, and also for double labeling of TH and VGLUT2, according to the protocol previously used in rats. The results were surprising. At both ages, regardless of the genotype, the TH immunoreactive axon terminals of the three regions appeared comparable in size, vesicle content, percent with mitochondria, and exceeding low frequency of synaptic membrane specialization (5% of varicosities, on average). Thus, in mice, the regression of the dual phenotype might be even more precocious than in rats, unless the two proteins are segregated very early in different axon terminals of the same DA neurons. These data also strenghten the hypothesis of a diffuse (volume) transmission and of an ambient level of DA as determinant elements in the functioning of the meso-striatal DA system in mice as well as rats.

Une sous-population des neurones à dopamine (DA) du mésencéphale ventral du rat et de la souris étant connue pour exprimer l'ARN messager du transporteur vésiculaire 2 du glutamate (VGLUT2), nous avons eu recours à l'immunocytochimie en microscopie électronique, après simple ou double marquage de l'enzyme de synthèse tyrosine hydroxylase (TH) et de VGLUT2, pour déterminer la présence de l'une et/ou l'autre protéine dans les terminaisons (varicosités) axonales de ces neurones et caractériser leur morphologie ultrastructurale dans diverses conditions expérimentales. Dans un premier temps, des rats jeunes (P15) ou adultes (P90), ainsi que des rats des deux âges soumis à l'administration intraventriculaire cérébrale de la cytotoxine 6-hydroxydopamine (6-OHDA) dans les jours suivant la naissance, ont été examinés, afin d'étayer l'hypothèse d'un rôle de VGLUT2 au sein des neurones DA, au cours du développement normal ou pathologique de ces neurones. Chez le jeune rat, ces études ont montré: i) la présence de VGLUT2 dans une fraction importante des varicosités axonales TH immunoréactives du coeur du noyau accumbens ainsi que du néostriatum; ii) une augmentation de la proportion de ces terminaisons doublement marquées dans le noyau accumbens par suite de la lésion 6-OHDA néonatale; iii) le double marquage fréquent des varicosités axonales appartenant à l'innervation DA aberrante (néoinnervation), qui se développe dans la substance noire, par suite de la lésion 6-OHDA néonatale. Des différences significatives ont aussi été notées quant à la dimension des terminaisons axonales marquées pour la TH seulement, VGLUT2 seulement ou TH et VGLUT2. Enfin, à cet âge (P15), toutes les terminaisons doublement marquées sont apparues dotées d'une spécialisation membranaire synaptique, contrairement aux terminaisons marquées pour la TH ou pour VGLUT2 seulement. Dans un deuxième temps, nous avons voulu déterminer le devenir du double phénotype chez le rat adulte (P90) soumis ou non à la lésion 6-OHDA néonatale. Contrairement aux observations recueillies chez le jeune rat, nous avons alors constaté: i) l'absence complète de terminaisons doublement marquées dans le coeur du noyau accumbens et le néostriatum d'animaux intacts, de même que dans les restes de la substance noire des animaux 6-OHDA lésés; ii) une très forte baisse de leurnombre dans le coeur du noyau accumbens des animaux 6-OHDA lésés. Ces observations, suggérant une régression du double phénotype TH/VGLUT2 avec l'âge, sont venues renforcer l'hypothèse d'un rôle particulier d'une co-libération de glutamate par les neurones mésencéphaliques DA au cours du développement. Dans ces conditions, il est apparu des plus intéressants d'examiner l'innervation DA méso-striatale chez deux lignées de souris dont le gène Vglut2 avait été sélectivement invalidé dans les neurones DA du cerveau, ainsi que leurs témoins et des souris sauvages. D'autant que malgré l'utilisation croissante de la souris en neurobiologie, cette innervation DA n'avait jamais fait l'objet d’une caractérisation systématique en microscopie électronique. En raison de possibles différences entre le coeur et la coque du noyau accumbens, l'étude a donc porté sur les deux parties de ce noyau ainsi que le néostriatum et des souris jeunes (P15) et adultes (P70-90) de chaque lignée, préparées pour l'immunocytochimie de la TH, mais aussi pour le double marquage TH et VGLUT2, selon le protocole précédemment utilisé chez le rat. Les résultats ont surpris. Aux deux âges et quel que soit le génotype, les terminaisons axonales TH immunoréactives des trois régions sont apparues comparables quant à leur taille, leur contenu vésiculaire, le pourcentage contenant une mitochondrie et une très faible incidence synaptique (5% des varicosités, en moyenne). Ainsi, chez la souris, la régression du double phénotype pourrait être encore plus précoce que chez le rat, à moins que les deux protéines ne soient très tôt ségréguées dans des varicosités axonales distinctes des mêmes neurones DA. Ces données renforcent aussi l’hypothèse d’une transmission diffuse (volumique) et d’un niveau ambiant de DA comme élément déterminant du fonctionnement du système mésostriatal DA chez la souris comme chez le rat. / Knowing that a subset of rat and mouse mesencephalic dopamine (DA) neurons expresses the mRNA of the vesicular glutamate transporter type 2 (VGLUT2), we used electron microscopic immunocytochemistry, after single or double labeling of the biosynthetic enzyme tyrosine hydroxylase (TH) and of VGLUT2, to determine the presence of one and/or both proteins in axon terminals (varicosities) of these neurons and characterize their ultrastructural morphology under various experimental conditions. At first, young (P15) or adult (P90) rats, subjected or not to cerebro-ventricular administration of the cytotoxin 6-hydroxydopamine (6-OHDA) a few days after birth, were examined in order to investigate the role of VGLUT2 in DA neurons during normal and pathological development of these neurons. In the young rats, these studies revealed: i) the presence of VGLUT2 in a significant fraction of TH immunoreactive varicosities in the core of the nucleus accumbens and the neostriatum; ii) an increase in the proportion of dually labeled terminals in the nucleus accumbens following neonatal 6-OHDA lesion; iii) frequent double labeling of TH varicosities belonging to the aberrant DA innervation (neoinnervation) which develops in the substantia nigra following neonatal 6-OHDA lesion. Significant differences were also noted in the size of the axon terminals labeled for TH only, VGLUT2 only, or TH and VGLUT2. Finally, at this age (P15), all the dually labeled terminals appeared equipped with a synaptic membrane specialization, unlike the terminals labeled for TH or for VGLUT2 only. In a second step, we sought to determine the fate of the dual phenotype in adult rats (P90) subjected or not to the neonatal 6-OHDA lesion. In contrast with the observations made in young rats, we found: i) a complete absence of dually labeled terminals in the core of the nucleus accumbens and striatum of intact animals, as well as in the remains of the substantia nigra after neonatal 6-OHDA lesion; ii) a sharp decline of their number in the core of the nucleus accumbens of 6-OHDA-lesioned animals. These findings, suggesting a regression of the dual TH/VGLUT2 phenotype with age, reinforced the hypothesis of a specific role of the co-release of glutamate from midbrain DA neurons during development. Under these conditions, it was of considerable interest to examine the DA meso-striatal innervation in two strains of mice whose Vglut2 gene has been selectively invalidated in DA neurons, as well as in their control littermates and wild-type mice. This issue was particularly relevant with the increasing use of genetically modified mice in neurobiology; indeed, this DA innervation had never been systematically characterized by electron microscopy. Because of possible differences between the core and shell of the nucleus accumbens, the study included both parts of this nucleux as well as the striatum of young (P15) and adult (P70-90) mice of each strain, prepared for TH immunocytochemistry, and also for double labeling of TH and VGLUT2, according to the protocol previously used in rats. The results were surprising. At both ages, regardless of the genotype, the TH immunoreactive axon terminals of the three regions appeared comparable in size, vesicle content, percent with mitochondria, and exceeding low frequency of synaptic membrane specialization (5% of varicosities, on average). Thus, in mice, the regression of the dual phenotype might be even more precocious than in rats, unless the two proteins are segregated very early in different axon terminals of the same DA neurons. These data also strenghten the hypothesis of a diffuse (volume) transmission and of an ambient level of DA as determinant elements in the functioning of the meso-striatal DA system in mice as well as rats.