A digestão nos insetos ocorre no intestino médio de forma compartimentada. A digestão inicial dos polímeros ocorre no interior da membrana peritrófica. Os oligômeros resultantes difundem-se para o espaço luminal exterior à membrana peritrófica onde são atacados por outras enzimas. Na digestão final os dímeros resultantes são hidrolisados por enzimas imobilizadas na superfície do epitélio do intestino médio. Após o processo de digestão final os monômeros são absorvidos pelas células do epitélio intestinal. Os Díptera ditos superiores, incluindo a mosca doméstica, apresentam peculiaridades digestivas que aparentemente resultam de adaptações para digerir uma dieta que consiste principalmente de bactérias. No ventrículo anterior ocorre uma diminuição no conteúdo de amido do bolo alimentar. Na porção seguinte, o bolo alimentar passa para o ventrículo médio onde as bactérias são mortas pela ação combinada de baixo pH, uma lisozima digestiva e uma proteinase tipo catepsina D. O material liberado das bactérias é digerido no ventrículo posterior, como ocorre no ventrículo inteiro da maioria dos insetos de outros grupos taxonômicos. Com o objetivo de compreender a peculiar digestão em Musca domestica, foram utilizadas suas larvas para identificar funcionalmente as regiões absortivas de nutrientes, identificar as moléculas envolvidas na absorção de nutrientes, identificar as moléculas envolvidas com tamponamento e fluxos de fluidos intestinais, sequenciar as enzimas digestivas principais e identificar os seus sítios de secreção. Experimentos fisiológicos de absorção de glicose e análises de atividade enzimática permitiram acessar de maneira direta os aspectos da digestão. Contudo, experimentos de sequenciamento de bibliotecas de cDNA, análise de sequências transcritas e verificação de expressão de genes em diferentes tecidos foram abordagens fundamentais na identificação das moléculas subjacentes aos processos fisiológicos intestinas de Musca domestica. Os indícios de que absorção de glicose no intestino de Musca domestica se dê por transportadores do tipo SGLT, com a possível participação de facilitadores do tipo GLUT, permitem estabelecer um foco para futuros estudos. A descrição de sequências relacionadas ao tamponamento intestinal permitiu ampliar a discussão sobre tal processo. Ao detalhar os sítios de expressão da subunidade a da V-ATPase, do canal de cloreto e do transportador de amônia foi possível testar o modelo de tamponamento proposto anteriormente e propor a participação de outras moléculas no processo. Sequências correspondentes as atividades de carboxipeptidase, maltase e aminopeptidase descritas na literatura foram pesquisadas, gerando sequências candidatas a codificarem as referidas enzimas. Com isso, é possível descrever a digestão de oligômeros e dímeros com base nos genes transcritos e nas sequências de aminoácidos que formam as enzimas digestivas. A descoberta da sequência que transcreve uma metaloproteinase, por sua vez, abre caminhos para a descrição e caracterização de sua atividade proteolítica nos tecidos digestivos da larva de Musca domestica. Essa análise permitiu também elucidar a localização dos sítios de expressão e, portanto, as zonas de secreção de enzimas. De maneira geral, este estudo contribuiu para a compreensão de diversos aspectos da digestão de Musca domestica, elucidando questões da particular fisiologia digestiva desse inseto. / Digestion in insects occurs in the midgut in a compartmentalized way. Initial digestion takes place inside the peritrophic membrane. The resulting oligomers diffuse into the luminal space outside the peritrophic membrane where they are hydrolyzed by other enzymes. In the final digestion, the resulting dimers are hydrolyzed by enzymes immobilized on the midgut epithelium. After the final digestion, the monomers are absorbed by intestinal epithelial cells. The so-called higher Diptera, including the house fly, have digestive peculiarities apparently resulting of adaptations to digest a diet consisting mainly of bacteria. In the anterior midgut there is a decrease in the starch content of the food bolus. The bolus now passes into the middle midgut, where bacteria are killed by the combined action of low pH, a special lysozyme and a cathepsin D-like proteinase. Finally, the material released by bacteria is digested in the posterior midgut, as is observed in the whole midgut of insects of other taxa. In order to understand the peculiar digestion in Musca domestica, the larvae were used to identify (a) the functionally the nutrient absorptive regions, (b) the molecules involved in the absorption of nutrients, (c) the molecules involved in buffering and fluid flows, (d) the cDNA sequences corresponding to intestinal digestive enzymes, (e) the main sites of secretion. Physiological experiments of glucose absorption and enzyme activity analysis allowed a direct access to aspects of digestion. Otherwise, cDNA library sequencing followed by sequence annotation and tissue-specific expression analysis were fundamental approaches in the understanding of intestinal physiology of Musca domestica. Evidence that glucose absorption in the gut of Musca domestica occurs through SGLT-like transporters, with the possible participation of facilitators GLUT-like, allowed us to establish a focus for future studies. The description of cDNA sequences corresponding to proteins putatively responsible for intestinal buffering widened the discussion of this process. The finding of the expression sites of V-ATPase subunits, chloride channel, and ammonia transporter led to revising the present buffering model and the inclusion of other molecules in the process. The cDNA sequences corresponding to the activities of carboxypeptidase, aminopeptidase and maltase described in the literature were searched for as candidate sequences to encode those enzymes. This made it possible to describe the digestion of oligomers and dimers based on transcribed genes and enzyme amino acid sequences. The discovery of the metalloproteinase transcribing sequence opened a new research line: the description and characterization of its proteolytic activity in the midgut of the Musca domestica larvae. This study also allowed elucidating the location of digestive enzyme expression sites and, therefore, the putative zones of enzyme secretion. Overall, this study contributed to understanding many aspects of digestion of Musca domestica, clarifying aspects of the peculiar digestive physiology of this insect.

O parálogo 3 do trocador Na+/H+ (NHE3) é essencial para a reabsorção de HCO3- nos túbulos proximais renais e sua expressão e função adaptam-se às diferentes condições ácido-base do organismo. O objetivo desta tese foi avaliar quais as diferenças entre os efeitos da acidose metabólica (AM) e respiratória (AR) sobre a regulação do NHE3 e identificar variáveis responsáveis pelas respostas adaptativas observadas. Em células OKP, a AM foi simulada diminuindo a [HCO3-] do meio de cultura e a AR aumentando a pCO2 ambiente por 24 h. Foram observados os efeitos das acidoses sobre o RNAm-Nhe3, a presença da proteína-NHE3 na membrana celular e a atividade promotora do gene do Nhe3. Concluiu-se que o pH extracelular não é a variável físico-química responsável por estimular a expressão do NHE3, contudo é um importante candidato à variável responsável por regular o tráfego da proteína para a membrana. Além disso, a região de -471 a -153 pb em relação ao sítio de início de transcrição do promotor do gene do Nhe3 contém prováveis reguladores positivos que atuam em resposta à AM. / The Na+/H+ exchanger 3 (NHE3) is essential for HCO3- reabsorption in renal proximal tubules and its expression and function must adapt to acid-base conditions. The goal of the presente study was to evaluate whether there are differences between metabolic (MA) and respiratory acidosis (RA) with regard to NHE3 modulation and to identify variables that may trigger these distinct adaptive responses. In OKP cells, MA was achieved by lowering [HCO3-] in the cell culture medium and RA by increasing pCO2 in the incubator chamber for 24 h. The effects of both acidosis on Nhe3 mRNA levels, cell-surface NHE3 expression and promoter activity were evaluated. In summary, it was concluded that low extracellular pH is not the physical-chemical variable that up-regulates NHE3 expression, however, extracellular pH is a candidate for the variable related to the NHE3 displacement to the apical membrane. Moreover, the Nhe3 gene promoter region spanning from -471 to -153 base pairs upstream from the transcriptional start site contains putative enhancers regulated in response to MA.

O A. fumigatus é um fungo saprofítico e tornou-se um dos principais agente patogênico oportunista em pacientes imunossuprimidos. Estudos prévios em nosso laboratório foi demonstrado que em mitocôndrias de P. brasiliensis e de A. fumigatus, o NAD+ era capaz de induzir a formação de potencial de membrana mitocondrial, o qual podia ser dissipado por FCCP, sugerindo a presença de um transportador de NAD+/NADH, conforme havia sido descrito em S. cerevisiae. Através de ferramentas de bioinformática, foi identificado no Aspergillus Gene Database, uma sequência com 32% de identidade com o gene ndt1p de S. cerevisiae. A sequência de cDNA, contendo 1.194 pb foi obtida usando PCR-Overlaping e clonada em vetor pGEM®-T Easy. Em seguida, a sequência foi subclonada em vetor de expressão pET28-a(+) e expressa em E. coli BL21(DE3). A proteína recombinante foi purificada a partir dos corpos de inclusão e sua identidade confirmada por espectrometria de massas e por Western Blotting usando anticorpo anti-His-tag. A proteína recombinante foi utilizada para produção de anticorpo policlonal anti-Ndt1 em coelho. Para expressão em levedura, o cDNA do gene ndt1 de A. fumigatus foi subclonado em vetor pYES2 e as leveduras S. cerevisiae ?ndt1?ndt2 foram transformadas. Foi realizada a curva de crescimento e indução da expressão da proteína recombinante Ndt1, a presença da proteína foi detectada utilizando anticorpo policlonal anti-Ndt1 após 16 horas de expressão. Nesse período foi verificado que as leveduras estavam em fase de crescimento exponencial. A cepa duplo mutante apresenta uma taxa de crescimento menor quando comparada com a cepa expressando a proteína recombinante quando crescidas em meio fermentável. As mitocôndrias isoladas de ambas as cepas foram submetidas à medida do potencial de membrana onde apresentavam acoplamento entre a oxidação de substratos e a fosforilação oxidativa. Além disso, ficou evidenciado que na cepa expressando a proteína recombinante, NAD+ induziu a formação de um potencial de membrana maior que na cepa controle. O transporte de NAD+ foi realizado e demonstrou que a cepa expressando a proteína Ndt1 tinha um aumento na fluorescência de NADH, mostrando que NAD+ foi capaz de entrar na matriz mitocondrial e posteriormente ser reduzido a NADH por enzimas da matriz mitocondrial. A determinação da produção de espécies reativas de oxigênio foi realizada utilizando as sondas fluorescentes CM-H2DCFDA e MitoSox Red em esferoplastos da levedura S. cerevisiae. Ambos experimentos não houve diferença significativa entre a cepa expressando a proteína Ndt1 e a cepa controle. As proteínas carboniladas foram determinadas utilizando anticorpo anti-DNP, após a reação com dinitrofenilhidrazona e não há diferença significativa entre as cepas. Finalmente, para confirmação da localização celular da proteína Ndt1, os esferoplastos de S. cerevisiae foram submetidos à microscopia confocal, onde ficou evidenciado a co-localização da proteína Ndt1 com as mitocôndrias na cepa de S. cerevisiae transformada com a construção pYES/ndt1, o mesmo perfil não foi observado na cepa ?ndt1?ndt2. / The A. fumigatus is a saprophytic fungus and is a major opportunistic pathogen in immunosuppressed patients. Previous studies in our lab has showed that mitochondrias of the P. brasiliensis and A. fumigatus, NAD+ is able to induce the formation of mitochondrial membrane potential, which could be dissipated by FCCP, suggesting the presence of a NAD+/NADH carrier as described in S. cerevisiae. Using bioinformatics tools, it was identified in Aspergillus Gene database a sequence containing 32% of identity with the gene ndt1p of S. cerevisiae. A fragment of cDNA was obtained from the ndt1p mRNA sequence, containing 1194 bp by using PCR-overlaping and cloned in pGEM®-T Easy vector. Then, the sequence was subcloned in pET28-a(+) vector and expressed in E. coli BL21 (DE3). The recombinant protein was purified from inclusion bodies and the identity confirmed by mass spectrometry and by Western Blotting using anti-His-tag antibody. The recombinant protein was used to produce polyclonal antibody anti-Ndt1 in rabbit. For expression in yeast, the ndt1 cDNA of A. fumigatus was subcloned into pYES2 vector and the yeast S. cerevisiae ?ndt1?ndt2 were transformed. Growth curve and induction of the recombinant protein expression Ndt1 was performed and the protein was detected using a polyclonal anti-Ndt1 antibody after 16 hours of expression. During this period it was found that the yeast were in exponential growth phase. The double mutant strain shows a slower growth rate compared to the strain expressing the recombinant protein growth rate when grown in fermentable medium. The isolated mitochondria from both strains were subjected to measurement of the membrane potential which showed coupling between substrate oxidation and oxidative phosphorylation. Furthermore, these measurements evidenced that the strain expressing the recombinant protein NAD+ induced the formation of a membrane potential larger than the control strain. The transport NAD+ was evaluated and showed that the strain expressing the protein Ndt1 has an increase in NADH fluorescence, indicating that NAD+ was able to enter into the mitochondrial matrix and then reduced to NADH by enzymes from the matrix. The determination of the production of reactive oxygen species was performed using the fluorescent probe CM-H2DCFDA and MitoSox Red in spheroplasts of the yeast S. cerevisiae. Both experiments showed no significant difference between the strain expressing Ndt1 protein and strain control. The carbonylated proteins levels were checked using anti-DNP, after the reaction with dinitrophenylhydrazone and there is no significant difference between the strains. Finally, to confirm the cellular localization of the protein Ndt1, spheroplasts of S. cerevisiae were subjected to confocal microscopy, which evidenced the co-location of Ndt1 protein with mitochondria in S. cerevisiae strain transformed with the construction pYES/ndt1. This same profile was not observed in strain ?ndt1?ndt2.

A creatina (Cr) é uma reserva de fosfato de alta energia, sendo a fonte mais rápida de restauração do ATP intracelular. O hormônios tireoideano participa de forma importante na manutenção da taxa metabólica, aumentando a síntese e consumo de ATP, por meio da regulação de diferentes genes-alvo. Neste sentido, avaliamos o efeitos do HT sobre a expressão gênica do transportador de Cr nos músculos esqueléticos e cardíaco de ratos. O tratamento com o hormônio regula estes processos, porém de forma distinta nos diferentes tipos de músculos. / Creatine (Cr) is a high-energy phosphate reservoir and the fastest source for intracellular ATP regeneration. The thyroid hormone plays a key role on the maintenance of basal metabolic rate, increasing the synthesis and the degradation of ATP through regulation of target-genes. In this study, we explore the effects of thyroid hormone on Cr transporter gene expression and regulation of intracellular pool of Cr in skeletal and cardiac muscles in rats. The hormone can regulate these processes in distinct ways in different muscle types.

Orientador: Dirlei Antonio Berto / Resumo: O estudo foi conduzido com o objetivo de avaliar os efeitos do uso de palatabilizantes em dietas de leitões recém-desmamados sobre a preferência alimentar, desempenho, glicose sanguínea, morfometria e expressão gênica intestinal do co-transportador 1 da glicose sódio dependente (SGLT1). Para isso foram realizados seis experimentos (E1 a E6), em que nos E1, E3, E4 e E5 foram utilizados 32 leitões cada, com média de 21 dias de idade para avaliação de preferência alimentar das seguintes dietas: E1 - dieta sem palatabilizante, dieta com 5% de açúcar, dieta com 0,025% de sacarina sódica e dieta com 0,025% de palatabilizante a base de sacarina sódica e neotame; E3 - dieta referência sem palatabilizante e dietas referências com inclusão de 0,015, 0,025 ou 0,035% de sacarina sódica; E4 - dieta referência sem palatabilizante e dietas referências com inclusão de 0,015, 0,025 ou 0,035% de sacarina sódica associada a neotame e E5 - dieta sem palatabilizante, dieta com 5% de açúcar, dieta com 0,035% de sacarina sódica e dieta com 0,035% de palatabilizante a base de sacarina sódica e neotame. No E2 foram utilizados 120 animais dos 35 aos 62 dias de idade, que foram submetidos aos mesmos tratamentos do E1 para avaliar o desempenho e glicose sanguínea e no E6 foram utilizados 32 leitões com média de 23 dias de idade para avaliação da morfometria intestinal e expressão gênica do SGLT1, com os mesmos tratamentos do E5. No E1 e E5 os animais apresentaram preferência pela dieta contendo a inclus... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of the study was to evaluate the effects from sweeteners inclusions on weaned piglets diets on diet preference, performance, blood glucose, morphometry and intestinal gene expression of sodium/glucose co-transporter 1 (SGLT1). Six experiments were performed (E1 to E6). In E1, E3, E4 and E5 32 piglets were used in each experiment, averaging 21 days of age. Diet preference was evaluated for the following diets: E1 - diet without sweetener, diet with 5% sugar, diet with 0.025% of sodium saccharin and diet with 0.025% of sweetener based on sodium saccharin and neotame; E3 - diet without sweetener and diets with 0.015, 0.025 or 0.035% of sodium saccharin; E4 - diet without sweetener and diets with 0.015, 0.025 or 0.035% of sodium saccharin associated with neotame and E5 - diet without sweetener, diet with 5% sugar, diet with 0.035% of sodium saccharin and diet with 0.035% of sodium saccharin and neotame. In E2, 120 animals aged 35 to 62-d were used and performance and blood glucose were evaluated using the same treatments described for E1 and. In E6, 32 23-d old piglets were used to evaluate intestinal morphometry and gene expression of SGLT1, with the same treatments as E5. In E1 and E5, the animals showed preference for the diet containing 5% sugar. In E3 the animals presented preference for the diet containing 0.035% inclusion of sodium saccharin. There was no difference for the other parameters evaluated. / Mestre

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-04-02T13:00:25Z No. of bitstreams: 1 AdolfoLopesDeFigueredo_DISSERT.pdf: 1684722 bytes, checksum: ef8ee8ddf2d878e79c97573773aa969e (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-04-04T16:28:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 AdolfoLopesDeFigueredo_DISSERT.pdf: 1684722 bytes, checksum: ef8ee8ddf2d878e79c97573773aa969e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-04T16:28:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AdolfoLopesDeFigueredo_DISSERT.pdf: 1684722 bytes, checksum: ef8ee8ddf2d878e79c97573773aa969e (MD5) Previous issue date: 2016-01-29 / Tecnologias existentes para a captura e sequestro de CO2 tornam o processo muitas vezes invi?vel industrialmente, pois exige um alto consumo de energia, levando a uma redu??o na efici?ncia da planta e aumentando o custo de produ??o. Por isso, a fim de amenizar a emiss?o de gases de efeito estufa, tem-se focado na utiliza??o de energias alternativas e no aumento da efici?ncia na convers?o e utiliza??o de energia. Recircula??o Qu?mica para Combust?o (RQC) e reforma (RQR) est?o entre as melhores alternativas para reduzir a emiss?o de CO2, pois facilitam sua captura com baixo custo e sem perda de efici?ncia energ?tica substancial. O sistema reacional baseia-se na transfer?ncia de oxig?nio do ar para um combust?vel, atrav?s de um transportador s?lido de oxig?nio (TSO) que circula entre dois reatores de leito fluidizado. As rea??es de combust?o ocorrem na superf?cie dos TSO, sendo este, quest?o chave para o desenvolvimento e dimensionamento da tecnologia de RQC. Tendo em vista que ainda h? a necessidade de se estudar o comportamento dos TSOs a fim de obter um transportador adequado para a tecnologia de recircula??o qu?mica, o presente trabalho teve como objetivo realizar um estudo dos TSOs para RQC e RQR, utilizando hidrog?nio, metano e etanol como combust?vel. Dois TSOs, ? base de Ni e Cu, foram avaliados quanto as suas reatividades, bem como o estudo termodin?mico foi realizado para esse processo. Para esse estudo, uma caracteriza??o do TSO ? base de Cu, foi realizada utilizando diferentes concentra??es m?ssicas de Cu. Os resultados mostraram que o aumento da concentra??o de cobre a ser adicionado no suporte diminuiu o tamanho dos poros provocado por uma aglomera??o do metal ativo, restando apenas um percentual na superf?cie. Mudan?as significativas na temperatura de redu??o n?o foram observadas com o a aumento da concentra??o de Cu. Em geral, todos os TSO ? base de Cu atingiram convers?o m?xima, utilizando etanol como combust?vel, mostrando ser bastante reativos. Verificou-se ainda que quanto maior o teor de ?xido met?lico, menor ? a velocidade de rea??o. Para as baixas concentra??es de adi??o de cobre, o modelo de nuclea??o apresentou melhor descri??o dos dados experimentais. J? para as maiores concentra??es de adi??o de cobre e com adi??o de 1% de c?rio, o modelo shrinking core correlacionou melhor os dados experimentais. Com rela??o ao sistema redox CuO/Cu, observou-se que valores altos da constante de equil?brio (Keq) foram obtidos para as temperaturas investigadas, mostrando que a convers?o praticamente completa dos combust?veis ? obtida. O aumento da temperatura provocou uma diminui??o da Keq, por?m altas temperaturas foram necess?rias para a completa redu??o do TSO. A varia??o da energia de Gibbs foi m?nima para as temperaturas relevantes para RQC, indicando que a rea??o de combust?o ocorre de maneira espont?nea. Para o TSO ? base de Ni, amostras comerciais foram utilizadas. Este mostrou ser bem reativo, apresentando convers?es superiores a 90% utilizando como combust?veis H2 e CH4 e CH4 + H2O. Temperaturas altas, em torno de 900 ?C foram necess?rias para uma alta convers?o. O modelo shrinking core obteve uma boa descri??o dos dados experimentais, apresentando baixo erro para convers?es menores que 0,8, enquanto que o modelo de difus?o descreveu melhor os dados experimentais com convers?es superiores a 0,8. / Existing technologies for CO2 capture and sequestration oftentimes make the process industrially infeasible because it demands a high power consumption, leading to a reduction in plant efficiency and increasing the cost of production. Therefore, in order to mitigate the emission of greenhouse gases, has focused on the use of alternative energy and increased efficiency in conversion and use of energy. Chemical Looping Combustion (CLC) and Reform (CLR) are among the best alternatives to reduce CO2 emissions, because they facilitate his capture with low cost and without substantial loss of energy efficiency. The reaction system is based on oxygen transfer on the air into a fuel through a solid oxygen carrier (SOC) which circulates between two fluidized bed reactors. Combustion reactions occur on the surface of the SOC, which is, key issue for the development and sizing from CLC technology. In view of that there is still the necessity of study the behavior of SOCs in order to obtain a suitable carrier for the chemical looping technology, this work had as objective carry out a study of the SOCs for CLC and CLR using hydrogen, methane and ethanol as fuels. Two SOCs, to the based on Ni and Cu, were assessed according their reactivities, as well as the thermodynamic study was performed for this process. For this study, an characterization of SOC to Cu base was perfomed different mass concentrations of Cu. The results showed that the concentration of copper to be added to the support decreased size pore inflict on by sintering of the active metal, leaving only a percentage at the surface. Significant changes in the reduction temperature were not observed with the increase in Cu concentration. In general, all the SOC to Cu base reached maximum conversion using ethanol as fuel, showing to be quite reactive. It was also found that the higher the metal oxide content, the lower the reaction rate. For the addition of low concentrations of copper, the nucleation model showed better description of the experimental data. Already for the higher concentrations of copper addition and with addition of 1% cerium, the shrinking core model correlated better to experimental data. Regarding the redox system CuO / Cu, it was observed that high values of equilibrium constant (Keq) were obtained for the temperatures investigated, showing virtually complete conversion of the fuel is obtained. Increasing the temperature resulted in a decrease of Keq, but higher temperatures are required for complete reduction of the SOC. The variation of Gibbs energy was minimal for the relevant temperatures for CLC, indicating that the combustion reaction occurs spontaneously. For Ni-based SOC, commercial samples were used. This proved to be very reactive, with conversions greater than 90% using CH4 and H2 and CH4 + H2O as fuels. High temperatures, around 900 ?C were required for a high conversion. The shrinking core model obtained a good description of the experimental data presenting low error for lower conversions than 0.8, while the diffusion model described better the experimental data with conversions greater than 0.8.

A transfusão de sangue é uma intervenção terapêutica capaz de salvar muitas vidas. Entretanto, transfusões também apresentam uma alta gama de possíveis eventos adversos, questões logísticas, econômicas e sociais. Dentre as principais preocupações terapêuticas estão a incompatibilidade (principalmente do sistema ABO), a transmissão de microrganismos patogênicos, os distúrbios imunomodulatórios, as reações hemolíticas, o aumento estatístico do risco de morte proporcional ao volume de sangue infundido, dentre outros. Diversas alternativas às transfusões sanguíneas são propostas na literatura científica, dentre elas o desenvolvimento de transportadores de oxigênio que utilizam a hemoglobina, comumente intitulados substitutos sanguíneos. Neste âmbito, o presente estudo teve como objetivo o desenvolvimento de uma rota de síntese e a síntese de partículas de gelatina contendo hemoglobina polimerizada. Para tanto, realizou-se a síntese do polietileno glicol bis-[succinimidil succinato], extraiu-se e polimerizou-se com glutaraldeído ou polietileno glicol bis-[succinimidil succinato] hemoglobina de sangue bovino e, partículas de gelatina coriácea ou óssea contendo hemoglobina polimerizada foram sintetizadas e caracterizadas. A síntese do polietileno glicol bis-[succinimidil succinato] (SSPEG) foi caracterizada por espectroscopia RAMAN, análise diferencial de calorimetria (DSC) e os resultados obtidos indicaram o sucesso das reações. O produto da reação de polimerização da hemoglobina e albumina com o SSPEG foi verificado por SDS-PAGE e os resultados obtidos indicaram a formação com sucesso de polímeros de alta massa molecular. As partículas contendo hemoglobina polimerizada geradas com gelatina coriácea apresentaram diâmetro hidrodinâmico de 1370 nm, dispersividade de 0,029 e potencial zeta de -36,1 mV. As partículas contendo hemoglobina polimerizada geradas com gelatina óssea apresentaram diâmetro hidrodinâmico de 438 nm, dispersividade de 0,563 e potencial zeta de -24,5 mV. Os resultados obtidos sugerem a aplicabilidade da gelatina coriácea para a produção de partículas contendo hemoglobina polimerizada com possível aplicação como transportador de oxigênio. / Blood transfusion is a therapeutic intervention that can save many lives. However, transfusion is also related to several possible adverse therapeutic events and logistic, economic and social concerns. Among the major therapeutic concerns are incompatibility (mainly of the ABO group system), pathogenic microorganisms\' transmission, immunomodulatory disturbances, hemolytic reactions, death risk increase that is proportional to the infused volume, among others. Several alternatives to blood transfusion are proposed in the scientific literature. Among them is the development of hemoglobin based oxygen carriers, commonly entitle blood substitutes. To this extent, the present work aimed to develop a synthetic route and to synthesize gelatin particles containing polymerized hemoglobin. To this purpose PEG bis(succinimidyl succinate) was synthesized, bovine hemoglobin was extracted and polymerized with glutaraldehyde or PEG and polyhemoglobin contained particles of gelatin from leather or bones were synthesized and characterized. PEG bis(succinimidyl succinate) synthesis was characterized by RAMAN spectroscopy and by differential scanning calorimetry (DSC) and the obtained results indicated the successful synthesis. The reaction product of the polymerization of hemoglobin or albumin with PEG was verified by SDS-PAGE and the results indicated the successful formation of high molecular mass polymers. The particles generated with leather gelatin and polyhemoglobin had a hydrodynamic diameter of 1370 nm, dispersity of 0.029 and zeta potential of -36.1 mV. Particles generated with bone gelatin and polyhemoglobin had hydrodynamic diameter of 438 nm, dispersity of 0.563 and zeta potential of -24.5 mV. The obtained results suggest the applicability of leather gelatin for the production of polyhemoglobin containing particles aiming to the development of a hemoglobin based oxygen carrier.

O A. fumigatus é um fungo saprofítico e tornou-se um dos principais agente patogênico oportunista em pacientes imunossuprimidos. Estudos prévios em nosso laboratório foi demonstrado que em mitocôndrias de P. brasiliensis e de A. fumigatus, o NAD+ era capaz de induzir a formação de potencial de membrana mitocondrial, o qual podia ser dissipado por FCCP, sugerindo a presença de um transportador de NAD+/NADH, conforme havia sido descrito em S. cerevisiae. Através de ferramentas de bioinformática, foi identificado no Aspergillus Gene Database, uma sequência com 32% de identidade com o gene ndt1p de S. cerevisiae. A sequência de cDNA, contendo 1.194 pb foi obtida usando PCR-Overlaping e clonada em vetor pGEM®-T Easy. Em seguida, a sequência foi subclonada em vetor de expressão pET28-a(+) e expressa em E. coli BL21(DE3). A proteína recombinante foi purificada a partir dos corpos de inclusão e sua identidade confirmada por espectrometria de massas e por Western Blotting usando anticorpo anti-His-tag. A proteína recombinante foi utilizada para produção de anticorpo policlonal anti-Ndt1 em coelho. Para expressão em levedura, o cDNA do gene ndt1 de A. fumigatus foi subclonado em vetor pYES2 e as leveduras S. cerevisiae ?ndt1?ndt2 foram transformadas. Foi realizada a curva de crescimento e indução da expressão da proteína recombinante Ndt1, a presença da proteína foi detectada utilizando anticorpo policlonal anti-Ndt1 após 16 horas de expressão. Nesse período foi verificado que as leveduras estavam em fase de crescimento exponencial. A cepa duplo mutante apresenta uma taxa de crescimento menor quando comparada com a cepa expressando a proteína recombinante quando crescidas em meio fermentável. As mitocôndrias isoladas de ambas as cepas foram submetidas à medida do potencial de membrana onde apresentavam acoplamento entre a oxidação de substratos e a fosforilação oxidativa. Além disso, ficou evidenciado que na cepa expressando a proteína recombinante, NAD+ induziu a formação de um potencial de membrana maior que na cepa controle. O transporte de NAD+ foi realizado e demonstrou que a cepa expressando a proteína Ndt1 tinha um aumento na fluorescência de NADH, mostrando que NAD+ foi capaz de entrar na matriz mitocondrial e posteriormente ser reduzido a NADH por enzimas da matriz mitocondrial. A determinação da produção de espécies reativas de oxigênio foi realizada utilizando as sondas fluorescentes CM-H2DCFDA e MitoSox Red em esferoplastos da levedura S. cerevisiae. Ambos experimentos não houve diferença significativa entre a cepa expressando a proteína Ndt1 e a cepa controle. As proteínas carboniladas foram determinadas utilizando anticorpo anti-DNP, após a reação com dinitrofenilhidrazona e não há diferença significativa entre as cepas. Finalmente, para confirmação da localização celular da proteína Ndt1, os esferoplastos de S. cerevisiae foram submetidos à microscopia confocal, onde ficou evidenciado a co-localização da proteína Ndt1 com as mitocôndrias na cepa de S. cerevisiae transformada com a construção pYES/ndt1, o mesmo perfil não foi observado na cepa ?ndt1?ndt2. / The A. fumigatus is a saprophytic fungus and is a major opportunistic pathogen in immunosuppressed patients. Previous studies in our lab has showed that mitochondrias of the P. brasiliensis and A. fumigatus, NAD+ is able to induce the formation of mitochondrial membrane potential, which could be dissipated by FCCP, suggesting the presence of a NAD+/NADH carrier as described in S. cerevisiae. Using bioinformatics tools, it was identified in Aspergillus Gene database a sequence containing 32% of identity with the gene ndt1p of S. cerevisiae. A fragment of cDNA was obtained from the ndt1p mRNA sequence, containing 1194 bp by using PCR-overlaping and cloned in pGEM®-T Easy vector. Then, the sequence was subcloned in pET28-a(+) vector and expressed in E. coli BL21 (DE3). The recombinant protein was purified from inclusion bodies and the identity confirmed by mass spectrometry and by Western Blotting using anti-His-tag antibody. The recombinant protein was used to produce polyclonal antibody anti-Ndt1 in rabbit. For expression in yeast, the ndt1 cDNA of A. fumigatus was subcloned into pYES2 vector and the yeast S. cerevisiae ?ndt1?ndt2 were transformed. Growth curve and induction of the recombinant protein expression Ndt1 was performed and the protein was detected using a polyclonal anti-Ndt1 antibody after 16 hours of expression. During this period it was found that the yeast were in exponential growth phase. The double mutant strain shows a slower growth rate compared to the strain expressing the recombinant protein growth rate when grown in fermentable medium. The isolated mitochondria from both strains were subjected to measurement of the membrane potential which showed coupling between substrate oxidation and oxidative phosphorylation. Furthermore, these measurements evidenced that the strain expressing the recombinant protein NAD+ induced the formation of a membrane potential larger than the control strain. The transport NAD+ was evaluated and showed that the strain expressing the protein Ndt1 has an increase in NADH fluorescence, indicating that NAD+ was able to enter into the mitochondrial matrix and then reduced to NADH by enzymes from the matrix. The determination of the production of reactive oxygen species was performed using the fluorescent probe CM-H2DCFDA and MitoSox Red in spheroplasts of the yeast S. cerevisiae. Both experiments showed no significant difference between the strain expressing Ndt1 protein and strain control. The carbonylated proteins levels were checked using anti-DNP, after the reaction with dinitrophenylhydrazone and there is no significant difference between the strains. Finally, to confirm the cellular localization of the protein Ndt1, spheroplasts of S. cerevisiae were subjected to confocal microscopy, which evidenced the co-location of Ndt1 protein with mitochondria in S. cerevisiae strain transformed with the construction pYES/ndt1. This same profile was not observed in strain ?ndt1?ndt2.

Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2017-07-26T18:47:21Z No. of bitstreams: 1 2014 - Marcela Jacques de Lemos Neves.pdf: 434472 bytes, checksum: c9817e97c5d136299acb936ad4b87b6f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-26T18:47:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014 - Marcela Jacques de Lemos Neves.pdf: 434472 bytes, checksum: c9817e97c5d136299acb936ad4b87b6f (MD5) Previous issue date: 2014-05-30 / FAPERJ / The main goal of this study was evaluate the effect of downregulation of the ammonium transporter OsAMT1.3 in the ammonium uptake through the high affinity system, as well as the effects on nitrogen metabolism. To perform the OsAMT1.3 gene silencing, it was used the artificial micro RNA (amiRNA) technology. In this system, the OsAMT1.3 coding region sequence (cds) is inserted in W marcelaMD3 website and putatives amiRNAs to silencing OsAMT1.3 were made. The amiRNA was inserted by PCR using the pNW55 vector as template. The amiRNA was inserted in the IRS154 vector using the T4 DNA ligase. The IRS154 plus amiRNA was cloned in the E. coli by electroporation. After rice transformation of Nipponbare variety through Agrobacterium and Hygromycin selection, 14 lineages were obtained. Six lineages showed high seed production and only one lineage with abnormal growth. After seed production in a greenhouse, the lineages L1, L2 and L6 were selected to further experiments evaluating the effects of OsAMT1.3 downregulation. First, the lineages selected were evaluated about the levels of OsAMT1.3 downregulation. The rice lineages transformed with amiRNA showed lower level of OsAMT1.3 expression compared to control plants, however, different levels of OsAMT1.3 downregulation was observed. The lineage L1 showed lower levels of OsAMT1.3 downregulation, L2 and L6 showed higher levels of OsAMT1.3 downregulation. The lineages L1, L2 and L6 as well as IRS control plant (transformed with empty vector) were grown in growth chamber at 30 days after germination, and the treatments used were: N starvation for three days, resupply with 0.15 mM of NH4+-N (low level) and 2.0 mM of NH4+-N (high level). The lineages L1, L2 and L6 showed lower NH4+ uptake with 0.15 mM of NH4+-N compared to control plants (IRS), on the other hand, the plants grown with 2.0 mM of of NH4+-N did not show NH4+ uptake differences, except L1. The expression of OsAMT1.1, OsAMT1.2 and OsAMT1.3 ammonium transporters were upregulated with 0.15 mM of NH4+-N in the control plants (IRS); in the lineages L1, L2 and L6 showed downregulation of the OsAMT1.1, OsAMT1.2 and OsAMT1.3 genes. The lower NH4+ uptake with 0.15 mM of NH4+-N resulted in lower levels of NH4+-N and Amino-N in the roots in the lineages, while the NH4+-N and Amino-N in the plants grown with 2.0 mM of NH4+-N was minimally changed. The results indicate that OsAMT1.3 downregulation leads to OsAMT1.1 and OsAMT1.2 downregulation as well, decreasing the NH4+ uptake. Despite the OsAMT1.3 lower expression compared to OsAMT1.1 and OsAMT1.2, the OsAMT1.3 transporter may be involved in the nitrogen uptake efficiency in low levels of NH4+. / O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito do silenciamento do gene do transportador OsAMT1.3 em arroz sobre a habilidade das plantas em absorver o N-NH4+ atrav?s do sistema de alta afinidade, bem como os reflexos sobre o metabolismo de nitrog?nio. Para o silenciamento do gene OsAMT1.3 foi usada a tecnologia do miRNA artificial (amiRNA). Para tanto, a sequ?ncia codante do gene (cds) OsAMT1.3 ? inserida no sistema WMD3 que indica sequ?ncias de amiRNA?s para silenciar o pr?prio OsAMT1.3. A inser??o do amiRNA foi feita por PCR usando o vetor pNW55 como molde. O miRNA foi inserido no vetor IRS154 por corte e liga??o usando a enzima T4 DNA ligase. O produto da liga??o foi introduzido em E. coli por eletropora??o. Ap?s a transforma??o de arroz da variedade Nipponbare mediada por Agrobacterium. A sele??o das plantas transformadas foi feita com o antibi?tico Higromicina. No total foram obtidas 14 linhagens transformadas. Para confirmar que as plantas mutantes possuiam a constru??o, foi realizado o teste com a folha bandeira em solu??o de higromicina. Seis linhagens apresentaram boa produ??o de sementes e houve uma linhagem com crescimento anormal. Ap?s a multiplica??o das linhagens em casa de vegeta??o, foram selecionadas as linhagens L1, L2 e L6 para os experimentos de an?lise dos efeitos do silenciamento do gene OsAMT1.3. Primeiramente, as linhagens selecionadas foram avaliadas quanto ao n?vel de silenciamento do gene OsAMT1.3. As linhagens de arroz transformadas apresentaram maior n?vel de silenciamento do gene OsAMT1.3 quando comparadas ?s plantas controle, no entanto, diferentes n?veis de silenciamento foram observados. A linhagem L1 apresentou menor n?vel de silenciamento do gene OsAMT1.3, enquanto L2 e L6 apresentaram maior silenciamento. As linhagens L1, L2 e L6 e a planta controle IRS (transformada com o vetor vazio) foram cultivadas em c?mara de crescimento at? os 30 dias ap?s a germina??o, com a aplica??o dos seguintes tratamentos: sem N por tr?s dias, ressuprimento com 0,15 mM de N-NH4+ ap?s tr?s dias de priva??o de N (baixa dose) e 2,0 mM de N-NH4+ constante (alta dose). As linhagens L1, L2 e L6 apresentaram menor absor??o de NH4+ com 0,15 mM de N-NH4+ quando comparadas com as plantas controle (IRS), enquanto as plantas cultivadas com 2,0 mM de N-NH4+ n?o apresentaram diferen?as na absor??o de NH4+. A express?o dos genes dos transportadores de NH4+ OsAMT1.1, OsAMT1.2 e OsAMT1.3 foi induzido pelo tratamento com 0,15 mM de N-NH4+ nas plantas controle (IRS), enquanto as linhagens transformadas apresentaram repress?o dos genes OsAMT1.1, OsAMT1.2 e OsAMT1.3. A menor absor??o de NH4+ com 0,15 mM de N-NH4+ causou menor n?vel de N-NH4+ e N-amino nas ra?zes das linhagens transformadas, enquanto nas plantas com 2,0 mM de N-NH4+ houve pouca altera??o nos conte?dos de N-NH4+ e N-amino. Os resultados indicam que o silenciamento do gene OsAMT1.3 provoca regula??o negativa dos transportadores OsAMT1.1 e OsAMT1.2, alterando a absor??o de NH4+. Apesar do gene OsAMT1.3 ser menos expresso que os genes OsAMT1.1 e OsAMT1.2, o transportador OsAMT1.3 pode estar envolvido na efici?ncia de absor??o em baixas doses de NH4+.

O parálogo 3 do trocador Na+/H+ (NHE3) é essencial para a reabsorção de HCO3- nos túbulos proximais renais e sua expressão e função adaptam-se às diferentes condições ácido-base do organismo. O objetivo desta tese foi avaliar quais as diferenças entre os efeitos da acidose metabólica (AM) e respiratória (AR) sobre a regulação do NHE3 e identificar variáveis responsáveis pelas respostas adaptativas observadas. Em células OKP, a AM foi simulada diminuindo a [HCO3-] do meio de cultura e a AR aumentando a pCO2 ambiente por 24 h. Foram observados os efeitos das acidoses sobre o RNAm-Nhe3, a presença da proteína-NHE3 na membrana celular e a atividade promotora do gene do Nhe3. Concluiu-se que o pH extracelular não é a variável físico-química responsável por estimular a expressão do NHE3, contudo é um importante candidato à variável responsável por regular o tráfego da proteína para a membrana. Além disso, a região de -471 a -153 pb em relação ao sítio de início de transcrição do promotor do gene do Nhe3 contém prováveis reguladores positivos que atuam em resposta à AM. / The Na+/H+ exchanger 3 (NHE3) is essential for HCO3- reabsorption in renal proximal tubules and its expression and function must adapt to acid-base conditions. The goal of the presente study was to evaluate whether there are differences between metabolic (MA) and respiratory acidosis (RA) with regard to NHE3 modulation and to identify variables that may trigger these distinct adaptive responses. In OKP cells, MA was achieved by lowering [HCO3-] in the cell culture medium and RA by increasing pCO2 in the incubator chamber for 24 h. The effects of both acidosis on Nhe3 mRNA levels, cell-surface NHE3 expression and promoter activity were evaluated. In summary, it was concluded that low extracellular pH is not the physical-chemical variable that up-regulates NHE3 expression, however, extracellular pH is a candidate for the variable related to the NHE3 displacement to the apical membrane. Moreover, the Nhe3 gene promoter region spanning from -471 to -153 base pairs upstream from the transcriptional start site contains putative enhancers regulated in response to MA.