Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-04-05T18:50:23Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1802151 bytes, checksum: 55ced28e2e4f99399e06e35026253dfd (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-05T18:50:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1802151 bytes, checksum: 55ced28e2e4f99399e06e35026253dfd (MD5) Previous issue date: 2005-06-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O interesse por métodos não-químicos de controle de pragas em grãos armazenados vem aumentando, uma vez que os consumidores estão menos tolerantes aos resíduos nos alimentos e há sucessivos relatos de resistência a inseticidas em muitas espécies de insetos de produtos armazenados. O controle biológico surge como uma das alternativas e existem vários casos de sucesso desse método, principalmente quando inserido em programas de manejo integrado de pragas. Pesquisas com o ácaro Acarophenax lacunatus (Cross & Krantz) vêm sendo desenvolvidas e demonstram que sua utilização no controle biológico de coleópteros-praga de produtos armazenados é promissora. Assim, esta pesquisa foi dividida em cinco etapas que abordam estudos básicos com este inimigo natural, visando fornecer subsídios para sua futura liberação em programas de controle biológico em ambientes de armazenamento. A primeira etapa está relacionada com a capacidade de A. lacunatus sobreviver à inanição sob diferentes temperaturas. Foram simuladas situações de escassez de alimento, sendo observado que A. lacunatus conseguiu sobreviver na ausência de alimento por até 108 horas, nas temperaturas de 20, 25 e 28 0C. A segunda etapa avaliou se este ácaro dispersa numa massa de grãos e consegue localizar o hospedeiro Rhyzopertha dominica (Fabricius). Constatou-se a habilidade de A. lacunatus em penetrar até 20 cm de profundidade e localizar ovos de R. dominica em diferentes regiões na massa de grãos, colonizando o ambiente de forma ativa. A terceira etapa consistiu no estudo da biologia de A. lacunatus sobre os hospedeiros Tribolium castaneum (Herbst) e Cryptolestes ferrugineus (Stephens) nas temperaturas 20, 25, 28, 30, 32 e 35 0C. A temperatura influenciou os parâmetros biológicos do ácaro, sendo a taxa intrínseca de crescimento (rm), a taxa líquida reprodutiva (Ro) e a razão sexual diretamente proporcionais ao aumento da temperatura. As maiores progênies (19 indivíduos/fêmea do ácaro em T. castaneum e 15 indivíduos/fêmea do ácaro em C. ferrugineus) foram observadas à temperatura de desenvolvimento. 30 A 0 C, demonstrando quarta que essa temperatura favorece seu etapa abordou um estudo de seleção de linhagens de A. lacunatus, que foram mantidas por sucessivas gerações, isoladamente, sobre os hospedeiros T. castaneum, C. ferrugineus e R. dominica. Teve como objetivo testar a preferência do ácaro por ovos desses coleópteros, em testes mensais, durante nove meses, na tentativa de detectar possíveis mudanças nessa preferência que possam indicar a seleção de linhagens desse ácaro com uma melhor performance sobre estes insetos. Houve uma influência significativa do tempo sobre a taxa de parasitismo, sendo R. dominica o hospedeiro mais parasitado em todas as situações, indicando que esta preferência parece estar fixada geneticamente, uma vez que A. lacunatus vem sendo mantido sobre este hospedeiro desde sua introdução no Brasil. Foi calculada a herdabilidade (h2) para T. castaneum e C. ferrugineus, sendo que este valor foi maior para T. castaneum. Isso indica que a seleção de linhagens desse ácaro com um melhor desempenho sobre T. castaneum pode ser realizada. Já a quinta etapa consistiu no estudo do potencial de parasitismo de A. lacunatus sobre o coleóptero T. castaneum, onde observou-se que o aumento da densidade do ácaro implicou no aumento do número de ovos parasitados, com conseqüente redução das populações desse inseto. Assim, novas informações sobre A. lacunatus são acrescentadas e indicam que sua utilização no controle biológico de T. castaneum, C. ferrugineus e R. dominica pode ser viável. / The interest for non-chemical control methods of stored grain pests is increasing since the consumers are less tolerant about insecticide residues on food and there are reports of insecticide resistance in insects of stored products. The biological control appears as an alternative and there are several success cases of the control method, mainly within integrated pest management programs. Studies with the mite Acarophenax lacunatus (Cross & Krantz) have been carried out and show the potential of its use in the biological control of stored grain beetles. Therefore the present study was divided in five phases encompassing basic investigations with this natural enemy aiming to provide support for its future use in biological control programs in storage facilities. The first phase is related with the capacity of A. lacunatus to survive under starvation at different temperatures. This mite species was able to survive for up to 108 hours at the temperatures of 20, 25 and 28 0C. The second phase focused on assessing the dispersal of this mite species in the grain mass and its ability to locate its host Rhyzopertha dominica (Fabricius). The mite was able to penetrate up to 20 cm deep and locate eggs of R. dominica in different regions of the grain mass efectivelly colonizing the environment. The third phase involved the biology of A. lacunatus on the hosts Tribolium castaneum (Herbst) and Cryptolestes ferrugineus (Stephens) at the temperatures 20, 25, 28, 30, 32 and 35 0C. The temperature affected the biological parameters of the mite with a proportional increase in the intrinsic growth rate (rm) net reproductive rate (Ro) and sex ratio with increased temperature. The greates progenies (19 individuals/female in T. castaneum and 15 individuals/female in C. ferrugineus) were observed at 30 0C temperature showing that this temperature favors the mite development. The fourth phase focused the selection of mite strains maintained for several generations in different hosts (T. castaneum, C. ferrugineus and R. dominica). The objective was to test the host egg preference of each selection line in monthly tests trying to detect changes in preference through time. There was a significant influence of time on the parasitism rate with R. dominica always being the preferred host and indicating that this preference was genetically fixed in the mite population. The heritability (h2) of egg preference for the hosts T. castaneum and C. ferrugineus was calculated and higher values were observed for T. castaneum. This indicates that selection for better performance in T. castaneum is possible. In the fifth phase of the present effort, we investigated the parasitism potential of A. lacunatus in the beetle T. castaneum where an increase in mite density led to an increase in the number of parasitized eggs with a consequent reduction of this insect population. Therefore, new information on A. lacunatus was obtained indicating the viability of its use in biological control programs against T. castaneum, C. ferrugineus and R. dominica.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-27T17:46:33Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 647098 bytes, checksum: b268e217f616628b33c7d54bc5890149 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-27T17:46:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 647098 bytes, checksum: b268e217f616628b33c7d54bc5890149 (MD5) Previous issue date: 2001-07-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Com a necessidade de buscar alternativas para o uso de agentes químicos em produtos armazenados, devido ao desenvolvimento de resistência em insetos-praga e à possibilidade de contaminação dos alimentos por resíduos, os programas de erradicação de pragas têm dado maior ênfase ao controle biológico. Em razão do exposto, este trabalho foi dividido em três etapas que abordaram o potencial de parasitismo do ácaro Acarophenax lacunatus (Prostigmata: Acarophenacidae) em cinco espécies de insetos de produtos armazenados. Na primeira etapa, avaliou-se a preferência deste ácaro por ovos dos insetos Rhyzopertha dominica (Coleoptera: Bostrichidae), Dinoderus minutus (Coleoptera: Bostrichidae), Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae) e Oryzaephilus surinamensis (Coleoptera: Silvanidae). A segunda etapa abordou o estudo do potencial de parasitismo do ácaro em D. minutus em mandioca seca armazenada, e a terceira etapa em R. dominica, T. castaneu m, O. surinamensis e Cryptolestes ferrugineus (Coleoptera: Cucujidae) em trigo parcialmente triturado. Todos os testes foram realizados a 28 o C e escotofase de 24 horas, em câmaras climáticas do tipo B.O.D. O estudo da preferência por ovos foi realizado em dois testes: um sem chance de escolha e outro com chance de escolha, utilizando-se placas de Petri (5 cm de diâmetro), as quais foram divididas em quatro quadrantes. No teste sem chance de escolha, foram colocados, em cada quadrante, cinco ovos de apenas um dos insetos e, no centro da placa, uma fêmea de A. lacunatus em processo de fisogastria. O experimento foi realizado com cada uma das espécies. No teste com chance de escolha, foram utilizados ovos de todas as espécies, que foram distribuídos de forma que cada quadrante só recebesse ovos de um dos insetos. Da mesma forma, no centro da placa foi liberada uma fêmea fisogástrica do ácaro. Em nenhum dos testes o ácaro A. lacunatus parasitou ovos de O. surinamensis. No teste sem chance de escolha não foi observada preferência de A. lacunatus por ovos de nenhum dos outros hospedeiros. Entretanto, no teste com livre escolha, A. lacunatus parasitou mais ovos de R. dominica e D. minutus que de T. castaneum. Nas outras etapas do trabalho, avaliou-se a população final dos insetos (larvas e adultos), o número de ovos parasitados e de ácaros em processo de fisogastria, a taxa instantânea de crescimento (r i ) de A. lacunatus e dos insetos, e a perda de peso dos produtos (mandioca e trigo). Foi observado que o ácaro apresenta potencial biótico maior que o dos hospedeiros R. dominica, D. minutus e T. castaneum. Desta forma, o número de larvas e adultos destes insetos sofreu reduções em relação à testemunha, o que também ocorreu com as perdas de matéria seca ocasionadas pelo ataque dos insetos. Também não foi observado parasitismo em populações do coleóptero O. surinamensis. Pelo número de ovos parasitados de R. dominica, D. minutus, T. castaneum e C. ferrugineus, conclui-se que o ácaro A. lacunatus é um inimigo natural eficaz destes insetos, não sendo, portanto, um parasita específico de R. dominica , como se imaginava. / With the necessity of searching for alternatives to the use of chemical control agents in stored products due to development of insecticide resistance in insect-pests and the possibility of foodstuff contamination by residue, pest eradication programs have been putting more emphasis on biological control. As a consequence, the present work was divided in three phases which aimed to assess the parasitism potential of the mite Acarophenax lacunatus (Prostigmata: Acarophenacidae) in five species of insects of stored products. In the first phase, the mite preference for eggs of Rhyzopertha dominica (Coleoptera: Bostrichidae), Dinoderus minutus (Coleoptera: Bostrichidae), Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae) and Oryzaephilus surinamensis (Coleoptera: Silvanidae) was assessed. In the second phase, the parasitism potential of the mote species of D. minutus attacking dried stored cassava was evaluated and in the third phase the parasitism potential of the same parasitic species was assessed in R. dominica, T. castaneum, O. surinamensis e Cryptolestes ferrugineus (Coleoptera: Cucujidae) infesting wheat. All of the experiments were carried out under controlled conditions of 28 o C and 24 hours scotophase in climatic chambers of the B.O.D. type. The study of egg preference was carried out in two tests: one without opportunity of choice and other with it using Petri dishes divided in four areas. On the non-choice test five eggs of only one species was placed in each different area and a physogastric female of A. lacunatus was placed in the centre of the Petri dish (5 cm diameter). On the choice test there was only eggs of a single species in each of the four areas within the Petri dish and the same procedure was used for each potential prey species. The mite A. lacunatus did not attack eggs of O. surinamensis in any of the tests. No preference of A. lacunatus by eggs of any host was observed on the non-choice test. However, A. lacunatus attacked more eggs R. dominica and D. minutus than of T. castaneum. In the other phases of the work the final insect population (adults and larvae), egg parasitism, number of mites in physogastry, the instantaneous rate of increase of the mite and the insect populations (r i ) and weight loss of the stored product (wheat or cassava). It was observed that the mite has higher biotic potential than the hosts R. dominica, D. minutus and T. castaneum. Therefore, the number of larvae and adults of these insect species were lower than in the control treatment, what was also observed with the losses in dried matter caused by insect infestation. Again, no parasitism on eggs of O. surinamensis was observed. Based on the egg parasitism of R. dominica, D. minutus, T. castaneum and C. ferrugineus, the mite A. lacunatus is an efficient natural enemy for all of this species and not only to R. dominica, as initially reported. / Dissertação importada do Alexandria

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Tato práce se zabývá strukturní studií dvou proteinů: proteinu Tail morphogenetic protein H (TmpH) bakteriofága 812, který napadá Zlatého stafylokoka (Staphylococcus aureus) a hexamerinu z potemníka (Tribolium castaneum). S. aureus je jedním z nejvíce rezistentních patogenů způsobující onemocnění s vysokou morbiditou a mortalitou. Bakteriofág 812 je schopen infikovat a lyzovat 95 % kmenů S. aureus a má potenciální využití ve fágové terapii. Protein TmpH je součástí virionu tohoto fága. V rámci této práce bylo připraveno několik plazmidů nesoucích gen TmpH, které byly použity pro rekombinantní expresi proteinu v buňkách E. coli BL21(DE3). Protein byl vyčištěn afinitní a gelovou chromatografií. Pro čistý protein byly optimalizovány krystalizační podmínky. Hexamerin je nejhojnějším proteinem larev a kukel hmyzu s dokonalou proměnou. V průběhu metamorfózy hexamerin slouží jako zdroj aminokyselin. V rámci této práce byl hexamerin izolován z kukel potemníka T. castaneum. Pro stanovení struktury hexamerinu byly použity dvě metody: rentgenová krystalografie a kryo-elektronová mikroskopie. Byly optimalizovány podmínky pro růst krystalů a vypěstovány krystaly vhodné pro sběr difrakčních dat. Nicméně struktura hexamerinu byla rychleji vyřešena kryo-elektronovou mikroskopií s rozlišením 3.2 . Znalost struktury hexamerinu umožní pochopení jeho funkce v regulaci vývoje hmyzu s dokonalou proměnou.

Digestion of proteins in the midgut of lepidopteran larvae relies on different types of peptidases, among the trypsins and chymotrypsins. In this work four chymotrypsinlike peptidases (MsCTLP1–4) were identified from the larval midgut of M. sexta, which are distantly related to another chymotrypsin (MsCT), a previously described peptidase present in the larval midgut of M. sexta. MsCTLP1–4 fit perfectly into a novel subgroup of insect CTLPs by sequence similarity and by the replacement of GP by SA in the highly conserved GDSGGP motif. Examination of MsCTLP expression in different tissues showed that most of the peptidases were predominantly expressed in the anterior and median midgut, while some were found in the Malpighian tubules. Expression analysis of MsCTLPs at different physiological states revealed that the mRNA amounts did not differ considerably in feeding and starving larvae except for MsCTLP2, whose mRNA dropped significantly upon starvation. During molting, however, the mRNA amounts of all MsCTLPs dropped significantly. Immunological determination of MsCTLP1 amounts showed that the mature peptidase was only detectable in the gut lumen of feeding and re-fed larvae, but not in that of starving or molting larvae, suggesting that MsCTLP1 secretion is suspended during starvation or molt. Differential regulation of transcript levels as well as their partial expression in Malpighian tubules might point to a role, which is distinct from digestion for at least some MsCTLPs. In line with this assumption, MsCTLP1 was shown to interact with the chitin synthase 2 (MsCHS2), necessary for chitin synthesis in the course of peritrophic matrix formation in the midgut of M. sexta. The occurrence of this interaction in vivo is supported by colocalization and co-immunoprecipitation. The data suggest that chitin synthesis is controlled by an intestinal proteolytic signaling cascade linking chitin synthase activity to the nutritional state of the larvae. As MsCTLP1 appears to be involved in such signaling cascades, other midgut peptidases could have other targets and may therefore regulate different activities. To gain more insight into the functions of CTLPs, the gene family encoding these peptidases in the genome of the red flour beetle, T. castaneum, was analyzed. Using an extended search pattern, 14 TcCTLP genes were identified that encode peptidases with S1 specificity pocket residues typically found in chymotrypsin-like enzymes. Analysis of the expression patterns of seven TcCTLP genes at various developmental stages revealed that some TcCTLP genes were exclusively expressed in feeding larval and adult stages (TcCTLP-5A/B, TcCTLP-6A). Others were also detected in non-feeding embryonic (TcCTLP-5C, TcCTLP-6D) and pupal stages (TcCTLP-5C, TcCTLP- 6C/D/E). TcCTLP genes were expressed predominantly in the midgut where they presumably function in digestion. However, TcCTLP-5C and TcCTLP-6C also showed considerable expression in the carcass. The latter two genes might therefore encode peptidases that act as molting fluid enzymes. To test this hypothesis, western blots were performed using protein extracts from larval exuviae. The extracts reacted with antibodies to TcCTLP-5C and TcCTLP-6C suggesting that the corresponding peptidases are secreted into the molting fluid. Finally, systemic RNAi experiments were performed. While injections of dsRNAs to TcCTLP-5A/B and TcCTLP-6A/D/E into penultimate larvae did not affect growth or development, injection of dsRNA for TcCTLP-5C and TcCTLP-6C resulted in severe molting defects. Recombinant expressed TcCTLP-5C2 was moreover activated by trypsin and was able to hydrolyze AAPF, hence making TcCTLP-5C the first described chymotrypsin-like peptidase ever to be involved in molting.

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Coleoptera is an order of insects well known as beetles. Most coleopteran species are phytophagous insects and for this reason are essential to crop and storage pests such as the Tribolium castaneum. Lipid metabolism is vital for the biological functions of insects, playing a role in the generation of metabolic energy and other cellular processes. Fatty acid transport proteins (FATPs) play a crucial role in the transport of extracellular fatty acids to cells, have a conserved sequence between species and are involved in the synthesis of hormones and pheromones. Recent studies show that silencing the gene for FATPs through interfering RNAi techniques (RNAi) in insects affects fatty acid uptake and pheromone synthesis. This work aims to characterize proteins homologous to FATPs present in the genome of Tribolium castaneum, to evaluate the gene expression in tissues, developmental stages and insects treated with Orlistat and to evaluate the effect of FATP silencing on energy metabolism. Bioinformatics analyzes were performed with the amino acid sequences, and real-time PCR evaluated the gene expression. The effects of the drug Orlistat were evaluated through qPCR and analysis of nutritional index. The search for sequences in the T. castaneum genome revealed two sequences of proteins homologous to FATPs and bioinformatic analysis was performed. The study of the gene expression of FATPs by qPCR demonstrated more significant expression of the two genes in the fat body of larvae and many expressions in all stages of development of the insect, with higher expression in the pupa stage. The effects of Orlistat on the expression of FATPs evidenced the influence of diet composition on the regulation of the gene expression of these proteins. Gene silencing of TcasFATP was achieved, but no direct effects on the energetic dynamics of the larvae were observed since triacylglycerol levels, and β-oxidation rates were not affected. Thus, more detailed studies with the use of gene silencing will be necessary to characterize FATPs better and elucidate their role in insect energy metabolism. / FAPEAL - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Alagoas / Os coleópteros constituem uma ordem de insetos bastante conhecidos como besouros. A maioria das espécies de coleóptero são insetos fitófagos e por esta razão constituem importantes pragas de culturas e de armazenamento, como o Tribolium castaneum. O metabolismo de lipídeos é importante para as funções biológicas de insetos, exercendo papel na geração de energia metabólica e em outros processos celulares. As proteínas transportadoras de ácidos graxos (FATPs) exercem papel crucial no transporte de ácidos graxos extracelulares para as células, possuem sequência conservada entre as espécies e estão envolvidas na síntese de hormônios e feromônios. Estudos recentes mostram que o silenciamento do gene para FATPs através de técnicas de RNA de interferência (RNAi) em insetos afetam a absorção de ácidos graxos e a síntese de feromônio. Este trabalho tem como objetivo caracterizar proteínas homólogas à FATPs presentes no genoma de Tribolium castaneum, avaliar a expressão gênica nos tecidos, fases de desenvolvimento e em insetos tratados com Orlistate e avaliar o efeito do silenciamento de FATPs no metabolismo energético. Foram realizadas análises bioinformáticas com as sequências de aminoácidos e a avaliação da expressão gênica foi realizada por PCR em tempo real. Os efeitos do fármaco Orlistate foram avaliados através de qPCR e análise dos índices nutricionais. A busca de sequências no genoma do T. castaneum revelou duas sequências de proteínas homólogas à FATPs e a análise bioinformática foi realizada. O estudo da expressão gênica de FATPs por qPCR demonstrou maior expressão dos dois genes no corpo gorduroso de larvas e expressão considerável em todos os estágios de desenvolvimento do inseto, com maior expressão no estágio de pupa. Os efeitos do Orlistate na expressão das FATPs evidenciaram a influência da composição da dieta na regulação da expressão gênica dessas proteínas. O silenciamento gênico de TcasFATP foi alcançado, mas não foram observados efeitos diretos na dinâmica energética das larvas, pois os níveis de triacilglicerol e as taxas de β-oxidação não foram afetadas. Dessa forma, estudos mais detalhados com uso do silenciamento gênico serão necessários para melhor caracterização funcional das FATPs e elucidação do seu papel no metabolismo energético do inseto.