Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2981.pdf: 6989540 bytes, checksum: 48d65263f0c7e6493fadd24c1378e4d0 (MD5) Previous issue date: 2009-10-14 / Financiadora de Estudos e Projetos / ADAMs is a term used to describe the presence of disintegrin and metalloprotease domains(A Disintegrin And Metalloprotease) in a certain class of multi-functional membrane proteins,expressed in several animal species such as mammals and insects. They play important rolesin many physiological processes as in fertilization, myoblast fusion, migration, proliferationand cell survival, as well in diseases including breast, prostate, and pancreas cancer. ADAM9is involved in cellular processes such as adhesion, migration and signaling of tumor cells andit is involved in the metastatic spreading. Aims: To analyze the expression of ADAM9 intumor cell lines (MDA-MB-231 and DU-145), no tumors (FH and C2C12), and to generateknockout clones for ADAM9 expression using silencing RNA techniques for the study ofADAM9 effects on invasion, proliferation and gene expression of MDA-MB-231 cells.Methods: Cells were cultured and plated (2x106 cells/plate of 6cm) for 24 hours in DMEM(10% FBS) and lysed for western blotting and zymography. To check for inhibition ofadhesion to immobilized collagen I, MDA-MB-231 cells and FH (5x106 cells/ml) werelabeled with CMFDA, and then incubated with anti-ADAM9D and anti-RP3ADAM9 indifferent concentrations. For ADAM9 silencing, it was used a kit (Silencer ® siRNA StarterKit - Ambion), 2x105 cells (MDA-MB-231) and the transfection agent (Lipofectamine 2000 -Invitrogen). The cells were plated in 5ml of culture medium DMEM/plate. On the third daycells were treated with the transfection agent and RNA silencing primers. Total RNA wasisolated for RT-PCR, and proliferation and invasion in matrigel assays. Results: All the celllines studied expressed ADAM9 in the tested conditions. MMP-2 (Gelatinase-A) activity wasdetected in the cell extracts of all studied cell lines. Silencing of ADAM9 did not affect therate of MDA-MB-231 proliferation, at 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10 days after silencing (24 or 48hours of incubation in 96-well plates). Silencing of human ADAM9 inhibited tumor cellinvasion in matrigel (71,51±8,02%) when compared to control. Conclusion: The generation ofMDA-MB-231 knockout clones lacking ADAM9 expression using siRNA technique did notaffect the rate of cell proliferation but inhibited tumor cell matrigel invasion, suggesting thatADAM9 is an important molecule in the processes of invasion and metastasis. / ADAMs é um termo usado para descrever a presença de domínios desintegrina emetaloprotease (A Disintegrin And Metalloprotease) em uma determinada classe de proteínasde membrana, multifuncionais, expressas em diferentes espécies animais como mamíferos einsetos. Elas possuem funções importantes em muitos processos fisiológicos como nafertilização, fusão de mioblastos, migração, proliferação e sobrevivência celular, entre outros,bem como em processos patológicos tais como muitos tipos de tumores humanos, incluindomama, próstata, pâncreas, fígado, rins e pele. A ADAM9 está envolvida em diversosprocessos celulares, tais como adesão celular, migração e sinalização de células tumorais,contribuindo para o desenvolvimento de metástases. Objetivos: Analisar a expressão daADAM9 em linhagens de células tumorais (MDA-MB-231 e DU-145) e não tumorais (FH eC2C12), gerar clones com o gene que codifica para a ADAM9 silenciados e verificar o efeitoda ausência desta proteína na invasão, proliferação e expressão gênica das células MDA-MB-231. Métodos: As células foram cultivadas e posteriormente plaqueadas (2x106 células/placade 6cm) por 24 horas e em 5ml de meio de cultura DMEM (10% de FBS) e lisadas para oensaio de western blotting e zimografia. Para o ensaio de inibição de adesão as células MDAMB-231 e FH (5x106 células/ml) foram marcadas com CMFDA (clorometil diacetatofluoresceína) e posteriormente incubadas com os anticorpos anti-ADAM9D e anti-RP3ADAM9 em diferentes concentrações. Para a técnica de RNAi foi utilizado um kit(Silencer® siRNA Starter Kit Ambion), 2,0x105 de células (MDA-MB-231) e agente detransfecção (Lipofectamina 2000 - Invitrogen). As células foram plaqueadas em 5ml de meiode cultura DMEM/placa. No terceiro dia de plaqueamento as células foram tratadas comagente de transfecção e primer de silenciamento do RNA, para serem utilizadas na RT-PCR,ensaio de proliferação e invasão em matrigel. Resultados: Todas as linhagens estudadasexpressaram a ADAM9 nas condições de estudo. A atividade MMP-2 (gelatinase-A)intermediária estava presente em todos os tipos celulares testados. O silenciamento deADAM9 não afetou a taxa de proliferação das células MDA-MB-231 após 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10dias do silenciamento (24 ou 48 horas de incubação). O silenciamento da ADAM9 humanainibiu a invasão celular em células de câncer de mama (MDA-MB-231) em matrigel (71,51 ±8,02%) quando comparados com o controle. Conclusão: A geração de clones knockout sem aexpressão da ADAM9 utilizando a técnica de silenciamento de RNA em células de câncer demama (MDA-MB-231), não afetou a taxa de proliferação celular. No entanto, a invasão dascélulas tumorais em matrigel foi inibida em aproximadamente 70% quando comparada com ocontrole, demonstrando que ADAM9 é uma importante molécula envolvida no processo deinvasão e metástase.

O agente etiológico da Febre Maculosa das Montanhas Rochosas (RMSF), conhecida no Brasil como Febre Maculosa Brasileira, é a bactéria Rickettsia rickettsii. Essa bactéria é transmitida ao homem pela picada de diferentes espécies de carrapatos ixodídeos. No Brasil, os vetores são Amblyomma cajennense e A. aureolatum. As taxas de prevalência de R. rickettsii nas populações de carrapatos de áreas endêmicas para RMSF são baixas, em geral abaixo de 1%. Essa baixa prevalência parece estar associada a menores taxas reprodutivas e de sobrevivência de linhagens infectadas, sugerindo que R. rickettsii seja patogênica também para os seus vetores. Infecções experimentais demonstraram que 80-100% dos indivíduos de uma colônia de A. aureolatum mantida em laboratório são infectados por R. rickettsii, enquanto apenas 10-60% de A. cajennense adquirem a bactéria. Esses dados indicam que as respostas dessas duas espécies de carrapatos à infecção sejam diferentes, resultando em diferentes taxas de prevalência da bactéria. Dessa maneira, a caracterização molecular das interações entre carrapatos do gênero Amblyomma e a bactéria R. rickettsii é importante, podendo gerar informações não somente para o esclarecimento acerca dos mecanismos de patogenicidade de R. rickettsii para os carrapatos, mas também para um melhor entendimento dos mecanismos responsáveis pela aparente restringência de A. cajennense à infecção. Assim, os objetivos do presente estudo foram: (i) analisar os efeitos da infecção por R. rickettsii sobre o perfil de expressão gênica de carrapatos A. cajennense por hibridação subtrativa por supressão (SSH), (ii) validar os dados de SSH por reação em cadeia de polimerase quantitativa precedida por transcrição reversa (RT-qPCR) e (iii) caracterizar funcionalmente dois genes com expressão induzida pela infecção por RNA de interferência (RNAi). Após a análise bioinformática dos dados de SSH, 44 sequências únicas foram obtidas, das quais 36 representam genes com expressão induzida e 8 genes com expressão reprimida pela infecção. A indução dos genes codificadores da subunidade I da citocromo c oxidase (COX1), da subunidade IV da NADH desidrogenase, de uma proteína com domínio de inibidor de serina-proteases Kunitz-type (papilina-like), identificados por SSH, e de um peptídeo antimicrobiano (hebraeína), foi confirmada por RT-qPCR. O silenciamento gênico da hebraeína e da papilina-like não teve nenhum efeito na aquisição de R. rickettsii pelo vetor, indicando que, isoladamente, não são responsáveis pela proteção de A. cajennense contra a infecção. Os dados gerados pelo presente estudo abrem perspectivas para que outros genes sejam avaliados quanto ao seu papel na aquisição de R. rickettsii, os quais, no futuro, podem ser considerados como alvos para o desenvolvimento de vacinas. / The etiologic agent of the Rocky Mountain Spotted Fever (RMSF), also known as Brazilian Spotted Fever in Brazil, is the bacterium Rickettsia rickettsii. This rickettsia is transmitted to humans by the bite of various tick species. In Brazil, Amblyomma cajennense and A. aureolatum are known as vectors. The prevalence rates of R. rickettsii infected ticks in RMSF endemic areas are low, oscillating around 1%. These low prevalence rates seems to be associated with lower reproductive and survival rates of infected ticks, suggesting that R. rickettsii is also pathogenic to its vectors. Experimental infections with R. rickettsii have demonstrated that 80 to 100% of A. aureolatum ticks from a laboratory colony acquire this bacterium, whereas only 10 to 60% of A. cajennense ticks become infected. These results indicate that the responses of these two tick species against infection are different, resulting in different prevalence rates of the bacterium. Therefore, the elucidation of the interactions between ticks of the genera Amblyomma and the bacterium R. rickettsii at a molecular level is important to provide information to better understand the mechanisms of pathogenicity of R. rickettsii against ticks as well as for the elucidation of the mechanisms responsible for the apparent refractoriness of A. cajennense against infection. Therefore, the objectives of the current study were: (i) analyze the effets of the infection with R. rickettsii on the gene expression of ticks A. cajennense by suppression subtractive hybridization (SSH), (ii) validate SSH data by reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), and (iii) functionally characterize two genes induced by infection using RNA interference (RNAi). After bioinformatics analysis of SSH data, 44 unique sequences were obtained, among which 36 represent genes with expression induced and 8 repressed genes by infection. The induction of genes encoding subunit I of cytochrome c oxidase (COX1), the NADH dehydrogenase subunit IV, a protein containing Kunitz-type inhibitor domain (papilin-like), identified by SSH, and an antimicrobial peptide (hebraein), was confirmed by RT-qPCR. The effects of knockdown of hebraein and papilin-like encoding genes had no effect on the acquisition of R. rickettsii by the vector. Data of the current study may be used to evaluate the role of other genes in acquisition of R. rickettsii, which, in the future, may be considered as target for vaccine development.

O agente etiológico da Febre Maculosa das Montanhas Rochosas (RMSF), conhecida no Brasil como Febre Maculosa Brasileira, é a bactéria Rickettsia rickettsii. Essa bactéria é transmitida ao homem pela picada de diferentes espécies de carrapatos ixodídeos. No Brasil, os vetores são Amblyomma cajennense e A. aureolatum. As taxas de prevalência de R. rickettsii nas populações de carrapatos de áreas endêmicas para RMSF são baixas, em geral abaixo de 1%. Essa baixa prevalência parece estar associada a menores taxas reprodutivas e de sobrevivência de linhagens infectadas, sugerindo que R. rickettsii seja patogênica também para os seus vetores. Infecções experimentais demonstraram que 80-100% dos indivíduos de uma colônia de A. aureolatum mantida em laboratório são infectados por R. rickettsii, enquanto apenas 10-60% de A. cajennense adquirem a bactéria. Esses dados indicam que as respostas dessas duas espécies de carrapatos à infecção sejam diferentes, resultando em diferentes taxas de prevalência da bactéria. Dessa maneira, a caracterização molecular das interações entre carrapatos do gênero Amblyomma e a bactéria R. rickettsii é importante, podendo gerar informações não somente para o esclarecimento acerca dos mecanismos de patogenicidade de R. rickettsii para os carrapatos, mas também para um melhor entendimento dos mecanismos responsáveis pela aparente restringência de A. cajennense à infecção. Assim, os objetivos do presente estudo foram: (i) analisar os efeitos da infecção por R. rickettsii sobre o perfil de expressão gênica de carrapatos A. cajennense por hibridação subtrativa por supressão (SSH), (ii) validar os dados de SSH por reação em cadeia de polimerase quantitativa precedida por transcrição reversa (RT-qPCR) e (iii) caracterizar funcionalmente dois genes com expressão induzida pela infecção por RNA de interferência (RNAi). Após a análise bioinformática dos dados de SSH, 44 sequências únicas foram obtidas, das quais 36 representam genes com expressão induzida e 8 genes com expressão reprimida pela infecção. A indução dos genes codificadores da subunidade I da citocromo c oxidase (COX1), da subunidade IV da NADH desidrogenase, de uma proteína com domínio de inibidor de serina-proteases Kunitz-type (papilina-like), identificados por SSH, e de um peptídeo antimicrobiano (hebraeína), foi confirmada por RT-qPCR. O silenciamento gênico da hebraeína e da papilina-like não teve nenhum efeito na aquisição de R. rickettsii pelo vetor, indicando que, isoladamente, não são responsáveis pela proteção de A. cajennense contra a infecção. Os dados gerados pelo presente estudo abrem perspectivas para que outros genes sejam avaliados quanto ao seu papel na aquisição de R. rickettsii, os quais, no futuro, podem ser considerados como alvos para o desenvolvimento de vacinas. / The etiologic agent of the Rocky Mountain Spotted Fever (RMSF), also known as Brazilian Spotted Fever in Brazil, is the bacterium Rickettsia rickettsii. This rickettsia is transmitted to humans by the bite of various tick species. In Brazil, Amblyomma cajennense and A. aureolatum are known as vectors. The prevalence rates of R. rickettsii infected ticks in RMSF endemic areas are low, oscillating around 1%. These low prevalence rates seems to be associated with lower reproductive and survival rates of infected ticks, suggesting that R. rickettsii is also pathogenic to its vectors. Experimental infections with R. rickettsii have demonstrated that 80 to 100% of A. aureolatum ticks from a laboratory colony acquire this bacterium, whereas only 10 to 60% of A. cajennense ticks become infected. These results indicate that the responses of these two tick species against infection are different, resulting in different prevalence rates of the bacterium. Therefore, the elucidation of the interactions between ticks of the genera Amblyomma and the bacterium R. rickettsii at a molecular level is important to provide information to better understand the mechanisms of pathogenicity of R. rickettsii against ticks as well as for the elucidation of the mechanisms responsible for the apparent refractoriness of A. cajennense against infection. Therefore, the objectives of the current study were: (i) analyze the effets of the infection with R. rickettsii on the gene expression of ticks A. cajennense by suppression subtractive hybridization (SSH), (ii) validate SSH data by reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), and (iii) functionally characterize two genes induced by infection using RNA interference (RNAi). After bioinformatics analysis of SSH data, 44 unique sequences were obtained, among which 36 represent genes with expression induced and 8 repressed genes by infection. The induction of genes encoding subunit I of cytochrome c oxidase (COX1), the NADH dehydrogenase subunit IV, a protein containing Kunitz-type inhibitor domain (papilin-like), identified by SSH, and an antimicrobial peptide (hebraein), was confirmed by RT-qPCR. The effects of knockdown of hebraein and papilin-like encoding genes had no effect on the acquisition of R. rickettsii by the vector. Data of the current study may be used to evaluate the role of other genes in acquisition of R. rickettsii, which, in the future, may be considered as target for vaccine development.

Coleoptera is an order of insects well known as beetles. Most coleopteran species are phytophagous insects and for this reason are essential to crop and storage pests such as the Tribolium castaneum. Lipid metabolism is vital for the biological functions of insects, playing a role in the generation of metabolic energy and other cellular processes. Fatty acid transport proteins (FATPs) play a crucial role in the transport of extracellular fatty acids to cells, have a conserved sequence between species and are involved in the synthesis of hormones and pheromones. Recent studies show that silencing the gene for FATPs through interfering RNAi techniques (RNAi) in insects affects fatty acid uptake and pheromone synthesis. This work aims to characterize proteins homologous to FATPs present in the genome of Tribolium castaneum, to evaluate the gene expression in tissues, developmental stages and insects treated with Orlistat and to evaluate the effect of FATP silencing on energy metabolism. Bioinformatics analyzes were performed with the amino acid sequences, and real-time PCR evaluated the gene expression. The effects of the drug Orlistat were evaluated through qPCR and analysis of nutritional index. The search for sequences in the T. castaneum genome revealed two sequences of proteins homologous to FATPs and bioinformatic analysis was performed. The study of the gene expression of FATPs by qPCR demonstrated more significant expression of the two genes in the fat body of larvae and many expressions in all stages of development of the insect, with higher expression in the pupa stage. The effects of Orlistat on the expression of FATPs evidenced the influence of diet composition on the regulation of the gene expression of these proteins. Gene silencing of TcasFATP was achieved, but no direct effects on the energetic dynamics of the larvae were observed since triacylglycerol levels, and β-oxidation rates were not affected. Thus, more detailed studies with the use of gene silencing will be necessary to characterize FATPs better and elucidate their role in insect energy metabolism. / FAPEAL - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Alagoas / Os coleópteros constituem uma ordem de insetos bastante conhecidos como besouros. A maioria das espécies de coleóptero são insetos fitófagos e por esta razão constituem importantes pragas de culturas e de armazenamento, como o Tribolium castaneum. O metabolismo de lipídeos é importante para as funções biológicas de insetos, exercendo papel na geração de energia metabólica e em outros processos celulares. As proteínas transportadoras de ácidos graxos (FATPs) exercem papel crucial no transporte de ácidos graxos extracelulares para as células, possuem sequência conservada entre as espécies e estão envolvidas na síntese de hormônios e feromônios. Estudos recentes mostram que o silenciamento do gene para FATPs através de técnicas de RNA de interferência (RNAi) em insetos afetam a absorção de ácidos graxos e a síntese de feromônio. Este trabalho tem como objetivo caracterizar proteínas homólogas à FATPs presentes no genoma de Tribolium castaneum, avaliar a expressão gênica nos tecidos, fases de desenvolvimento e em insetos tratados com Orlistate e avaliar o efeito do silenciamento de FATPs no metabolismo energético. Foram realizadas análises bioinformáticas com as sequências de aminoácidos e a avaliação da expressão gênica foi realizada por PCR em tempo real. Os efeitos do fármaco Orlistate foram avaliados através de qPCR e análise dos índices nutricionais. A busca de sequências no genoma do T. castaneum revelou duas sequências de proteínas homólogas à FATPs e a análise bioinformática foi realizada. O estudo da expressão gênica de FATPs por qPCR demonstrou maior expressão dos dois genes no corpo gorduroso de larvas e expressão considerável em todos os estágios de desenvolvimento do inseto, com maior expressão no estágio de pupa. Os efeitos do Orlistate na expressão das FATPs evidenciaram a influência da composição da dieta na regulação da expressão gênica dessas proteínas. O silenciamento gênico de TcasFATP foi alcançado, mas não foram observados efeitos diretos na dinâmica energética das larvas, pois os níveis de triacilglicerol e as taxas de β-oxidação não foram afetadas. Dessa forma, estudos mais detalhados com uso do silenciamento gênico serão necessários para melhor caracterização funcional das FATPs e elucidação do seu papel no metabolismo energético do inseto.