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Le récepteur à neurotrophine TrkC a été identifié comme étant un récepteur à dépendance : en l'absence de son ligand NT-3, il déclenche l'apoptose. En effet, la survie des cellules qui expriment ces récepteurs dépend de la disponibilité en ligand, un mécanisme qui inhibe la prolifération incontrôlée et la migration des cellules tumorales. TrkC, en tant que récepteur à tyrosine kinase, est généralement considéré comme un proto-oncogène. Or nous montrons que l'expression TrkC est diminuée dans une grande fraction des cancers colorectaux humains, principalement par méthylation du promoteur de TrkC. En outre, ce mécanisme confère un avantage sélectif aux lignées cellulaires colorectales pour inhiber la mort des cellules tumorales. De plus, la réexpression de TrkC dans les lignées tumorales colorectales est associée à la mort des cellules tumorales et à l'inhibition in vitro des caractéristiques de transformation cellulaire, et in vivo de la croissance tumorale. Ensemble, ces données permettent de conclure que TrkC est un gène suppresseur de tumeur dans le cancer colorectal. Le mécanisme moléculaire par lequel TrkC déclenche l'apoptose implique le clivage de son domaine intracellulaire, ce qui libère un fragment pro-apoptotique (TrkC KF). Nous montrons que TrkC KF interagit avec Cobra1, un cofacteur de BRCA1, et que Cobra1 est nécessaire à l'apoptose induite par TrkC. Cobra1 conduit TrkC KF à la mitochondrie, où il favorise l'apoptose apoptosome-dépendante. Ainsi, nous proposons qu'en l'absence de NT-3, le clivage protéolytique de TrkC conduit à la libération d'un fragment tueur qui déclenche l'apoptose mitochondriale, via le recrutement de Cobra1 / The neurotrophin receptor TrkC was recently identified as a dependence receptor, and, as such, it triggers apoptosis in the absence of its ligand, NT-3. Indeed cells that express these receptors are thought to be dependent on ligand availability for their survival, a mechanism that inhibits uncontrolled tumor cell proliferation and migration. TrkC, as a classic tyrosine kinase receptor, is generally considered to be a proto-oncogene. We show that TrkC expression is down-regulated in a large fraction of human colorectal cancers, mainly through promoter methylation. Moreover, we show that TrkC silencing by promoter methylation is a selective advantage for colorectal cell lines to limit tumor cell death. Furthermore, reestablished TrkC expression in colorectal cancer cell lines is associated with tumor cell death and inhibition of in vitro characteristics of cell transformation, as well as in vivo tumor growth. Together, these data support the conclusion that TrkC is a colorectal cancer tumor suppressor. TrkC triggers apoptosis in the absence of its ligand NT-3 : the molecular mechanism for apoptotic engagement involves the double cleavage of the receptor's intracellular domain, leading to the formation of a proapoptotic fragment (TrkC KF). We show that TrkC KF interfacts with Cobra1, a putative cofactor of BRCA1, and that Cobra1 is required for TrkC-induced apoptosis. Cobra1 shuttles TrkC KF to the mitochondria, where it promotes apoptosome-dependent apoptosis. Thus, we propose that, in the absence of NT-3, the proteolytic cleavage of TrkC leads to the release of a killer fragment that triggers mitochondria-dependent apoptosis via the recruitment of Cobra1

Le récepteur à activité tyrosine kinase TrkC est un récepteur aux neurotrophines qui contrôle la mise en place des neurones proprioceptifs au cours du développement du système nerveux. En présence de son ligand, la neurotrophine‐3 (NT‐3), TrkC transmet un signal de survie, tandis qu’en absence des facteurs trophiques les neurones vont mourir via l’apoptose. Cependant, les mécanismes moléculaires de ce programme de mort ne sont pas connus. D'autre part, TrkC peut également accomplir un rôle proapoptotique dans le cancer. En effet, son expression est un facteur de bon pronostic pour le neuroblastome, la tumeur solide extra crânienne la plus courante chez l'enfant. Ce paradoxe apparent pourrait s’expliquer par la notion de récepteur à dépendance : ces récepteurs induisent la mort cellulaire en situation d’absence de ligand, alors que la présence de leur ligandinhibe leur activité proapoptotique. Nous avons fourni la preuve que parmi les récepteurs aux neurotrophines, seul TrkC est un récepteur à dépendance. Son activité nécessite un clivage par des caspases, générant un fragment proapoptotique. Par ailleurs, nous avons mis en évidence la surproduction autocrine de NT‐3 dans une fraction de neuroblastomes à haut risque, permettant aux cellules malignes de contourner le mécanisme de contrôle antitumoral de TrkC. De plus, nous avons démontré que la perturbation de l'interaction TrkC/NT‐3 induit la mort des cellules de neuroblastomein vitro et empêche la croissance tumorale et les métastases dans des modèles aviaires et murins. Ces travaux établissent les bases d’une potentielle stratégie thérapeutique s'appuyant sur la restauration d'une voie d’apoptose fonctionnelle induite par TrkC dépourvu du ligand / The tyrosine kinase receptor TrkC is a neurotrophin receptor that assures an adequate establishment of proprioceptive neurons during nervous system development. Upon neurotrophin‐3 (NT‐3) binding TrkC transduces a classic survival signal, while in absence of trophic support a program of apoptotic cell death will take place. However the molecular mechanisms leading to neuron cell death are not understood. On the other hand, although TrkC was first identified as an oncogene, it may also accomplish a proapoptotic role in cancer. Indeed its expression has been correlated with a good prognosis of Neuroblastoma, the most common extracranial solid tumor of early childhood. Thisapparent paradox could be explained by the dependence receptor notion: these receptors induce apoptotic cell death in settings of absence of ligand, whereas the presence of their ligand inhibits this proapoptotic activity. We provide evidence here that among neurotrophin receptors, only TrkC is a dependence receptor and its activity relies on the caspase‐mediated cleavage of its intracellular domain, which allows the release of a proapoptotic fragment. Moreover, we show that an autocrine production of NT‐3 concerns a large fraction of aggressive neuroblastoma and provides a selective advantage by allowing malignant cells to overcome with TrkC antitumoral control. We demonstrate that the disruption of the TrkC/NT‐3 interaction triggers neuroblastoma cell death in vitro andprevents tumor growth and metastasis in avian and murine models. This work set the basis for analternative anticancer therapeutic strategy relying on the reengagement of a cell death program mediated by unbound TrkC

Le récepteur à neurotrophine TRKC a initialement été montré comme induisant la mortcellulaire par apoptose en l’absence de son ligand, NT-3. Cette mort cellulaire a tout d’abordété décrite comme étant importante dans la régulation de la survie neuronale, pendant laformation du système nerveux sympathique. Plus tard, elle a été montrée comme étantimpliquée dans différents types de cancer.Au cours de ma thèse, je me suis concentré sur la caractérisation moléculaire de la cascade designalisation conduisant à l’induction de l’apoptose par TRKC. Afin d’induire l’apoptose, ledomaine intracellulaire de TRKC est clivé par les caspases en deux sites, ce qui entraine lagénération d’un fragment pro-apoptotique, TRKC KF (Killer Fragment). Plusieurs partenairespotentiels de TRKC KF ont été identifiés lors d’un crible double-hybride. Initialement, je mesuis focalisé sur l’un d’eux, COBRA1, un cofacteur de BRCA1.Je montre ici que COBRA1 est requis pour la mort cellulaire induite par TRKC, à la fois invitro et in vivo, dans des neurones primaires. COBRA1 semble stabiliser et accumuler TRKCKF à la mitochondrie, où TRKC KF entraine l’activation de BAX et ensuite le relargage ducytochrome c. En conclusion, il semblerait que la mort cellulaire induite par TRKC estdépendante de la voie apoptotique intrinsèque. J’ai aussi pris part à deux autres projets décrivant le rôle de TRKC comme un suppresseur de tumeur potentiel dans le neuroblastome et le cancer colorectal. Nous avons montré dans leneuroblastome que la fonction pro-apoptotique de TRKC est invalidée par une boucleautocrine de production de NT3, qui peut être ciblée lors d’une approche thérapeutique. Dansle cancer colorectal, nous avons décrit un second mécanisme par lequel les cellules tumoraleséchappent à l’apoptose induite par TrkC. Il s’agit d’une perte de l’expression de TrkC due àune hypermethylation du promoteur. / The neurotrophin receptor TRKC was initially shown to induce apoptosis in settings of lackof its ligand, NT-3. This cell death was described to be important in the regulation of neuronalsurvival during sympathetic nervous system formation and finally it was linked with severaltypes of cancer. During my thesis I focused on the molecular characterization of the signaling cascade leadingto TRKC-induced apoptosis. Importantly, in order to kill, TRKC is double-cleaved bycaspases in its intracellular domain releasing a pro-apoptotic fragment, named TRKC KF(Killer Fragment). Using a yeast two-hybrid screen we identified several potential interactingpartners for TRKC KF. Initially, i focused on COBRA1, a cofactor of BRCA1.I show here that COBRA1 is requisite for TRKC-induced cell death both in vitro and in vivo,on primary neurons. COBRA1 seems to stabilize and accumulate TRKC KF at themitochondria, where TRKC KF induces the activation of BAX and therefore cytochrome crelease. Therefore, it looks that TRKC-induced cell death is dependent on the intrinsicpathway of apoptosis. During my thesis, I also took part in two projects characterizing the role of TRKC as aconditional tumor suppressor in neuroblastoma and colon cancer. We showed that inneuroblastoma tumors the pro-apoptotic function of TRKC is impaired due to an autocrineproduction loop of NT-3, which can be targeted as a therapeutic strategy. In colon cancer, wedescribed another mechanism by which tumor cells evade TRKC-induced apoptosis, morespecifically a loss of TRKC expression due to promoter hypermethylation

Le glioblastome multiforme (GBM) est la tumeur cérébrale la plus fréquente et la plus agressive. Il s’agit d’une tumeur capable de survivre même dans des conditions d’oxygénation faible ou hypoxie. En effet, les cellules cancéreuses du GBM activent des voies de survie en réponse à cette privation de dioxygène, dont l’autophagie. Il s’agit d’un mécanisme catabolique conduisant à la dégradation des constituants cellulaires, générant ainsi des précurseurs pour l’anabolisme cellulaire ainsi que de l’ATP. Nous avons étudié l’activation de l’autophagie en réponse à l’hypoxie, dans trois lignées cellulaires de GBM humain, les U87MG, les M059K et les M059J. Une autophagie de survie est activée dans les trois lignées cellulaires, en réponse à l’hypoxie. L’inhibition du flux autophagique par la chloroquine (CQ), induit une accumulation des autophagosomes, soulignant ainsi l’efficacité du processus. L’inhibition de l’autophagie par la CQ ou par des siRNA spécifiques dirigés contre les transcrits de Beclin1 ou d’Atg5, entraîne une diminution significative de l’activité métabolique cellulaire, ainsi qu’un retard de prolifération. Toutefois, nous n’avons pas détecté de mort apoptotique dépendante des caspases. Nous avons donc étudié une deuxième voie de signalisation de survie cellulaire, la signalisation neurotrophique. Une augmentation significative des transcrits de TrkC FL et T1 (TrkC tronqué) ainsi que de leur ligand, la NT-3 a été observée dans les cellules U87MG cultivées en hypoxie. De même, le taux de production des protéines TrkC FL et T1 a significativement augmenté en hypoxie. L’augmentation de l’expression du TrkC FL était accompagnée par une augmentation de sa phosphorylation et de celle de la p38 MAPK. L’inhibition de cette dernière par siRNA induit un clivage de la PARP, qui est d’autant plus important suite à l’ajout de la CQ. Ces effets étaient plus marqués au niveau des cellules cultivées en hypoxie. L’inhibition de l’autophagie par la CQ, augmente l’expression de TrkC FL et la phosphorylation de la p38, ce qui suggère qu’en absence de l’autophagie, les cellules s’adapteraient en augmentant la signalisation du TrkC.La recherche des zones hypoxiques et autophagiques sur des coupes de tumeurs issues de patients atteints de GBM, confirme le caractère hypoxique de cette tumeur, et montre une induction du processus autophagique. En comparaison avec le cavernome (tumeur cérébrale bénigne), les patients atteints de GBM montrent une augmentation significative de l’expression de TrkC et de NT-3, ce qui renforce l’importance de la signalisation neurotrophique dans la survie des cellules de GBM. / Glioblastoma multiform (GBM), a primary brain tumor that is the most common and the most aggressive. It’s characterized by a high degree of hypoxia and a resistance to therapy because of its adaptation capacities including autophagy. This degradation process allows recycling of cellular components to produce precursors for anabolism and ATP. We have studied the hypoxia-induced autophagy in three human GBM cell lines, the U87MG, M059K and M059J. We have found a survival hypoxia-induced autophagy that was efficient in all cell lines. Indeed, we observed an accumulation of autophagosomes when we inhibited the autophagic flux with chloroquine (CQ). Treatment with CQ or interference of Beclin1 or Atg5 expression by specific siRNA in GBM cells significantly decreased their metabolic activity and growth. However, we did not detect PARP cleavage by western blotting. Thus, we verified the neurotrophic signaling as another survival pathway by which GBM cells resist to hypoxia. After hypoxia, the transcription level of TrkC FL (full length), TrkC-T1 (truncated TrkC) and the NT-3 (the TrkC ligand) significantly increases in the U87MG cell lines, as far as the translation level of TrkC FL and TrkC-T1. When we explored the TrkC FL signaling pathway, there was an increase in the phosphorylation level of p38. After inhibition of this MAPK, we observed PARP cleavage, which was particularly important in hypoxia conditions. This cleavage was further enhanced upon CQ treatment. The autophagy inhibition using either CQ, siBeclin1 or siAtg5, increases TrkC FL and T1 expression, suggesting that in the absence of autophagy, cells would adapt by increasing TrkC signaling.Finally, we have verified for hypoxic (BNIP3) and autophagic (LC3) markers on tumor sections from patients with GBM. We confirmed the hypoxic character of GBM, and showed important autophagy activation, after autophagosomes quantification. In comparison with cavernoma (benign brain tumor), patients with GBM showed a significant increase in TrkC and NT-3 expression, highlighting the importance of neurotrophic signaling in GBM tumor cell survival.

Les récepteurs à dépendance ont la particularité de présenter deux types de signalisation cellulaire : en présence de leur ligand, ils activent des voies positives de survie, de différenciation et de migration, mais en l'absence de leur ligand, ils activent au contraire l'apoptose de la cellule. Cette dualité fonctionnelle des récepteurs à dépendance est impliquée à la fois lors du développement embryonnaire, mais également dans le maintien de l'homéostasie chez l'adulte. En effet, elle permet le contrôle de la prolifération cellulaire, mais aussi l'élimination de cellules migrant en dehors de leur territoire défini, dans un environnement où la quantité de ligand est limitée. De ce fait, les récepteurs à dépendance ont été caractérisés comme des suppresseurs de tumeur conditionnels dans certaines pathologies cancéreuses. TrkC, le récepteur de la neurotrophine-3 (NT-3) appartient à cette famille fonctionnelle. En l'absence de NT-3, TrkC, sous sa forme monomérique, est clivé par les caspases en deux sites : ce clivage induit la libération d'un fragment hautement apoptotique, appelé TrkC-KF pour « Killer Fragment ». Dans ce manuscrit, nous décrivons les mécanismes moléculaires par lesquels TrkC-KF induit l'apoptose. Nous avons en effet pu déterminer que TrkC-KF s'associe dans le cytoplasme avec la protéine Cobral, qui permet son transport à la mitochondrie : TrkC-KF permet ainsi l'activation de Bax, relarguant le cytochrome C nécessaire à la formation de l'apoptosome. TrkC-KF est également transporté dans le noyau des cellules par les importines : cette localisation nucléaire permet son interaction avec le facteur de transcription Heyl / Dependence receptors are able to activate two cellular pathways: in the presence of their ligand, they activate positive signaling of survival, differentiation and migration, but in the absence of their ligand, they activate the apoptosis of the cell. This dual function is implied both during the embryonic development, and in the homeostasis maintenance in adults. lndeed, it enables the control of cellular proliferation, and the elimination of cells migrating outside their defined territory, in an environment where the ligand availability is limited. Therefore, dependence receptors have also been caracterised as conditionnal tumor suppressors in various types of cancer. TrkC, the neurotrophin-3 (NT-3) receptor, belongs to this functional family. ln the absence of NT-3, TrkC under its monomeric for mis cleaved by caspases : this cleavage induces the release of a highly apoptotic fragment, called TrkC-KF (Killer Fragment). ln this manuscript, we describe the molecular mecanism by which TrkC-KF induces apoptosis. lndeed, we determined that TrkC-KF associates in the cytoplasm with the Cobral protein, allowing its transport to the mitochondria : TrkC-KF enables Bax activation, which releases the cytochrome C forming the apoptosome. TrkC-KF is also transported by importins into the nucleus, where it directly interacts with the transcription factor Heyl. This complex inhibits MDM2 transcription, allowing p53 stabilisation : p53 activates the transcription of proapoptotic genes, among them Cobral and Bax. TrkC-KF has therefore a dual signalisation, one mitochondrial pathway enabling the apoptosome formation, one nuclear pathway upregulating the transcription of TrkC-KF partners. We then aimed at defining the biological relevance of this apoptotic signaling of TrkC, both during the development and tumorigenesis. lndeed, TrkC expression, in the absence of NT-3, induces in vivo the apoptosis of developing neurons in the nervous system. Moreover, NT-3-KO mice show a loss of 70% of neurons in the forming dorsal root ganglia (DRG), while TrkC-KO mice show only a 30% loss.

Thesis (Ph.D.). / Written for the Dept. of Pharmacology and Therapeutics. Title from title page of PDF (viewed 2008/05/09). Includes bibliographical references.

Le récepteur à neurotrophine TRKC a initialement été montré comme induisant la mortcellulaire par apoptose en l'absence de son ligand, NT-3. Cette mort cellulaire a tout d'abordété décrite comme étant importante dans la régulation de la survie neuronale, pendant laformation du système nerveux sympathique. Plus tard, elle a été montrée comme étantimpliquée dans différents types de cancer.Au cours de ma thèse, je me suis concentré sur la caractérisation moléculaire de la cascade designalisation conduisant à l'induction de l'apoptose par TRKC. Afin d'induire l'apoptose, ledomaine intracellulaire de TRKC est clivé par les caspases en deux sites, ce qui entraine lagénération d'un fragment pro-apoptotique, TRKC KF (Killer Fragment). Plusieurs partenairespotentiels de TRKC KF ont été identifiés lors d'un crible double-hybride. Initialement, je mesuis focalisé sur l'un d'eux, COBRA1, un cofacteur de BRCA1.Je montre ici que COBRA1 est requis pour la mort cellulaire induite par TRKC, à la fois invitro et in vivo, dans des neurones primaires. COBRA1 semble stabiliser et accumuler TRKCKF à la mitochondrie, où TRKC KF entraine l'activation de BAX et ensuite le relargage ducytochrome c. En conclusion, il semblerait que la mort cellulaire induite par TRKC estdépendante de la voie apoptotique intrinsèque. J'ai aussi pris part à deux autres projets décrivant le rôle de TRKC comme un suppresseur de tumeur potentiel dans le neuroblastome et le cancer colorectal. Nous avons montré dans leneuroblastome que la fonction pro-apoptotique de TRKC est invalidée par une boucleautocrine de production de NT3, qui peut être ciblée lors d'une approche thérapeutique. Dansle cancer colorectal, nous avons décrit un second mécanisme par lequel les cellules tumoraleséchappent à l'apoptose induite par TrkC. Il s'agit d'une perte de l'expression de TrkC due àune hypermethylation du promoteur.

The correct development and function of CNS is critical for brain health of the organism. Early or chronic stress causes prominent alterations in brain function, and affects the expression of neurotrophic factors in limbic brain regions involved in the regulation of mood and cognition. Recent evidences have opened the idea that in complex organisms, an altered expression of certain neurotrophins by stress could be involved in the onset and pathophysiology of most psychiatric disorders, such as depression, squizophrenia or anxiety disorders. It is hypothesized that altered levels of neurotrophic factors could contribute to the atrophy and cell death of these regions, including the hippocampus and prefrontal cortex, which would produce a malfunction in limbic-related areas, and as a consequence, a precipitation or worsening of psychiatric illnesses. We were interested in panic disorder pathophysiology, which is a stress-related disorder and is characterized by an altered cognitive processing of emotional information. Although little evidence has been found supporting a neurotrophic role in PD, recent data has revealed that NT-3/TrkC signaling might play a key role in limbic system morphology and function. Therefore, we suggest that NT-3/TrkC system is involved in PD pathogenesis. The main objective in the work of this doctoral thesis lie to determine the role of NTRK3 gene, that codifies for TrKC, in emotional cognition and stress response processes that underlies PD. To this end, we used a genetically modified mouse model of NTRK3 overexpression, which was validated as a model of PD. Here, it is characterized the effects produced by the increase of NTRK3 expression in the CNS, focusing in neural alterations that might influence changes in cognitive processes involved in coping strategies. Moreover, it is studied the mechanisms that underlie in these processes by different approaches, 1/physiologically, measuring the HPA axis response, 2/brain activation, analyzing the activation pattern to a stress stimulus, 3/cellular and gene expression profiling, characterizing key brain regions in cognitive processes, and 4/pharmacologically, studying neurotransmitters function.

Le récepteur à neurotrophine TrkC a été identifié comme étant un récepteur à dépendance : en l'absence de son ligand NT-3, il déclenche l'apoptose. En effet, la survie des cellules qui expriment ces récepteurs dépend de la disponibilité en ligand, un mécanisme qui inhibe la prolifération incontrôlée et la migration des cellules tumorales. TrkC, en tant que récepteur à tyrosine kinase, est généralement considéré comme un proto-oncogène. Or nous montrons que l'expression TrkC est diminuée dans une grande fraction des cancers colorectaux humains, principalement par méthylation du promoteur de TrkC. En outre, ce mécanisme confère un avantage sélectif aux lignées cellulaires colorectales pour inhiber la mort des cellules tumorales. De plus, la réexpression de TrkC dans les lignées tumorales colorectales est associée à la mort des cellules tumorales et à l'inhibition in vitro des caractéristiques de transformation cellulaire, et in vivo de la croissance tumorale. Ensemble, ces données permettent de conclure que TrkC est un gène suppresseur de tumeur dans le cancer colorectal. Le mécanisme moléculaire par lequel TrkC déclenche l'apoptose implique le clivage de son domaine intracellulaire, ce qui libère un fragment pro-apoptotique (TrkC KF). Nous montrons que TrkC KF interagit avec Cobra1, un cofacteur de BRCA1, et que Cobra1 est nécessaire à l'apoptose induite par TrkC. Cobra1 conduit TrkC KF à la mitochondrie, où il favorise l'apoptose apoptosome-dépendante. Ainsi, nous proposons qu'en l'absence de NT-3, le clivage protéolytique de TrkC conduit à la libération d'un fragment tueur qui déclenche l'apoptose mitochondriale, via le recrutement de Cobra1