A hipertensão arterial essencial é caracterizada pela elevação crônica da pressão arterial e representa o principal fator de risco para doenças cardiovasculares e renais. O rim participa do controle da pressão arterial e alterações intrínsecas no manuseio renal de sódio desempenham papel importante na patogênese da hipertensão essencial. Os túbulos proximais renais são responsáveis pela reabsorção da maior parte do sódio filtrado nos glomérulos e a maior parte da reabsorção de sódio neste segmento faz-se através da troca de Na+ por H+ em membrana apical, mediada pela isoforma 3 do trocador Na+/H+ (NHE3). Entretanto, os dados existentes referentes à modulação renal do NHE3 em modelos de hipertensão são ainda conflitantes. Este estudo teve como objetivo avaliar as possíveis alterações funcionais do trocador Na+/H+ NHE3 em túbulo proximal renal na linhagem SHR no estágio de préhipertensão (5 semanas) e de hipertensão (14 semanas) e investigar se estas alterações são acompanhadas de alterações na atividade e na expressão da proteína cinase A (PKA) e de proteínas fosfatase-1 (PP1). Por meio de microperfusão estacionária in vivo mediu-se a atividade do NHE3 em túbulo proximal e verificou-se que a reabsorção de bicarbonato foi reduzida em 62 ± 6 % (P < 0,001) na transição do J-SHR para o A-SHR enquanto foi aumentada em 113 ± 10 % (P < 0,001) na transição entre o J-WKY e o A-WKY. A atividade estimulada do NHE3 em J-SHR é decorrente da redistribuição do NHE3 do domínio intermicrovilar (IMV) para o domínio das microvilosidades (MMV) e do baixo nível de fosforilação da serina 552, sítio consenso para a PKA. Por outro lado, durante a fase de hipertensão, a atividade diminuída do NHE3 deve-se à sua redistribuição para o IMV e ao aumento da fosforilação na serina 552. Para testar a hipótese de que os níveis de fosforilação do NHE3 estariam aumentados em túbulo proximal de SHR adulto devido ao aumento da atividade da PKA e/ou à diminuição na atividade da PP1, foram avaliados tanto os níveis de fosforilação quanto a atividade do NHE3 em SHR jovens e adultos em resposta ao 6MB-cAMP (análogo ao cAMP que ativa especificamente a PKA). O JSHR apresentou um aumento tanto nos níveis de fosforilação da serina 552 (179 ± 14 %, P < 0,001) quanto nos de inibição da atividade (65 ± 10 %, P < 0,001) do NHE3 em relação ao J-SHR em resposta ao 6MB-cAMP. Já no A-SHR, a fosforilação da serina 552 aumentou moderadamente (36 ± 4 %, P < 0,01), assim como inibiu moderadamente (23 ± 9 %, P < 0,05) a atividade do NHE3 em resposta ao 6MBcAMP. Adicionalmente, verificou-se que não houve alteração da atividade da PKA entre os animais nem ao longo da idade e nem entre as linhagens. Por sua vez, o JSHR apresentou maior atividade da PP1 que o A-SHR (1640 ± 107 vs. 940 ± 119 pM/?g, P < 0,01). Além disso, houve uma diminuição na expressão da PP1? no ASHR (32 ± 8 %, P < 0,01) quando comparado ao J-SHR. Os dados sugerem que o NHE3 é diferencialmente regulado antes e após o desenvolvimento da hipertensão em SHR por mecanismos que envolvem modificações pós-transcricionais e distribuição subcelular. Além do mais, a regulação diferencial dos níveis de fosforilação do NHE3 tubular proximal antes e após o desenvolvimento da hipertensão em SHR é devida, provavelmente, a alterações na atividade e na expressão da PP1 / Essential hypertension is characterized by chronic elevation of blood pressure and represents the major risk factor for cardiovascular and renal diseases. The kidney participates in the blood pressure control and intrinsic changes in renal sodium handling play an important role in the pathogenesis of essential hypertension. The renal proximal tubule is responsible for reabsorption of the great majority of sodium that is filtered by the glomerulus and the principal apical membrane mechanism for sodium reabsorption in this nephron is Na+/H+ exchanger isoform 3 (NHE3)- mediated Na+/H+ exchange. However, conflicting data have been reported with regard to NHE3 modulation in experimental models of hypertension. This study aimed to evaluate the possible functional changes of the Na+/H+ exchanger NHE3 in the renal proximal tubule of SHR both at the pre-hypertensive (5 weeks) and at hypertensive (14 weeks) stages and to investigate whether these changes were accompanied by changes in the activity and/or expression of protein kinase A (PKA) and protein phosphatase 1 (PP1). Proximal tubule NHE3 activity was measured by means of stationary microperfusion. Bicarbonate reabsorption was found to be decreased by 62 ± 6 % (P < 0.001) in the transition from youth to adulthood in SHR (Y-SHR to A-SHR), whereas in the transition from Y-WKY to A-WKY it increased by 113 ± 10 % (P < 0.001). Stimulated NHE3 activity in Y-SHR was due to redistribution of NHE3 from intermicrovilar domain (IMV) to microvilar domain (MMV) and to a lower level of serine 552 phosphorylation, a consensus site for PKA. Conversely, during the hypertensive stage, decreased NHE3 activity was due to increased redistribution of NHE3 to the IMV domain and increased phosphorylation at serine 552. To test the hypothesis that the increased levels of NHE3 phosphorylation in the proximal tubule of adult SHR were due to increased PKA activity and/or decreased PP1 activity, it was evaluated both phosphorylation levels and activity of NHE3 in young and adult SHR in response to 6MB-cAMP (an cAMP analog that specifically activates PKA). Y-SHR showed an increase both in the phosphorylation levels at serine 552 (179 ± 14 %, P < 0.001) and in the inhibition of NHE3 transport activity (65 ± 10 %, P < 0.001) compared to Y-SHR in response to 6MB-cAMP. With respect to A-SHR, the phosphorylation of serine 552 was slightly increased (36 ± 4 %, P < 0.01) and NHE3 activity was mildly inhibited (23 ± 9 %, P < 0.05) in response to 6MB-cAMP. Additionally, PKA activity remained unchanged with both age and strain. Nevertheless, Y-SHR exhibited higher PP1 activity than A-SHR (1640 ± 107 vs. 940 ± 119 pM/?g, P < 0.01). Furthermore, PP1? expression was decreased in the renal cortex of A-SHR (32 ± 8 %, P < 0.01) compared to Y-SHR. Taken together, these data suggest that NHE3 is differentially regulated before and after development of hypertension in SHR by mechanisms involving post-translational modifications and subcellular distribution. Moreover, the differential regulation of proximal tubule NHE3 phosphorylation levels before and after development of hypertension in SHR is most likely due to changes on the activity and expression of PP1

A hipertensão arterial essencial é caracterizada pela elevação crônica da pressão arterial e representa o principal fator de risco para doenças cardiovasculares e renais. O rim participa do controle da pressão arterial e alterações intrínsecas no manuseio renal de sódio desempenham papel importante na patogênese da hipertensão essencial. Os túbulos proximais renais são responsáveis pela reabsorção da maior parte do sódio filtrado nos glomérulos e a maior parte da reabsorção de sódio neste segmento faz-se através da troca de Na+ por H+ em membrana apical, mediada pela isoforma 3 do trocador Na+/H+ (NHE3). Entretanto, os dados existentes referentes à modulação renal do NHE3 em modelos de hipertensão são ainda conflitantes. Este estudo teve como objetivo avaliar as possíveis alterações funcionais do trocador Na+/H+ NHE3 em túbulo proximal renal na linhagem SHR no estágio de préhipertensão (5 semanas) e de hipertensão (14 semanas) e investigar se estas alterações são acompanhadas de alterações na atividade e na expressão da proteína cinase A (PKA) e de proteínas fosfatase-1 (PP1). Por meio de microperfusão estacionária in vivo mediu-se a atividade do NHE3 em túbulo proximal e verificou-se que a reabsorção de bicarbonato foi reduzida em 62 ± 6 % (P < 0,001) na transição do J-SHR para o A-SHR enquanto foi aumentada em 113 ± 10 % (P < 0,001) na transição entre o J-WKY e o A-WKY. A atividade estimulada do NHE3 em J-SHR é decorrente da redistribuição do NHE3 do domínio intermicrovilar (IMV) para o domínio das microvilosidades (MMV) e do baixo nível de fosforilação da serina 552, sítio consenso para a PKA. Por outro lado, durante a fase de hipertensão, a atividade diminuída do NHE3 deve-se à sua redistribuição para o IMV e ao aumento da fosforilação na serina 552. Para testar a hipótese de que os níveis de fosforilação do NHE3 estariam aumentados em túbulo proximal de SHR adulto devido ao aumento da atividade da PKA e/ou à diminuição na atividade da PP1, foram avaliados tanto os níveis de fosforilação quanto a atividade do NHE3 em SHR jovens e adultos em resposta ao 6MB-cAMP (análogo ao cAMP que ativa especificamente a PKA). O JSHR apresentou um aumento tanto nos níveis de fosforilação da serina 552 (179 ± 14 %, P < 0,001) quanto nos de inibição da atividade (65 ± 10 %, P < 0,001) do NHE3 em relação ao J-SHR em resposta ao 6MB-cAMP. Já no A-SHR, a fosforilação da serina 552 aumentou moderadamente (36 ± 4 %, P < 0,01), assim como inibiu moderadamente (23 ± 9 %, P < 0,05) a atividade do NHE3 em resposta ao 6MBcAMP. Adicionalmente, verificou-se que não houve alteração da atividade da PKA entre os animais nem ao longo da idade e nem entre as linhagens. Por sua vez, o JSHR apresentou maior atividade da PP1 que o A-SHR (1640 ± 107 vs. 940 ± 119 pM/?g, P < 0,01). Além disso, houve uma diminuição na expressão da PP1? no ASHR (32 ± 8 %, P < 0,01) quando comparado ao J-SHR. Os dados sugerem que o NHE3 é diferencialmente regulado antes e após o desenvolvimento da hipertensão em SHR por mecanismos que envolvem modificações pós-transcricionais e distribuição subcelular. Além do mais, a regulação diferencial dos níveis de fosforilação do NHE3 tubular proximal antes e após o desenvolvimento da hipertensão em SHR é devida, provavelmente, a alterações na atividade e na expressão da PP1 / Essential hypertension is characterized by chronic elevation of blood pressure and represents the major risk factor for cardiovascular and renal diseases. The kidney participates in the blood pressure control and intrinsic changes in renal sodium handling play an important role in the pathogenesis of essential hypertension. The renal proximal tubule is responsible for reabsorption of the great majority of sodium that is filtered by the glomerulus and the principal apical membrane mechanism for sodium reabsorption in this nephron is Na+/H+ exchanger isoform 3 (NHE3)- mediated Na+/H+ exchange. However, conflicting data have been reported with regard to NHE3 modulation in experimental models of hypertension. This study aimed to evaluate the possible functional changes of the Na+/H+ exchanger NHE3 in the renal proximal tubule of SHR both at the pre-hypertensive (5 weeks) and at hypertensive (14 weeks) stages and to investigate whether these changes were accompanied by changes in the activity and/or expression of protein kinase A (PKA) and protein phosphatase 1 (PP1). Proximal tubule NHE3 activity was measured by means of stationary microperfusion. Bicarbonate reabsorption was found to be decreased by 62 ± 6 % (P < 0.001) in the transition from youth to adulthood in SHR (Y-SHR to A-SHR), whereas in the transition from Y-WKY to A-WKY it increased by 113 ± 10 % (P < 0.001). Stimulated NHE3 activity in Y-SHR was due to redistribution of NHE3 from intermicrovilar domain (IMV) to microvilar domain (MMV) and to a lower level of serine 552 phosphorylation, a consensus site for PKA. Conversely, during the hypertensive stage, decreased NHE3 activity was due to increased redistribution of NHE3 to the IMV domain and increased phosphorylation at serine 552. To test the hypothesis that the increased levels of NHE3 phosphorylation in the proximal tubule of adult SHR were due to increased PKA activity and/or decreased PP1 activity, it was evaluated both phosphorylation levels and activity of NHE3 in young and adult SHR in response to 6MB-cAMP (an cAMP analog that specifically activates PKA). Y-SHR showed an increase both in the phosphorylation levels at serine 552 (179 ± 14 %, P < 0.001) and in the inhibition of NHE3 transport activity (65 ± 10 %, P < 0.001) compared to Y-SHR in response to 6MB-cAMP. With respect to A-SHR, the phosphorylation of serine 552 was slightly increased (36 ± 4 %, P < 0.01) and NHE3 activity was mildly inhibited (23 ± 9 %, P < 0.05) in response to 6MB-cAMP. Additionally, PKA activity remained unchanged with both age and strain. Nevertheless, Y-SHR exhibited higher PP1 activity than A-SHR (1640 ± 107 vs. 940 ± 119 pM/?g, P < 0.01). Furthermore, PP1? expression was decreased in the renal cortex of A-SHR (32 ± 8 %, P < 0.01) compared to Y-SHR. Taken together, these data suggest that NHE3 is differentially regulated before and after development of hypertension in SHR by mechanisms involving post-translational modifications and subcellular distribution. Moreover, the differential regulation of proximal tubule NHE3 phosphorylation levels before and after development of hypertension in SHR is most likely due to changes on the activity and expression of PP1

Este estudo investigou o efeito da glicose sobre a atividade e expressão da isoforma 1 do trocador Na+/H+ (NHE1) e da H+-ATPase do tipo vacuolar, em células MDCK (Mardin Darby Canine Kidney), linhagem derivada de rim de cão, que apresenta características similares às células principais e intercalares das porções distais do néfron. Por microscopia de fluorescência, se avaliou a velocidade de recuperação do pHi (dpHi/dt) e a capacidade tamponante (<font face=\"symbol\">bi). A partir desses parâmetros, se calculou o efluxo de H+ (JH+). Por Western blot, se avaliou a expressão de NHE1 e da subunidade E da H+-ATPase do tipo vacuolar. Resultados: Na condição controle o efluxo de H+ foi de 6.27 ± 0.51 mM/min (n = 9). O tratamento agudo com glicose (25 mM) aumentou o efluxo de H+ via NHE1, o qual foi modulado pela PI3 cinase. Na mesma condição, não se observou alterações na atividade da H+-ATPase. O tratamento crônico com glicose (25 mM) induziu significante aumento do efluxo de H+, via NHE1 e H+-ATPase. O efeito estimulador da glicose sobre a atividade de NHE1 e H+-ATPase foi dependente da atividade da p38 MAP cinase. Além disso, o tratamento crônico com glicose (25 mM) induziu fosforilação do sistema ezrin/radixin/moesin (ERM) e Akt. Conclusões: Nossos resultados indicam que no tratamento agudo com glicose (25 mM), o NHE1 foi modulado pela PI3 cinase. Contudo, no tratamento crônico com glicose (25 mM), a atividade do NHE1 foi modulada pelo sistema ERM/Akt e a atividade da H+-ATPase foi modulada pela p38 MAP cinase. / This study investigated the effect of glucose on the activity and expression of Na+/H+ exchanger isoform 1 (NHE1) and vacuolar H+-ATPase, in Mardin Darby Canine Kidney (MDCK) cells from dog kidney, with similar characteristics to principal and intercalated cells of the distal nephron. The pHi recovery rate (dpHi/dt) and the buffering capacity (<font face=\"symbol\">bi) was evaluated through fluorescence microscopy. From these parameters the H+ efflux (JH+) was calculated. By Western blot, the NHE1 and H+-ATPase (E subunit) expression was evaluated. Results: In the control situation the H+ efflux was 6.27 ± 0.51 mM/pH units (n = 9). Acute treatment with glucose (25 mM) increased the H+ efflux via NHE1, which was modulated by PI3 kinase. In the same condition, the H+-ATPase activity did not change. Chronic treatment with glucose (25 mM) induced significant increase in H+ efflux via NHE1 and H+-ATPase. The stimulatory effect of glucose on the NHE1 and H+-ATPase activity was dependent on p38 MAP kinase activity. Furthermore, chronic treatment with glucose (25 mM) induced Ezrin/radixin/moesin (ERM) and Akt phosphorylation. Conclusions: Our results indicate that during the acute treatment with glucose (25 mM), the NHE1 is modulated by PI3 kinase. However, during chronic treatment with glucose (25 mM), NHE1 activity was modulated by the ERM/Akt system and of H+-ATPase activity was modulated by p38 MAP Kinase.