Orientador: Marcela Sorelli Carneiro Ramos / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2012

O objetivo deste estudo foi investigar o efeito da sobrecarga de leucina no músculo sóleo de ratos submetidos à DGO (Distração Gradual Osteogênica). Vinte e cinco ratos Wistar foram divididos em 5 grupos: controle, sham-lengthening, leucina, DGO e DGO+leucina. A DGO de 2mm/dia foi realizada na tíbia até um ganho de 20% e a sobrecarga de leucina (114mM) foi administrada oralmente. Avaliou-se: estrutura histológica muscular, número de sarcômeros em série, área dos diferentes tipos de fibras musculares e análise do tecido conjuntivo. Os dados obtidos dos cortes histológicos mostram que a DGO promoveu intensa lesão muscular e aumento do tecido conjuntivo, o que foi minimizado pela leucina. Houve uma adição no número de sarcômeros em série (26%) durante a DGO, que foi intensificada pela leucina (33%). Observou-se uma diminuição da área de todos os tipos de fibras com a DGO e um aumento da área das fibras do tipo I com a leucina. Portanto, a leucina minimizou os efeitos causados pela DGO, podendo esta ser utilizada como um agente terapêutico durante a DGO no futuro. / The goal of the present study was to investigate the effect of leucine overload in the rat soleus muscle before and along DGO (Gradual Distraction Osteogenesis). Twenty five male Wistar rats were divided into 5 groups: control, sham-lengthening, leucine, DGO and DGO+leucine. The DGO was 2mm/day and the leucine overload (114mM) was administrated orally. Subsequently analyzed: histological cross-section, sarcomere serial number and cross-sectional area of the types fibers and connective tissue. The histological data showed that the DGO promoted intense injury and increase of connective tissue, which can be minimized by leucine. The sarcomere serial number increased by ~26% and leucine overload increased this gain to 33%. The fibers types showed a decrease of the cross-section area of the all type fibers with the DGO and increase of the type I fibers area with leucine overload. We conclude that leucine overload is a potential therapeutical device in DGO, seeking improvement of skeletal muscle longitudinal growth.

O presente estudo objetivou a avaliação do potencial regenerativo e trófico das CS e do fator neurotrófico PEDF sobre os neurônios da medula espinal através da cultura destas células in vitro assim como no modelo experimental da lesão medular contusa in vivo. CS foram cultivadas a partir de fragmentos de nervo ciático de ratos adultos jovens. As culturas primárias foram purificadas e utilizadas em experimentos in vitro e in vivo. Para avaliar se a cultura de CS tratadas com o PEDF proporciona o trofismo dos neurônios da medula espinal, estes foram cultivados a partir de fragmentos da medula espinal de ratos Wistar neonatos e tratados com o meio condicionado das CS (MCCS) pré-tratadas ou não com formas específicas do PEDF. A resposta trófica foi estudada através da quantificação do número de células bem como da área dos prolongamentos e dos corpos celulares dos neurônios cultivados sobreviventes no decurso temporal da cultura, utilizando-se método estereológico específico. Em outra série de experimentos, Ratos Wistar adultos foram submetidos à lesão medular contusa no 10º-11° segmento torácico pelo sistema NYU Impactor e tratados com inoculações locais de CS e do seu meio condicionado na presença ou não do PEDF. Ao término do procedimento cirúrgico, os ratos foram submetidos aos testes do comportamento BBB, CBS durante 6 semanas. Os tratamentos aplicados à cultura de neurônios da medula espinal demonstraram que o MCCS, pré-tratado ou não com diferentes formas moleculares do PEDF e os fatores por si só possuem ações tróficas e plásticas em relação aos neurônios da medula espinal. Foi observado que o MCCS exerceu um efeito de arborização e de trofismo sobre o corpo neuronal dos neurônios medulares, sendo que este efeito foi potencializado quando o MCCS foi obtido a partir de CS pré-tratadas com os fatores nPEDF ou coPEDF, e de intensidade ainda maior quando as formas puras dos fatores em questão foram adicionadas à cultura. Os animais submetidos ao trauma contuso da medula espinal que foram tratados com a inoculação das CS, pré-tratadas ou não com o nPEDF, do meio condicionado destas células e dos fatores nPEDF e coPEDF apresentaram melhor recuperação funcional em relação ao grupo controle. A partir dos dados obtidos neste trabalho pode-se dizer que as CS, seu meio condicionado e o PEDF possuem ações importantes sobre os neurônios da medula espinal, possibilitando a modulação do processo de recuperação funcional deste órgão após o trauma. / The present study aimed the assessment of the trophic and regenerative potential of the Schwann cells (SC) and of the neurotrophic factor PEDF on the spinal cord neurons by means of cultures of those cells in vitro as well as in an experimental model of a contused spinal cord lesion in vivo. SC were cultivated from sciatic nerves fragments of young adult rats. The primary cultures were purified and used in in vitro and in vivo experiments. To evaluate if the SC cultures treated with PEDF provide the trophism of the spinal cord neurons, these were cultivated from spinal cords fragments of new born rats and treated with SC conditional medium (SCCM), of cells pre-treated or not with specifics isoforms of PEDF. The trophic responses were analyzed by the quantification of the cell number, and the area of sprounting and perycaria of the survived neuronal cells in the culture time course using a specific stereological method. In another series of experiment, adults Wistar rats were submitted to a contuse spinal cord lesion in the 10º-11º thoracic level by means of the NYU Impactor and treated with local injection of SC and your CM with the presence or not of the PEDF. In the end of the surgical procedure, the rats were submitted to behaviors testes as the BBB and the CBS during the 6 follow weeks .The spinal cord neuron treatments show that the SCCM, prétreated or not with specifics molecular isoforms of PEDF and this factors by themselves demonstrated trophic and plastic actions with the spinal cord neurons. It was observed that the SCCM exerted a sprouting and trophic effect on the neuronal body of the spinal cord neurons, and that this effect was enhanced when the SCCM was achieved from SC pre-treated with PEDF, and even better when the pures forms of the PEDF was added to the culture. The animals that received the spinal cord lesion and were treated with injection of SC, pre-treated or not with nPEDF, or with the conditioned medium of those cells and the factors nPEDF or coPEDF showed a better functional recovery when compared to the control groups. The results of this study showed that the SC, your conditioned medium and the PEDF play an important role in the spinal cord neurons, allowing the modulation of the functional recovery process of this organ after the trauma.

Made available in DSpace on 2016-12-12T17:32:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Resumo Caroline Cunha.pdf: 22726 bytes, checksum: 98af822763c56d74f9949f09d5842553 (MD5) Previous issue date: 2014-08-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The mTOR protein is involved in growth, proliferation and cell metabolism. In skeletal muscle the mTOR is considered the major regulator of muscle fiber size, modulating the proteic synthesis. In neuronal cells, increased protein synthesis is associated with the activation of mTOR and its substrate p70S6K via BDNF. It is known that locomotor treadmill training (LTT) is able to modulate the expression of BDNF, what could be interfering in the mTOR/p70S6K activation. However, the regulatory mechanism of muscular protein synthesis mediated by the LTT was not described in the literature. Thus the aim of this study was to investigate the possible effects of LTT on muscle trophism and its protein signaling pathway in rats with incomplete spinal cord injury (SCI). Thirty-three females rats were randomly divided into 3 groups: control (no LME and untrained, n = 11), SCI trained (n = 11) and untrained SCI (n = 11). The animals were first anesthetized and a toracic laminectomy (T8-T9) was performed to display the dorsal spinal cord. The animals in groups with SCI received a latero-lateral compression using a neurovascular clip for 1 minute. All animals underwent weekly evaluation of locomotor recovery using the BBB scale. Seven days after injury, the LTT was employed with partial body weight support lasting 30 minutes, carried 1/day, 5 times a week, for 4 weeks. After the last session, the animals received an anesthetic overdose, and had the soleus muscles dissected and weighed to calculate the muscle trophism, measured by the ratio of muscle weight / weight of the animal. Samples of the central portion of the right soleus muscle were removed and frozen for quantification of the mTOR, p-p70S6K, TrkB and BDNF protein expressions using Western blot and ELISA biochemical techniques. The BBB scale scores were analyzed using repeated measures ANOVA. While the analysis of the muscular trophism and quantification of protein expressions were performed using one-way ANOVA. All animals recovered locomotor activity, with similar trends for both the trained and untrained groups. However, the LTT was effective for increasing muscle trophism in rats with SCI (p <0.05) and this morphological change was accompanied by increasing the expression of the mTOR protein (p <0.05) and its substrate p - p70S6K (p <0.05) in the soleus muscle of the trained group. Furthermore, LTT increase the trkB receptor and reduce the amount of BDNF expression (p <0.05) in the studied muscle. These results suggest that LTT increased muscle sensitivity for capture BDNF, by increasing the TrkB receptor expression, causing the reduction of this neurotrophin in studied muscle. Thus, this study made an evidence that muscle trophism induced by LTT involves activation cascade mTOR/p70S6K possibly up- regulated by BDNF. / A proteína mTOR está envolvida no crescimento, proliferação e metabolismo celular. No músculo esquelético a mTOR é considerada a maior reguladora do tamanho da fibra muscular, modulando a síntese de proteínas. Em células neuronais, o aumento da síntese proteica está relacionado com a ativação da proteína mTOR e seu substrato p70S6K via BDNF. Sabe-se que treinamento locomotor em esteira (TLE) é capaz de modular a expressão de BDNF, o que poderia interferir na via mTOR/p70S6K nos tecidos neuronal e muscular. Contudo, o mecanismo regulatório da síntese proteica muscular mediado pelo TLE, ainda não foi descrito na literatura. Assim o objetivo do estudo foi investigar os efeitos do TLE sobre o trofismo muscular e sua via de sinalização proteica, em ratos com lesão medular espinal (LME) incompleta. Trinta e três ratas foram randomicamente divididas em 3 grupos: controle (sem LME e sem treinamento, n=11), LME treinado (n=11) e LME não treinado (n=11). Os animais foram primeiramente anestesiados e uma laminectomia torácica foi realizada (T8-T9) para exposição dorsal da medula espinal. Os animais dos grupos com LME receberam uma compressão medular latero-lateral realizada por um clipe neurovascular por 1 minuto. Todos os animais foram submetidos à avaliação semanal da recuperação locomotora utilizando à escala BBB. Sete dias após a lesão, iniciou-se o TLE com suporte parcial de peso com duração de 30 minutos, realizado 1x/dia, 5x/semana por 4 semanas. Após a última sessão, os animais receberam uma overdose anestésica, tiveram os músculos sóleos dissecados e pesados para o calculo do trofismo muscular, mensurado pela relação do peso do músculo/peso do animal. Amostras da porção central do músculo sóleo direito foram retiradas e congeladas para quantificação da expressão das proteínas mTOR, p-p70S6K, TrKB e BDNF utilizando as técnicas bioquímicas Western Blot e ELISA. Os escores da escala BBB, foram analisados usando ANOVA para medidas repetidas. Enquanto a analise do trofismo muscular e da quantificação da expressão proteica foram realizadas utilizando ANOVA one way. Todos os animais com LME recuperaram a atividade locomotora, com evolução similar para ambos o grupos treinados e não treinados. Contudo, o TLE se mostrou eficaz para o aumento do trofismo muscular em ratos com LME (p<0,05) sendo que esta mudança morfológica foi acompanhada do aumento da expressão da proteína mTOR (p<0,05) e de seu substrato p-p70S6K (p<0,05) para o grupo treinado. Além disso, o TLE aumentou a expressão do receptor TrKB e reduziu a quantidade de BDNF (p<0,05). Estes resultados sugerem que o TLE aumentou a sensibilidade do músculo em capturar BNDF, via um aumento da expressão dos receptores TrKB, provocando a redução desta neurotrofina no músculo estudado. Dessa forma, este estudo evidencia que o trofismo muscular induzido pelo TLE envolve a ativação da cascata mTOR/p70S6K, possivelmente regulada pelo BDNF.

O presente estudo objetivou a avaliação do potencial regenerativo e trófico das CS e do fator neurotrófico PEDF sobre os neurônios da medula espinal através da cultura destas células in vitro assim como no modelo experimental da lesão medular contusa in vivo. CS foram cultivadas a partir de fragmentos de nervo ciático de ratos adultos jovens. As culturas primárias foram purificadas e utilizadas em experimentos in vitro e in vivo. Para avaliar se a cultura de CS tratadas com o PEDF proporciona o trofismo dos neurônios da medula espinal, estes foram cultivados a partir de fragmentos da medula espinal de ratos Wistar neonatos e tratados com o meio condicionado das CS (MCCS) pré-tratadas ou não com formas específicas do PEDF. A resposta trófica foi estudada através da quantificação do número de células bem como da área dos prolongamentos e dos corpos celulares dos neurônios cultivados sobreviventes no decurso temporal da cultura, utilizando-se método estereológico específico. Em outra série de experimentos, Ratos Wistar adultos foram submetidos à lesão medular contusa no 10º-11° segmento torácico pelo sistema NYU Impactor e tratados com inoculações locais de CS e do seu meio condicionado na presença ou não do PEDF. Ao término do procedimento cirúrgico, os ratos foram submetidos aos testes do comportamento BBB, CBS durante 6 semanas. Os tratamentos aplicados à cultura de neurônios da medula espinal demonstraram que o MCCS, pré-tratado ou não com diferentes formas moleculares do PEDF e os fatores por si só possuem ações tróficas e plásticas em relação aos neurônios da medula espinal. Foi observado que o MCCS exerceu um efeito de arborização e de trofismo sobre o corpo neuronal dos neurônios medulares, sendo que este efeito foi potencializado quando o MCCS foi obtido a partir de CS pré-tratadas com os fatores nPEDF ou coPEDF, e de intensidade ainda maior quando as formas puras dos fatores em questão foram adicionadas à cultura. Os animais submetidos ao trauma contuso da medula espinal que foram tratados com a inoculação das CS, pré-tratadas ou não com o nPEDF, do meio condicionado destas células e dos fatores nPEDF e coPEDF apresentaram melhor recuperação funcional em relação ao grupo controle. A partir dos dados obtidos neste trabalho pode-se dizer que as CS, seu meio condicionado e o PEDF possuem ações importantes sobre os neurônios da medula espinal, possibilitando a modulação do processo de recuperação funcional deste órgão após o trauma. / The present study aimed the assessment of the trophic and regenerative potential of the Schwann cells (SC) and of the neurotrophic factor PEDF on the spinal cord neurons by means of cultures of those cells in vitro as well as in an experimental model of a contused spinal cord lesion in vivo. SC were cultivated from sciatic nerves fragments of young adult rats. The primary cultures were purified and used in in vitro and in vivo experiments. To evaluate if the SC cultures treated with PEDF provide the trophism of the spinal cord neurons, these were cultivated from spinal cords fragments of new born rats and treated with SC conditional medium (SCCM), of cells pre-treated or not with specifics isoforms of PEDF. The trophic responses were analyzed by the quantification of the cell number, and the area of sprounting and perycaria of the survived neuronal cells in the culture time course using a specific stereological method. In another series of experiment, adults Wistar rats were submitted to a contuse spinal cord lesion in the 10º-11º thoracic level by means of the NYU Impactor and treated with local injection of SC and your CM with the presence or not of the PEDF. In the end of the surgical procedure, the rats were submitted to behaviors testes as the BBB and the CBS during the 6 follow weeks .The spinal cord neuron treatments show that the SCCM, prétreated or not with specifics molecular isoforms of PEDF and this factors by themselves demonstrated trophic and plastic actions with the spinal cord neurons. It was observed that the SCCM exerted a sprouting and trophic effect on the neuronal body of the spinal cord neurons, and that this effect was enhanced when the SCCM was achieved from SC pre-treated with PEDF, and even better when the pures forms of the PEDF was added to the culture. The animals that received the spinal cord lesion and were treated with injection of SC, pre-treated or not with nPEDF, or with the conditioned medium of those cells and the factors nPEDF or coPEDF showed a better functional recovery when compared to the control groups. The results of this study showed that the SC, your conditioned medium and the PEDF play an important role in the spinal cord neurons, allowing the modulation of the functional recovery process of this organ after the trauma.

O objetivo deste estudo foi investigar o efeito da sobrecarga de leucina no músculo sóleo de ratos submetidos à DGO (Distração Gradual Osteogênica). Vinte e cinco ratos Wistar foram divididos em 5 grupos: controle, sham-lengthening, leucina, DGO e DGO+leucina. A DGO de 2mm/dia foi realizada na tíbia até um ganho de 20% e a sobrecarga de leucina (114mM) foi administrada oralmente. Avaliou-se: estrutura histológica muscular, número de sarcômeros em série, área dos diferentes tipos de fibras musculares e análise do tecido conjuntivo. Os dados obtidos dos cortes histológicos mostram que a DGO promoveu intensa lesão muscular e aumento do tecido conjuntivo, o que foi minimizado pela leucina. Houve uma adição no número de sarcômeros em série (26%) durante a DGO, que foi intensificada pela leucina (33%). Observou-se uma diminuição da área de todos os tipos de fibras com a DGO e um aumento da área das fibras do tipo I com a leucina. Portanto, a leucina minimizou os efeitos causados pela DGO, podendo esta ser utilizada como um agente terapêutico durante a DGO no futuro. / The goal of the present study was to investigate the effect of leucine overload in the rat soleus muscle before and along DGO (Gradual Distraction Osteogenesis). Twenty five male Wistar rats were divided into 5 groups: control, sham-lengthening, leucine, DGO and DGO+leucine. The DGO was 2mm/day and the leucine overload (114mM) was administrated orally. Subsequently analyzed: histological cross-section, sarcomere serial number and cross-sectional area of the types fibers and connective tissue. The histological data showed that the DGO promoted intense injury and increase of connective tissue, which can be minimized by leucine. The sarcomere serial number increased by ~26% and leucine overload increased this gain to 33%. The fibers types showed a decrease of the cross-section area of the all type fibers with the DGO and increase of the type I fibers area with leucine overload. We conclude that leucine overload is a potential therapeutical device in DGO, seeking improvement of skeletal muscle longitudinal growth.