As novas biotécnicas são ferramentas inovadoras no estudo da fisiologia da reprodução de cães, bem como na preservação do material genético de espécies ameaçadas de extinção. Tendo em vista, pois, a relevância de tais ferramentas, emprestou-se a este estudo o objetivo maior de avaliar os efeitos do 17-ß estradiol, progesterona e do co-cultivo em células da tuba uterina na maturação in vitro de oócitos de cães. Ovários de cadelas em anestro foram fatiados em PBS com 10% SFB. Os oócitos foram selecionados e divididos em 8 grupos: grupo 1 (sem suplementação hormonal), grupo 2 (20 µg/ml de 17-ß estradiol), grupo 3 (20 µg/ml de progesterona), grupo 4 (20 µg/ml de 17-ß estradiol e 20 µg/ml de progesterona), grupo 5 (co-cultivo em células da tuba uterina sem suplementação hormonal), grupo 6 (co-cultivo em células da tuba uterina + 20 mg/ml de 17-ß estradiol), grupo 7 (co-cultivo em células da tuba uterina + 20 µg/ml de progesterona) e grupo 8 (co-cultivo em células da tuba uterina + 20 µg/ml de 17-ß estradiol + 20 µg/ml de progesterona). O cultivo das células da tuba uterina foi realizado por no mínimo 48 horas previamente à adição dos oócitos. Para a maturação, utilizou-se TCM 199 suplementado com 2,5 µg/ml de FSH e 5 µg/ml de LH. Decorridas 48, 72 e 96 horas em estufa a 39&ordm;C, 5% de CO2 em ar e alta umidade, os oócitos foram fixados em paraformaldeído a 4% com Triton 10X e corados com Hoescht 33342 (10 µg/ml) em glicerol. O estágio de maturação nuclear (vesícula germinativa - VG, quebra da vesícula germinativa – QVG, metáfase I – MI, metáfase II – MII, degenerados ou não passíveis de determinação) foi avaliado em microscópio invertido equipado com luz ultravioleta e filtro de 365-420 de excitação/emissão. Os dados foram analisados mediante o PROC NPAR1WAY de análise de variância não paramétrica, sendo o efeito dos tratamentos verificado por meio do teste de Kruskal-Wallis, e as comparações múltiplas do teste de Wilcoxon com os tratamentos comparados dois a dois, considerando as diferenças significativas quando p<0,05. Verificou-se influência positiva da suplementação hormonal no desenvolvimento oocitário in vitro, particularmente com referência à adição de progesterona, associada ou não ao estrógeno. Não houve influência significativa do co-cultivo de células da tuba uterina na maturação oocitária em comparação aos meios de cultivo, sem presença de células epiteliais da tuba uterina, suplementados com hormônios esteróides. Conquanto sem significância estatística, verificou-se tendência de os oócitos, obtidos de cadelas em anestro, desenvolverem-se ao estágio de metáfase II após o período de maturação de 96 horas. Demonstrou-se, portanto, ser plenamente exeqüível o estudo da maturação de oócitos de cães em sistemas de cultivo in vitro a partir de ovários obtidos por ovário-histerectomia, tal estudo propicia, ademais, a pesquisa de características reprodutivas fisiológicas da espécie. / Recent biotechniques are innovative tools for the canine reproductive physiology research, as well as for assisted reproduction of endangered species. The aim of this study was to evaluate the effects of estradiol-17ß, progesterone and the co-culture with oviductal ephitelial cells on in vitro maturation. Ovaries from anestrous bitches were sliced in PBS with 10% FCS. Oocytes were selected and distributed in 8 groups: group 1 (no hormonal suplementation), group 2 (estradiol-17ß at 20 µg/ml), group 3 (progesterone at 20 µg/ml), group 4 (estradiol-17ß at 20 µg/ml + progesterone at 20 µg/ml), group 5 (co-culture in oviductal ephitelial cells without hormonal suplementation), group 6 (co-culture in oviductal ephitelial cells + estradiol-17ß at 20 µg/ml), group 7 (co-culture with oviductal ephitelial cells + progesterone at 20 µg/ml) and group 8 (co-culture with oviductal ephitelial cells + estradiol-17ß at 20 µg/ml + progesterone at 20 µg/ml). Oviductal ephitelial cells culture was performed at least 48 hours prior to oocyte co-culture. For in vitro maturation, TCM 199 supplemented with FSH (2.5 &micro;g/ml) and LH (5 &micro;g/ml) was utilized. After periods of 48, 72 and 96 hour at 39ºC in humidified atmosphere of 5% CO2 in air, oocytes were fixed with Triton-X10 in paraformaldehyde at 4% and and stained with Hoescht 33342 (10 µg/ml) in glycerol. Oocytes were examined through an inverted fluorescence microscope equipped with a 365-420 nm wavelength excitation/emisson filter. Nuclear maturation was classified according to chromatin configuration as: germinal vesicle stage (GV), germinal vesicle break down (GVBD), metaphase I (MI), metaphase II (MII) and degenerated and unidentifiable oocytes. Data was evaluated through PROC NPAR1WAY of non parametrical variance analysis and treatment was verified by the Kruskal-Wallis test and the Wilcoxon test for multiple comparisions. Differences were considered significant at p<0.05. Positive influence of hormonal supplementation for oocyte development rates was verified, particularly with respec to progesterone. No significant influence of oviductal cells co-culture was however verified. In addition, a tendency of the oocytes reaching metaphase II in the 96 hour period was observed. Therefore, the study of canine in vitro oocyte maturation is feasible and provides an important tool for reproductive physiology research.

As novas biotécnicas são ferramentas inovadoras no estudo da fisiologia da reprodução de cães, bem como na preservação do material genético de espécies ameaçadas de extinção. Tendo em vista, pois, a relevância de tais ferramentas, emprestou-se a este estudo o objetivo maior de avaliar os efeitos do 17-ß estradiol, progesterona e do co-cultivo em células da tuba uterina na maturação in vitro de oócitos de cães. Ovários de cadelas em anestro foram fatiados em PBS com 10% SFB. Os oócitos foram selecionados e divididos em 8 grupos: grupo 1 (sem suplementação hormonal), grupo 2 (20 µg/ml de 17-ß estradiol), grupo 3 (20 µg/ml de progesterona), grupo 4 (20 µg/ml de 17-ß estradiol e 20 µg/ml de progesterona), grupo 5 (co-cultivo em células da tuba uterina sem suplementação hormonal), grupo 6 (co-cultivo em células da tuba uterina + 20 mg/ml de 17-ß estradiol), grupo 7 (co-cultivo em células da tuba uterina + 20 µg/ml de progesterona) e grupo 8 (co-cultivo em células da tuba uterina + 20 µg/ml de 17-ß estradiol + 20 µg/ml de progesterona). O cultivo das células da tuba uterina foi realizado por no mínimo 48 horas previamente à adição dos oócitos. Para a maturação, utilizou-se TCM 199 suplementado com 2,5 µg/ml de FSH e 5 µg/ml de LH. Decorridas 48, 72 e 96 horas em estufa a 39&ordm;C, 5% de CO2 em ar e alta umidade, os oócitos foram fixados em paraformaldeído a 4% com Triton 10X e corados com Hoescht 33342 (10 µg/ml) em glicerol. O estágio de maturação nuclear (vesícula germinativa - VG, quebra da vesícula germinativa – QVG, metáfase I – MI, metáfase II – MII, degenerados ou não passíveis de determinação) foi avaliado em microscópio invertido equipado com luz ultravioleta e filtro de 365-420 de excitação/emissão. Os dados foram analisados mediante o PROC NPAR1WAY de análise de variância não paramétrica, sendo o efeito dos tratamentos verificado por meio do teste de Kruskal-Wallis, e as comparações múltiplas do teste de Wilcoxon com os tratamentos comparados dois a dois, considerando as diferenças significativas quando p<0,05. Verificou-se influência positiva da suplementação hormonal no desenvolvimento oocitário in vitro, particularmente com referência à adição de progesterona, associada ou não ao estrógeno. Não houve influência significativa do co-cultivo de células da tuba uterina na maturação oocitária em comparação aos meios de cultivo, sem presença de células epiteliais da tuba uterina, suplementados com hormônios esteróides. Conquanto sem significância estatística, verificou-se tendência de os oócitos, obtidos de cadelas em anestro, desenvolverem-se ao estágio de metáfase II após o período de maturação de 96 horas. Demonstrou-se, portanto, ser plenamente exeqüível o estudo da maturação de oócitos de cães em sistemas de cultivo in vitro a partir de ovários obtidos por ovário-histerectomia, tal estudo propicia, ademais, a pesquisa de características reprodutivas fisiológicas da espécie. / Recent biotechniques are innovative tools for the canine reproductive physiology research, as well as for assisted reproduction of endangered species. The aim of this study was to evaluate the effects of estradiol-17ß, progesterone and the co-culture with oviductal ephitelial cells on in vitro maturation. Ovaries from anestrous bitches were sliced in PBS with 10% FCS. Oocytes were selected and distributed in 8 groups: group 1 (no hormonal suplementation), group 2 (estradiol-17ß at 20 µg/ml), group 3 (progesterone at 20 µg/ml), group 4 (estradiol-17ß at 20 µg/ml + progesterone at 20 µg/ml), group 5 (co-culture in oviductal ephitelial cells without hormonal suplementation), group 6 (co-culture in oviductal ephitelial cells + estradiol-17ß at 20 µg/ml), group 7 (co-culture with oviductal ephitelial cells + progesterone at 20 µg/ml) and group 8 (co-culture with oviductal ephitelial cells + estradiol-17ß at 20 µg/ml + progesterone at 20 µg/ml). Oviductal ephitelial cells culture was performed at least 48 hours prior to oocyte co-culture. For in vitro maturation, TCM 199 supplemented with FSH (2.5 &micro;g/ml) and LH (5 &micro;g/ml) was utilized. After periods of 48, 72 and 96 hour at 39ºC in humidified atmosphere of 5% CO2 in air, oocytes were fixed with Triton-X10 in paraformaldehyde at 4% and and stained with Hoescht 33342 (10 µg/ml) in glycerol. Oocytes were examined through an inverted fluorescence microscope equipped with a 365-420 nm wavelength excitation/emisson filter. Nuclear maturation was classified according to chromatin configuration as: germinal vesicle stage (GV), germinal vesicle break down (GVBD), metaphase I (MI), metaphase II (MII) and degenerated and unidentifiable oocytes. Data was evaluated through PROC NPAR1WAY of non parametrical variance analysis and treatment was verified by the Kruskal-Wallis test and the Wilcoxon test for multiple comparisions. Differences were considered significant at p<0.05. Positive influence of hormonal supplementation for oocyte development rates was verified, particularly with respec to progesterone. No significant influence of oviductal cells co-culture was however verified. In addition, a tendency of the oocytes reaching metaphase II in the 96 hour period was observed. Therefore, the study of canine in vitro oocyte maturation is feasible and provides an important tool for reproductive physiology research.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-07-29T12:19:19Z No. of bitstreams: 1 Amanda Camilo Silva.pdf: 1035628 bytes, checksum: 4182f45e5ff155111084077a4179deb4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-29T12:19:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amanda Camilo Silva.pdf: 1035628 bytes, checksum: 4182f45e5ff155111084077a4179deb4 (MD5) Previous issue date: 2011-02-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The pregnancies of queens are not always desirable by their owners, who use hormonal contraceptive and surgical methods (ovariohysterectomy - OSH). Another form of contraception used in human medicine is the tubal oclusion, which consists of mechanical occlusion and / or partial resection of this structure (partial salpingectomy). This research had the objetive of a develop a technique for definitive contraception in pregnant queens, that would not compromise the current pregnancy, the birth of kittens, and the concepts, considering that is common in castration campaigns the visualization of gravid uterus during the approach to abdominal cavity. Another objective was evaluate weight gain and changes in behavior of queens submitted to partial salpingectomy, comparing them with those submitted to OSH, and to compare the time between both surgical procedures. Were used 40 queens, divided into two groups of 20 animals, A: Partial salpingectomy, and B: OSH. The group A, was divided in A1, containing 10 queens pregnant and A2 containing 10 non-pregnant. During the surgery were recorded the quantity of embryonic vesicles found, and the execution time of both procedures. All animals were assessed with seven, 60, 180 and 365 days, being observed initially the maintenance of pregnancy and the occurrence of fetal resorption in group A1, and fertility, weight gain and behavior change in all groups. The mean operative time of group A was 353 seconds, with a deviation of 58.476 seconds, and group B corresponded to 448 seconds with diversion of 84.609 seconds, showing statistically significant difference (p = 0.000069) between the groups on the Mann-Whitney test, with significance level of 5%. The gestacional course and birth of kittens were normal in queens of group A, not occurring abortion neither dystocia. A total of 51 embryonic vesicles were visualized during surgery, 49 born live fetuses, no stillbirths, and no fetal withholding, occurring two (3.92%) fetals resorptions. Among the 49 fetuses, seven (14.28%) presented genu recurvatum. With respect to fertility, the animals in group A that cycled and mated, did not get pregnant. Group B showed average weight increase of 20.34%, statistically significant (p = 0.000062) on the Wilcoxon test at a significance level of 5%, while the A2 group showed an increase of 9.57%, considered not significant (p = 0.130570) compared to pre-surgery weight.Regarding the behavioral parameters, group B showed increase in food intake in 60% of the animals, lethargy in 65%, and decreased waking period in 75%, whereas these parameters remained unchanged in most animals of group A. It is concluded that partial salpingectomy in queens is a 100% effective contraceptive method of rapid execution, which can be employed during the transoperative identification of pregnancy, with minimal adverse effects on fetuses, no significant changes of behavior neither weight gain, but with undesirable characteristics on the acceptance of owners. / As gestações de gatas nem sempre são desejáveis por parte dos proprietários, os quais recorrem aos métodos contraceptivos hormonal e cirúrgico (ovarissalpingohisterectomia - OSH). Outra forma de contracepção bastante utilizada na medicina humana é a ligadura ou laqueadura das tubas uterinas, que consiste na oclusão mecânica e/ou ressecção parcial desta estrutura (salpingectomia parcial). Objetivou-se com este trabalho, desenvolver uma técnica de contracepção definitiva em gatas prenhes, que não comprometesse a gestação em curso, o parto, nem os conceptos, tendo em vista que é comum em campanhas de castração a visualização de útero gravídico durante a abordagem à cavidade abdominal; assim como avaliar o ganho de peso e mudanças de comportamento das gatas submetidas à salpingectomia parcial, comparando-as com as submetidas à OSH; e comparar o tempo cirúrgico entre os dois procedimentos. Para tal, foram utilizadas 40 gatas, divididas em dois grupos de 20 animais, A: salpingectomia parcial, e B: OSH; sendo o grupo A subdividido em A1, contendo 10 gatas prenhes, e A2 contendo 10 não prenhes. Transcirurgicamente foram registradas as quantidades de vesículas embrionárias encontradas, e o tempo de execução de ambos os procedimentos. Todos os animais foram reavaliados com sete, 60, 180 e 365 dias, sendo inicialmente observados quanto à manutenção da gestação e ocorrência de reabsorção fetal no grupo A1, e posteriormente quanto à fertilidade, ganho de peso e mudança de comportamento em todos os grupos. O tempo cirúrgico médio do grupo A foi de 353 segundos com desvio de 58,476 segundos, e o grupo B correspondeu a 448 segundos com desvio de 84,609 segundos, apresentando diferença estatisticamente significativa (p= 0,000069) entre os grupos diante do teste de Mann-Withney com nível de significância de 5%. Nas gatas do grupo A1 o curso gestacional e o parto foram normais, não ocorrendo abortos, nem distocias. No total foram visualizadas 51 vesículas embrionárias transcirurgicamente, nasceram 49 fetos vivos, nenhum natimorto, e nenhuma retenção fetal, logo, ocorreram duas (3,92%) reabsorções fetais. Dentre os 49 fetos, sete (14,28%) apresentaram a anormalidade genu recurvatum. Quanto à fertilidade, os animais do grupo A que ciclaram e copularam, não engravidaram. O grupo B apresentou aumento de peso médio de 20,34%,estatisticamente significativo (p= 0,000062) diante do teste de Wilcoxon com nível de significância de 5%, enquanto que o grupo A2 apresentou aumento de 9,57% considerado não significativo (p= 0,130570) em relação ao peso pré-cirúrgico. Com relação aos parâmetros comportamentais, no grupo B se observou aumento na ingestão de alimentos em 60% dos animais, da letargia em 65%, e diminuição do período de vigília em 75%; enquanto que estes parâmetros permaneceram inalterados na maioria dos animais do grupo A. Conclui-se que a salpingectomia parcial em gatas é um método contraceptivo 100% eficaz, de rápida execução, que pode ser empregado durante a identificação transcirúrgica do estado de prenhez, com mínimo efeito prejudicial aos conceptos; e sem alterações significativas de conduta e ganho de peso, mas com características indesejáveis quanto à aceitação dos proprietários.