Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias / La tuberculosis bovina, causada por la bacteria Mycobacterium bovis, es una de las enfermedades más importantes del ganado bovino en Chile y otros países, afectando la productividad y salud de estos animales. La vacuna contra la tuberculosis humana (BCG M. bovis) tiene ventajas para su uso en el ganado, para lo cual se debe evaluar su eficacia mediante una prueba diagnóstica capaz de discriminar animales infectados de aquellos que han sido vacunados (DIVA). En función de lo anterior, el Servicio Agrícola y Ganadero del Ministerio de Agricultura de Chile solicitó un estudio de evaluación de la aplicación de la vacuna BCG y el test DIVA para la prevención y diagnóstico de la infección por M. bovis en planteles bovinos de la zona central de Chile, del cual este estudio es parte. El propósito de este trabajo fue implementar y caracterizar un ensayo de ELISA-IFN-γ con antígenos ESAT-6, CFP-10 y Rv3615c (DIVA) para el diagnóstico de la infección por M. bovis en Chile. Se determinó que los puntos de corte que permiten la mejor combinación de valores de especificidad (Es) y sensibilidad (Se), priorizando la Es, es de 0,06 DO para el pool de antígenos PC-EC (ESAT-6 y CFP-10) y, 0,02 DO en Rv3615c; obteniendo un rendimiento diagnóstico de 61% y 45% de Se y, 82% y 90% de Es, respectivamente. Mientras el rendimiento gl rendimiento glrendimiento glrendimiento glrendimiento glrendimiento gl rendimiento glrendimiento glrendimiento glrendimiento glrendimiento global de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio obal de la prueba DIVA en este estudio fue de 68% Se y un 79% Es. Adicionalmente, el área bajo la curva ROC de los antígenos fue de 0,735 ± 0,054 en PC-EC y un 0,731 ± 0,054 en Rv3615c. Al comparar la prueba DIVA con los ensayos Bovigam 2G, qPCR-Boviman, Stonebrink y Bactec MGIT 960, se evidenciaron diferencias significativas en todas las comparaciones, una concordancia baja en relación con Bovigam 2G e, insignificante con todas las demás pruebas. Sugiriendo que las pruebas comparadas se enfocan a distintos blancos de detección que predominan en distintas fases de la infección. Estos resultados muestran que la prueba DIVA desarrollada es eficaz pero no eficiente en el diagnóstico de la infección por M. bovis / Bovine tuberculosis, caused by the bacterium Mycobacterium bovis, is one of the most important diseases of cattle in Chile and other countries, affecting the productivity and health of these animals. The vaccine against human tuberculosis (BCG M. bovis) has advantages for use in livestock, for which its effectiveness must be evaluated by means of a diagnostic test able to discriminate infected animals from those that have been vaccinated (DIVA). Based on the above, the Agricultural and Livestock Service of the Ministry of Agriculture of Chile requested a study evaluating the application of the BCG vaccine and the DIVA test for the prevention and diagnosis of M. bovis infection in bovine farms in the central zone of Chile, of which this study is part. The purpose of this work was to implement and characterize an-ELISA-IFN-γ assay with antigens ESAT-6, CFP-10 and Rv3615c (DIVA) for the diagnosis of M. bovis infection in Chile. It was determined that the cut off that allow the best combination of specificity (Sp) and sensitivity (Se) values, prioritizing the Sp, is 0.06 OD for the PC-EC antigen pool and, 0.02 OD in Rv3615c; obtaining a diagnostic yield of 61% and 45% of Se and 82% and 90% of Sp, respectively. While the overall performance of the DIVA test in this study was 68% Se and 79% Sp. Additionally, the area under the ROC curve of the antigens was 0.735 ± 0.054 in PC-EC and 0.731 ± 0.054 in Rv3615c When comparing the DIVA test with the Bovigam 2G, qPCR-Boviman, Stonebrink and Bactec MGIT 960 assays, showed significant differences in all comparisons, a low agreement in relation to Bovigam 2G and, insignificant among all the others. Suggesting that the comparative tests focus on different detection targets that predominate in different phases of the infection These results show that the DIVA test developed is effective but not efficient in the diagnosis of M. bovis infection / Financiamiento: Servicio Agrícola Ganadero (SAG)

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La tuberculosis bovina (TBB) es una enfermedad crónica y zoonótica, producida por Mycobacterium bovis. El costo de la enfermedad se relaciona a la disminución en la productividad de los animales severamente infectados, al control de movimiento animal, pruebas de diagnóstico para la detección y eliminación de animales positivos para evitar la propagación del agente, los decomisos y el menor valor de la leche. Se considera como una enfermedad ocupacional, ya que las personas que tienen mayor riesgo de contagiarse con M. bovis son quienes pasan largos periodos en contacto cercano con el ganado. La TBB en Chile se encuentra presente, y para apoyar el plan para su control y erradicación, se está estudiando el uso de la vacuna con cepa BCG de M. bovis en el ganado bovino. Fue desarrollada por Calmette y Guérin, quienes informaron la inducción de protección en el ganado contra la exposición a la bacteria. Como esta vacuna corresponde a una cepa atenuada de M. bovis, el objetivo de este trabajo es evaluar la interferencia que tiene su aplicación, con el diagnóstico tradicional de la infección en planteles lecheros de la Región Metropolitana. Para ello, 56 vaquillas fueron vacunadas y 48 fueron inyectadas con NaCl 0,9% a modo de controles. A todas se les tomó muestra de sangre tres y seis meses después de la vacunación las que luego fueron estimuladas con distintos antígenos y se dejaron incubar. Una vez finalizado el tiempo de incubación, se cosecharon los plasmas y finalmente se procedió a realizar el ensayo diagnóstico, ELISA IFN-γ con antígenos DIVA añadidos. Los antígenos DIVA corresponden a antígenos que fueron eliminados de la cepa vacunal. Los resultados demostraron un aumento en la cantidad de individuos falsos positivos al diagnóstico tradicional de TBB en los primeros seis meses después de la vacunación. Esto quiere decir, que fueron positivos a la tuberculina bovina, pero negativos a la prueba DIVA (Detecting Infected among Vaccinated Animals), debido a la reacción con la vacuna. Se concluye que se hace necesario utilizar una prueba complementaria para el diagnóstico de la tuberculosis en el ganado, en este caso, la prueba DIVA, durante los primeros meses después de vacunar con la cepa M. bovis BCG / Bovine tuberculosis is a chronic and zoonotic disease, caused by Mycobacterium bovis. The cost of the disease is associated to the decrease in the productivity of severely infected animals, the restrictions for the animal movement, the diagnostic tests for the detection and elimination of positive animals to avoid the spread of the agent, confiscations and the lower price of milk. It is considered an occupational disease, since people who have the highest risk for M. bovis zoonotic infection are those who spend long time in close contact with livestock. Bovine tuberculosis in Chile is an endemic disease, and the plan for the control and eradication of the disease is being supported by the study of the vaccination with the M. bovis BCG strain in cattle. It was developed by Calmette and Guerin, who reported the induction of protection in cattle against exposure with M. bovis. As this vaccine corresponds to a strain of M. bovis, the objective of this work is to evaluate the interference that has its application, with the traditional diagnosis of infection in dairy farms from the Metropolitan Region. For this, 56 heifers were vaccinated and 48 were injected with NaCl 0,9%. Blood samples were taken at three and six months after the vaccination. Once at the lab, samples were stimulated with different antigens and, after an incubation period, plasmas were harvested and IFN-γ detected by carrying out an ELISA diagnostic assay.-- The results showed an increase in the number of false positive individuals to the traditional diagnosis of bovine tuberculosis in the first six months after vaccination. This means that they were positive to bovine tuberculin, but negative to the DIVA (Detecting Infected among Vaccinated Animals) test, due to the reaction with the vaccine. It is concluded that it is necessary to use a complementary test for the diagnosis of tuberculosis in cattle, in this case, the DIVA test, during the first months after vaccination with the M. bovis BCG strain / Convenio SAG-FAVET

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Mycobacterium bovis es el microorganismo zoonótico causante de la tuberculosis bovina, patología infectocontagiosa de distribución mundial responsable de graves problemas económicos y de salud en el sector ganadero. Debido a que varios estudios han establecido la utilidad de las secuencias de inserción IS6110 e IS1081 en la identificación y tipificación de cepas del complejo Mycobacterium tuberculosis, el objetivo de este estudio fue establecer protocolos de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) para la amplificación de las secuencias IS6110 e IS1081 y determinar la existencia de diferencias en su capacidad de detectar Mycobacterium bovis en tejidos bovinos. El análisis estadístico de los resultados sugirió que no existen diferencias significativas entre los ensayos de PCR convencional basados en IS1081 e IS6110, lo que contrasta con lo señalado por otros autores, quienes postulan que IS1081 está presente en mayor número de copias en cepas de Mycobacterium bovis, y por tanto, su utilidad en el diagnóstico es mayor. Debido a que la concordancia de ambas pruebas fue baja, se requieren nuevos estudios destinados a determinar la aplicabilidad de ambas secuencias en conjunto, por ejemplo en una prueba de PCR múltiple, ya que este trabajo sugiere que son complementarias para el diagnóstico de tuberculosis bovina / Proyecto FIV 121014019102003