L'inflammasome est une voie de signalisation du système immunitaire inné impliquée dans la lutte contre les pathogènes et notamment dans la réponse aux infections bactérienne. L'activation de l'inflammasome entraine la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et une mort cellulaire caspase-1 dépendante. Des dérégulations de l'inflammasome conduisent aussi à des syndromes auto-inflammatoires graves ; il est donc essentiel de mieux comprendre sa régulation. Francisella tularensis est une bactérie intracellulaire facultative responsable de la tularémie. Son pouvoir pathogène est lié à sa capacité à s'échapper rapidement de son phagosome. Le système de surveillance du macrophage détecte la présence de F. tularensis via l'inflammasome AIM2. La détection de l'ADN bactérien induit la formation d'un large complexe composé de AIM2, le récepteur, d'ASC, l'adaptateur et de caspase-1, l'effecteur ; ce complexe forme un speck visible dans la cellule. Nous avons utilisé l'infection par F. tularensis de macrophages primaires murins pour étudier la régulation de l'inflammasome AIM2 dans un contexte physiologique. Nous avons ainsi identifié une boucle de rétrocontrôle, médiée par la caspase-1, qui régule négativement la formation/stabilité des specks AIM2. Nous avons étudié le rôle de facteurs vacuolaires et des espèces réactives de l'oxygène et de l'azote dans l'activation de l'inflammasome AIM2 lors de l'infection par Francisella. Nous avons ainsi mis en évidence le rôle clef des péroxynitrites dans cette activation. Nos résultats suggèrent que des décomposeurs catalytiques des péroxynitrites pourraient avoir un rôle thérapeutique dans les maladies liées à l'inflammasome / The inflammasome is an innate immune signaling pathway involved in the fight against pathogens. This pathway can also be activated by danger signals. Inflammasome activation induces the release of the pro-inflammatory cytokines IL-1b and IL-18 and cell death in a caspase-1 dependent manner. The inflammasome pathway is a key antibacterial pathway. Deregulation of the inflammasome pathway can lead to serious auto-inflammatory syndromes ; it is therefore critical to better understand inflammasome regulation. Francisella tularensis is a facultative intracellular bacterium responsible for tularemia. Its ability to cause disease is linked to its ability to rapidly escape from the phagosome into the host cytosol where it replicates. The macrophage surveillance system can detect F. tularensis presence in the cytosol through the AIM2 inflammasome. Recognition of DNA induces the formation of a large complex consisting of AIM2, the receptor; ASC, the adaptor and caspase-1, the effector; this complex is visible as a speck within the cell. We used F. tularensis infection of bone marrow derived macrophages to study the activation of the AIM2 inflammasome in a physiological context. We have identified a feedback loop, dependent on caspase-1, negatively regulating speck formation/stability. Then, we studied the role of vacuolar factors and reactive oxygen and nitrogen species in the AIM2 inflammasome activation during Francisella infection. We also described a key role for peroxynitrite in this activation. Our results suggest that catalytic decomposer of peroxynitrite may have a therapeutic potential in diseases linked to inflammasome

Identifier rapidement des microorganismes pathogènes dans des échantillons environnementaux est un enjeu majeur dans le domaine de la biodéfense. Dans ce contexte, la spectrométrie de masse MALDI-TOF peut offrir une réponse simple, rapide et peu coûteuse. L'enjeu de la thèse, dans le cadre du projet ANR franco-allemand GEFREASE, a été de développer des méthodes permettant l'identification des microorganismes pathogènes et notamment de mettre en place des approches ciblées pour la préparation d'échantillon à l'aide d'anticorps en amont de la spectrométrie de masse. Dans un premier temps, l'étude du protéome de la bactérie modèle, Francisella tularensis subsp. holarctica LVS, responsable de la tularémie, a permis d'identifier les protéines et les peptides les plus abondants donnant un signal intense par spectrométrie de masse. Ensuite l'étude protéogénomique de douze protéines cibles a permis de choisir trois biomarqueurs dont le profil des masses par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF (approche top-down) est spécifique de l'espèce et de la sous-espèce des bactéries du genre Francisella. Par cette méthode la virulence d'une souche est donc rapidement déterminée puisqu'elle est dépendante de la sous-espèce à laquelle la bactérie appartient. Ce test mis au point présente l'avantage d'être simple et rapide. Dans un deuxième temps, la mise au point d'un protocole d'enrichissement de la bactérie modèle par immunocapture magnétique a permis de montrer qu'il est possible de concentrer des bactéries grâce à des billes magnétiques couplées à des anticorps dirigés contre la bactérie entière. Cette approche a été expérimentée dans le cas de mélanges de bactéries où la bactérie modèle était largement minoritaire et dans des échantillons de matrices alimentaires diverses telles que de l'eau minérale ou du lait. La méthodologie a été validée sur un agent de classe 3, Francisella tularensis subsp. tularensis. / The rapid identification of pathogenic microorganisms in environmental samples is a major issue in the biodefense field. MALDI-TOF mass spectrometry can offer a fast, straightforward and inexpensive answer. In the framework of the Franco-German ANR project GEFREASE, the purpose of the thesis was to develop methodologies allowing identification of pathogenic microorganisms and particularly to set up targeted approaches using antibodies for sample preparation beforehand mass spectrometry. First of all, the proteome study of Francisella tularensis subsp. holarctica LVS, responsible for tularemia, allowed us to identify the most abundant proteins and peptides, and for which the most intense signals are observed when using mass spectrometry. The proteogenomic study of twelve of these proteins enable us to choose three biomarkers for which the masses monitored by MALDI-TOF mass spectrometry (top down approach) allow deciphering the Francisella species and subspecies. The interest of this work is being able to conclude on a strain virulence based on the knowledge of the subspecies it belongs. The finalized test is easy and fast. Secondly, the development of a magnetic immunocapture of Francisella tularensis subsp. holarctica LVS allowed us to show that it is possible to concentrate bacteria using magnetic beads coupled to antibodies raised against the entire bacterium. This approach has been experimented in the case of bacterial mixtures where the model bacterium was largely in minority and for samples containing various food matrices such as mineral water or milk. The methodology has been validated on a class 3 agent, Francisella tularensis subsp. tularensis.

Francisella tularensis est une bactérie responsable de la tularémie. Sa virulence est liée à sa capacité à se multiplier dans le cytoplasme des macrophages. F. novicida, proche de F. tularensis, est utilisée comme modèle d’étude. L'îlot de pathogénicité de Francisella (FPI), un locus crucial pour la virulence de Francisella coderait pour un système de sécrétion de type VI (SST6). Ce SST6 est très distinct des autres SST6 décrits et son fonctionnement est très mal connu. En particulier, la protéine VgrG de Francisella est très différente des protéines VgrG des types VI canoniques. Les protéines VgrG canoniques interagissent avec des protéines à motifs PAAR. Celles-ci sont situées à la pointe des SST6 et fixent un atome de zinc grâce à une cystéine et 3 histidines pour stabiliser la protéine lors de la traversée de la membrane de la cellule cible. Les effecteurs du SST6 peuvent être sécrétés via une interaction avec des extensions N-terminale ou C-terminale de VgrG ou des protéines PAAR (rôle cargo de ces extensions). Par une approche bioinformatique, nous avons identifié une protéine (FTN_1314 : IglG) impliquée dans la virulence de F. novicida. Mon projet de thèse porte sur la caractérisation moléculaire de cette protéine dans la virulence de F. novicida. IglG contient, en C-terminal, un domaine de fonction inconnue (DUF 4280) retrouvé chez plus de 250 espèces bactériennes. L’analyse tridimentionnelle de ce domaine suggère que cette protéine adopte un repliement proche de celui des protéines à motif PAAR et contient 4 cystéines. Nous avons montré que la mutation ponctuelle d’une cystéine d’IglG abolit la virulence de F. novicida, et ceci pour les 4 cystéines indépendamment. De plus, elles sont capables de lier un atome de fer et sont nécessaires pour la sécrétion d’IglG et d’IglC (homologue de Hcp). IglG possède en plus de ce domaine PAAR-like, une extension N-terminale qui pourrait interagir avec des effecteurs de la bactérie (rôle de domaine cargo) ou agir directement en tant qu'effecteur dans la cellule hôte. Nous avons distingué 4 régions dans le domaine N-terminal et nous avons montré que la délétion de la plus petite région abolit la virulence de F. novicida. Ce domaine N-terminal est spécifique de IglG, il n’est pas retrouvé dans d’autres protéines à domaine PAAR. Il n’est pas requis pour la sécrétion de IglG, mais il est requis pour l’interaction avec IglF, une autre protéine du FPI, qui pourrait jouer un rôle d’effecteur du SST6. Ce projet permet une meilleure compréhension du SST6 de F. novicida et des mécanismes de réplication de cette bactérie dans la cellule hôte / The virulence of Francisella tularensis, the etiological agent of tularemia, relies on an atypical type VI secretion system (T6SS) encoded by a genomic island termed the Francisella Pathogenicity Island (FPI). While the importance of the FPI in F. tularensis virulence is clearly established, the precise role of most of the FPI-encoded proteins remains to be deciphered. In this study, using highly virulent F. tularensis strains and the closely related species F. novicida, IglG was characterized as a protein featuring a unique a-helical N-terminal extension and a domain of unknown function (DUF4280), present in more than 250 bacterial species. Three dimensional modeling of IglG and of the DUF4280 consensus protein sequence suggest that these proteins adopt a PAAR-like fold, indicating they could cap the T6SS in a similar way as the recently described PAAR proteins. The newly identified PAARlike motif is characterized by four conserved cysteine residues, also present in IglG, which may bind a metal atom. We demonstrate that IglG binds iron and that each individual cysteine is required for T6SS-dependent secretion of IglG and of the Hcp homologue, IglC and for the F. novicida intracellular life cycle. In contrast, the Francisella-specific N-terminal a-helical extension is not required for IglG secretion, but is critical for F. novicida virulence and for the interaction of IglG with another FPIencoded protein, IglF. Altogether, our data suggest that IglG is a PAAR-like protein acting as a bimodal protein that connects the tip of the Francisella T6SS with a putative T6SS effector, IglF

La tularémie est une zoonose liée à la bactérie Francisella tularensis, hautement pathogène pour l’homme. La sous espèce la plus virulente, F. tularensis subsp. tularensis, est retrouvée uniquement en Amérique du Nord, alors que la sous-espèce F. tularensis subsp. holarctica est présente dans tout l’hémisphère Nord. En France toutes les souches appartiennent au biovar I de la sous-espèce holarctica et plus précisément au groupe phylogénétique B.FTNF002-00. Bien que rarement grave en France, la tularémie pose le problème de taux d’échecs thérapeutiques élevés, jusqu’à 25% en cas de traitement par ciprofloxacine ou gentamicine, et 35% pour la doxycycline. Les causes de ces échecs ne sont pas bien élucidées à l’heure actuelle. L’analyse de la littérature ainsi que la détermination de la sensibilité de 59 souches françaises de F. tularensis subsp. holarctica à 18 antibiotiques, confirment qu’aucune souche isolée à ce jour ne présente de résistance acquise à ces trois familles d’antibiotiques, qui représentent le traitement de première ligne de la tularémie. Les fluoroquinolones (en particulier la ciprofloxacine et la lévofloxacine) présentent concentrations minimales inhibitrices les plus basses, devant la gentamicine et la doxycycline. Les données disponibles in vitro et en modèle animal étant corrélées aux données humaines en termes d’efficacité et de taux d’échecs thérapeutiques, il semble néanmoins préférable de positionner la ciprofloxacine en première ligne pour le traitement des formes modérées de tularémie et de limiter l’utilisation de la doxycycline aux cas de contre-indication aux fluoroquinolones. L’azithromycine et la télithromycine ont été identifiées comme des alternatives thérapeutiques envisageables en cas d’infection par une souche de biovar I de F. tularensis subsp. holarctica lorsqu’existe une contre-indication aux traitements de première ligne. Des études en modèles animaux restent néanmoins nécessaires pour conforter ces dernières observations. La sélection in vitro de souches résistantes aux fluoroquinolones est possible, ce qui suggère la possibilité d’émergence de mutants résistants in vivo pour expliquer les taux d’échec thérapeutiques. Les principales mutations de résistance aux fluoroquinolones chez F. tularensis sont observées au niveau des gènes gyrA et gyrB codant pour les topoisomérases de type II. L’impact fonctionnel de mutations de résistances aux fluoroquinolones a été caractérisé in vitro chez F. novicida, pris comme modèle de bactérie avirulente proche de F. tularensis. L’activité de superenroulement et de clivage de l’ADN en présence de fluoroquinolones a été déterminée suite à la reconstruction in vitro de complexes GyrA/GyrB fonctionnels. La résistance aux fluoroquinolones était la plus forte en cas de mutation D87G/D87Y pour la sous-unité GyrA ou +P466 pour la sous-unité GyrB. La mutation P43H située en dehors du QRDR de GyrA est à l’origine d’un plus faible niveau de résistance. La mutation D487R-∆K488 en dehors du QRDR de GyrB ne confère pas de résistance intrinsèque mais potentialise l’effet d’une mutation D87G concomitante. En revanche, l’identification de mutations de résistance in vivo au sein des QRDR des gènes gyrA et gyrB chez des patients en situation d’échec thérapeutique traités par une fluoroquinolone est demeurée négative. Enfin, notre recherche a permis d’identifier de nouveaux composés de synthèse de structure bis-indolique possédant des activités antibactériennes. Ces composés sont bactériostatiques vis-à-vis de F. tularensis mais bactéricides vis-à-vis des staphylocoques y compris vis-à-vis de souches multi-résistantes de Staphylococcus aureus avec des CMI90 évaluées à 2mg/L chez F. tularensis et S. aureus pour le composé le plus actif. La faible solubilité de ces composés en milieu aqueux, leur forte liaison aux protéines plasmatiques ainsi que la recherche de leur mécanisme d’action original appellent néanmoins de nombreux développements futurs. / Tularemia is a zoonosis caused by the highly pathogenic bacterium Francisella tularensis. The most virulent subspecies, F. tularensis subsp. tularensis, is found only in North America while the subspecies F. tularensis subsp. holarctica is present in the whole Northern hemisphere. In France, all strains belong to the biovar I of the subspecies holarctica and more specifically to the phylogenetic subclade B.FTNF002-00. Although tularemia is usually not a severe disease in France, many patients suffer from therapeutic failures despite receiving an appropriate treatment. These treatments failures are observed in up to 25% of patients treated with ciprofloxacin or gentamicin, and up to 35% if patients treated with doxycycline. The causes of those therapeutic failures remain poorly elucidated. Analysis of the literature and determination of the susceptibility of 59 French F. tularensis subsp. holarctica strains to 18 antibiotics confirmed that to date, no strain with acquired resistance to any of the first-line antibiotics used for treatment of tularemia have been isolated. The fluoroquinolones (in particular ciprofloxacin and levofloxacin) exhibit the lowest minimal inhibitory concentrations, compared to gentamicin and doxycycline. Data obtained in vitro and in animal models are concordant with human data concerning the efficacy of antibiotics and therapeutic failure rates. Thus, we advocate the use of ciprofloxacin as first-line treatment for mild form of tularemia, and the use of doxycyclin only as a second-line treatment in patients with contraindications to fluoroquinolones. Azithromycin and telithromycin may also be considered as potential therapeutic alternatives for tularemia cases caused by biovar I strains of the susbspecies holarctica, but only for patients with contraindications to first-line antibiotics. Further data in animal models are however required to consolidate our in vitro data. The in vitro selection of fluoroquinolone-resistant strains of F. tularensis has been reported. This suggests that the in vivo selection of such resistant mutants may occur. In vitro, the main fluoroquinolone resistance mutations occur in the gyrA and gyrB genes that encode type II topoisomerases of F. tularensis. We have characterized the functional impact of such mutations in avirulent F. novicida strains, taken as a surrogate of F. tularensis. Supercoiling and DNA cleavage activity of GyrA/GyrB complexes reconstituted in vitro have been determined in the presence of fluoroquinolones. Fluoroquinolone resistance level was the highest in strains with a D87G/D87Y mutation in the GyrA subunit or +P466 mutation in the GyrB subunit. The mutation P43H located outside the GyrA Quinolone-Resistance-Determining-Region (QRDR) confered significant but lower fluoroquinolone resistance. The mutation D487R-∆K488 also outside GyrB QRDR did not cause fluoroquinolone resistance by itself, but increased the resistance level in case of concomitant D87G mutation. No mutation could be identified in vivo in the QRDR of gyrA and gyrB genes amplified from clinical samples collected in patients treated with a fluoroquinolone, although some of them experienced therapeutic failure. Finally, while searching for new antibiotic compounds, we identified new synthetic bis-indolic derivatives with antibacterial activity. Lead compounds were only bacteriostatic against F. tularensis but bactericidal against staphylococci including against multi-drug-resistant Staphylococcus aureus. MIC90 were measured at 2mg/L for F. tularensis and S. aureus strains for the most active compound. However, many developments are still required to improve their solubility in water, decrease their plasma proteins binding and elucidate their original mechanism of action.

Francisella tularensis, l'agent de la tularémie, est une bactérie intracellulaire capable d'infecter un grand nombre de cellules dont les macrophages. Le système immunitaire inné cytosolique est capable de détecter la bactérie à différents stades de son cycle d'infection. Dans un premier temps, le macrophage détecte la bactérie cytosolique et produit de l'interféron de type I. Cet interféron induit l'expression de milliers de gènes. Le macrophage est ensuite capable de détecter l'ADN cytosolique de la bactérie via un récepteur spécifique AIM2. La liaison AIM2-ADN entraine la formation d'un complexe multi-protéique appelé inflammasome et se composant de AIM2-ASC-caspase-1. L'activation de ce complexe conduit à la maturation de la caspase-1. Caspase-1 permet la sécrétion de deux cytokines majeures antimicrobiennes : l'IL-1beta et l'IL-18. De plus, caspase-1 induit une mort programmée des cellules infectées appelée pyroptose. La sécrétion de cytokines et la pyroptose sont deux évènements majeurs pour lutter contre les pathogènes. Ma thèse a consisté à identifier le lien entre l'interféron et l'activation de l inflammasome AIM2 dans des macrophages infectés par la bactérie Francisella. En réalisant un crible a l'aide d'ARNs interférents, j'ai découvert que 2 protéines sont impliquées dans l'activation de cet inflammasome, les guanylate binding proteins 2 et 5 (GBP2 et GBP5). En collaboration avec l'équipe du Dr. Broz en Suisse, nous avons démontré que les GBPs étaient impliquées dans le contrôle de la réplication intracellulaire de Francisella et également dans la lyse de la bactérie permettant le relargage d'ADN et l'activation de l'inflammasome AIM2. Les GBPs sont induites par l'interféron de type I mais très majoritairement par l'interféron de type II (IFN- gamma). Nous avons mis en évidence que le contrôle de la réplication bactérienne est GB dépendant et inflammasome-dépendant en absence d'IFN- gamma mais qu'il devient totalement GB dépendant et inflammasome-indépendant dans des macrophages pré-stimulés avec de l'IFN- gamma. De plus, la mort des macrophages pré-stimulés avec de l'IFN- gamma et infectés par Francisella est également GBP-dépendante et inflammasome-indépendante. En prenant en compte tous ces résultats, nous concluons que les GBPs sont des protéines impliquées dans l'immunité des macrophages infectés par Francisella mais qu'elles ont un double rôle : d'une part celui d'induire l'activation de l'inflammasome (la pyroptose) sous le contrôle de l'interféron de type I et d'autre part, d'induire une mort cellulaire et la lyse des bactéries cytosoliques de manière indépendante de l'inflammasome sous le contrôle d'IFN- gamma. Nos résultats placent donc les GBPs comme les effecteurs majeurs de l'immunité cytosolique antibactérienne suite au traitement par l'IFN-gamma / Francisella tularensis is an intracellular bacterium, and the causative agent of tularemia, capable of infecting a large number of cells including macrophages. The innate cytosolic immune system is capable of detecting the bacterium at different stages of its infection cycle. Macrophages first detect the DNA of the cytosolic bacterium and produce type I interferon. Type I interferon subsequently induces the expression of thousands of genes. The macrophages then detect the cytosolic DNA of the bacterium via a cytosolic DNA sensor called AIM2. The AIM2-DNA binding results in the formation of a multi-protein complex called the AIM2 inflammasome composed of AIM2-ASC-caspase-1. Activation of this complex leads to the maturation of caspase-1. Caspase-1 activation leads to the secretion of two major antimicrobial cytokines, IL-1ß and IL-18. In addition, caspase-1 induces a programmed cell death termed pyroptosis. Cytokine secretion and pyroptosis are two major events in the control of pathogens. My PhD focused in identifying the link between interferon and activation of the AIM2 inflammasome in macrophages infected with the pathogenic bacterium Francisella. I performed a RNA interference screening and identified two proteins involved in the activation of the AIM2 inflammasome: guanylate binding proteins 2 and 5 (GBP2 and GBP5). In collaboration with Dr. Broz’s team in Switzerland, we demonstrated that GBPs are involved in the control of intracellular replication of Francisella and also in the lysis of the bacterium allowing the release of bacterial DNA and the activation of inflammasome AIM2. GBPs are induced by type I interferon but to a much greater extent by type II interferon (IFN-gamma). In the second part of my work, we demonstrate that the control of bacterial replication is GBP-dependent and inflammasome-dependent in the absence of IFN-gamma but that it becomes fully GBP-dependent and inflammasome-independent in macrophages primed with IFN-gamma. Cell-death of macrophages primed with IFN-? and infected with Francisella is also GBP-dependent and inflammasome-independent. Taken together, these results demonstrate that GBPs are innate immunity proteins involved in the death of macrophages and the bacterial growth restriction through two differents pathways : one induces the activation of inflammasome (induction of Pyroptosis) controlled with type I interferon signaling and, another induces cell-death and bacterial killing in an inflammasome-independent manner under the control of IFN-gamma. Our results thus discriminates the antimicrobial action of the inflammasome and of GBPs and position GBPs as the master antibacterial effectors of IFN-gamma, a key cytokine to fight cytosolic bacteria

Francisella tularensis, agent étiologique de la tularémie, est un pathogène intracellulaire facultatif capable d’infecter de nombreuses cellules de mammifères. Pour se multiplier activement dans le cytoplasme des cellules hôtes, la bactérie doit être en mesure de capter dans cet environnement tous les composés nécessaires à son métabolisme, et notamment des acides aminés qui représentent ses principales sources de carbone et d’azote. Les pathogènes à multiplication intracellulaire ont mis en place un ensemble de mécanismes, visant i) la manipulation des voies métaboliques de l’hôte, pour accroître le pool de nutriments disponibles, et ii) l’expression de transporteurs dédiés, pour la captation optimale de ces nutriments. Cet ensemble de mécanismes est regroupé sous le terme de « virulence nutritionnelle ». Chez Legionella pneumophila, plusieurs membres d’une sous-famille de transporteurs actifs secondaires (désignés Pht, ou transporteurs phagosomaux), responsables de la captation des acides aminés lors de la phase intracellulaire de la bactérie, ont été caractérisés. Dans ce travail, nous avons établi le rôle de deux membres de la sous-famille des transporteurs Pht (désignés AnsP et IleP), dans le transport d’acides aminés et la virulence de Francisella. La protéine AnsP est un transporteur d’asparagine. La délétion du gène codant pour ce transporteur n’a pas d’effet sur la croissance de Francisella en milieu synthétique, mais entraîne une diminution drastique de sa multiplication intracellulaire dans tous les types cellulaires testés, ainsi qu’une atténuation importante de la virulence chez la souris. La perte de virulence du mutant asnP est réversible aussi bien in vivo qu’in vitro par ajout d’asparagine en excès. F. tularensis, qui est prototrophe pour l’asparagine en milieu minimum, devient donc auxotrophe dans le cadre de sa croissance intracellulaire, et nécessite un transport de cet acide aminé via AnsP. Ce changement de besoins en asparagine entre le milieu extérieur et le milieu intracellulaire illustre bien le phénomène d’adaptation nutritionnel que réalise la bactérie dans le cadre d’une infection. La délétion du second transporteur, IleP, entraine un défaut de croissance en milieu minimum, réversible par ajout de thréonine, un précurseur métabolique de l’isoleucine chez F. tularensis subsp. novicida. Des expériences d’incorporation d’isoleucine marquée ont permis de mettre en évidence la fonction de transporteur d’isoleucine de la protéine IleP. La délétion du gène codant pour IleP entraine également un défaut de multiplication in vitro, associé à un léger retard de sortie du phagosome ainsi qu’une atténuation importante de la virulence chez la souris. Ce transporteur assure donc la captation de l’isoleucine dans des conditions où l’utilisation de la thréonine, ne permet pas d’assouvir les besoins de la bactérie. De façon remarquable, la voie de biosynthèse de l’isoleucine via la thréonine est interrompue chez les sous-espèces tularensis et holarctica. La croissance de ces sous espèces, plus virulentes que novicida, dans la cellule infectée devient donc strictement dépendante du transport de l’isoleucine par IleP. Cet exemple constitue une parfaite illustration de la spécialisation des souches pathogènes aux conditions nutritionnelles de leur hôte. En conclusion, l’ensemble des travaux présentés dans cette thèse a permis de démontrer la participation de deux transporteurs d’acides aminés à la virulence nutritionnelle de la bactérie Francisella. / Francisella tularensis is the causative agent of tularemia. This facultative intracellular pathogen can infect a broad variety of mammalian cells. To multiply actively in the cytoplasm of host cells, the bacteria must be able to capture in this environment all necessary nutrients, including amino acids, that constitute its principal carbon and nitrogen sources. Intracellular pathogens have established a set of mechanisms aimed at: i) hijacking the metabolic pathways of the host, to increase the pool of nutrients available, and ii) expressing transporters dedicated to the optimal transport of these nutrients. These mechanisms are grouped under the term "nutritional virulence." In Legionella pneumophila, several members of a sub-family of secondary active transporters (designated Pht for phagosomal transporter), responsible for the uptake of amino acids in the intracellular phase of the bacteria, have been characterized. In this work, we have established the role of two Pht members (designated AnsP and IleP) in amino acid transport and virulence of Francisella. The AnsP protein is an asparagine transporter. Deletion of the gene encoding the transporter has no effect on the growth of Francisella in synthetic medium, but lead to a drastic decrease in intracellular multiplication in all cell types tested, and significant attenuation of virulence in mouse. The loss of virulence of the ansP mutant was reversible in vivo and in vitro by addition of excess asparagine. F. tularensis, which is prototrophic for asparagine in minimum medium, becomes auxotrophic under its intracellular growth and requires transport of the amino acid via AnsP. This change of asparagine requirement between an environmental and an intracellular lifestyle illustrates the nutritional adaptation achieved by bacteria during infection. The deletion of the second transporter, IleP, causes a growth defect in minimum medium, reversible by adding threonine, a metabolic precursor of isoleucine in F. tularensis subsp. novicida. Transport asays with radiolabelled isoleucine have highlighted the role of IleP protein in isoleucine uptake. Deletion of the ileP gene caused a severe defect in intracellular multiplication, combined with a slight delay exit the phagosome and a significant attenuation of virulence in mice. Notably, the biosynthesis pathway of isoleucine via the threonine is interrupted in holarctica and tularensis subspecies. The growth of these subspecies, more virulent than novicida, in the infected cell becomes strictly dependent on the transport of isoleucine by IleP. This example is a perfect illustration of the specialization of pathogenic strains to nutritional condition of their host. In conclusion, the work presented in this thesis has demonstrated the participation of two amino acid transporters to the nutritional virulence of the Francisella.

Francisella tularensis est l'agent étiologique de la tularémie, zoonose transmissible à l'Homme par des animaux infectés. Cette bactérie hautement pathogène est classée parmi les agents du risque biologique provoqué en raison de sa transmission par voie respiratoire, de sa faible dose infectieuse, d'un fort taux de létalité et de l'absence de vaccin homologué. Actuellement, peu de données sont connues sur la physiopathologie de la tularémie et sur les mécanismes de virulence de F. tularensis. La plupart des études à ce sujet ont été menées chez F. novicida, peu pathogène pour l'Homme. Par ailleurs, l'étude de F. tularensis a été ralentie par le manque d'outils moléculaires spécifiques. Dans ce travail, nous avons caractérisé chez F. philomiragia deux nouveaux plasmides naturels et développé à partir de ceux-ci des vecteurs navettes, utilisables pour la complémentation de mutants et pour le suivi de l'infection in vitro et in vivo. D'autre part, nous avons développé une méthode de mutagenèse dirigée de F. tularensis, qui nous a permis d'obtenir un mutant déficient en phosphatase acide A. L'AcpA, enzyme inhibitrice du stress oxydant des cellules phagocytaires, a été reconnue comme un des facteurs de virulence de F. novicida et, par extrapolation, de F. tularensis. Pour tester cette hypothèse, nous avons développé un modèle d'infection par voie respiratoire chez la souris. Nous avons ainsi confirmé la faible DL50 de F. tularensis et montré que l'AcpA n'est pas impliquée dans sa virulence. L'extrapolation des conclusions de F. novicida à F. tularensis n'est donc pas justifiée, il s'avère indispensable de disposer de modèles d'études basés sur F. tularensis.

<p><i>Francisella tularensis</i> is the causative agent of the debilitating, sometimes fatal zoonotic disease tularemia. To date, little information has been available on the genetic makeup of this pathogen, its evolution, and the genetic differences which characterize subspecific lineages. These are the main areas addressed in this thesis.</p><p>The work indicated a high degree of genetic conservation of <i>F. tularensis</i>, both on the sequence level as determined by sequencing and on the compositional level, determined by array-based comparative genomic hybridizations (aCGH). One striking finding was that subsp. mediasiatica was most similar to subsp. tularensis, despite their natural confinement to Central Asia and North America, respectively. All genetic Regions of Difference RD found by aCGH distinguishing lineages were had resulted from repeat-mediated excision of DNA. This was used to identify additional RDs. Such data along with a multiple locus sequence analysis suggested an evolutionary scenario for F. tularensis. </p><p>Based on genomic information, a novel typing scheme for <i>F. tularensis</i> was furthermore devised and evaluated. This method provided increased robustness compared to previously used methods for <i>F. tularensis</i> typing, while retaining a capacity for high resolution.</p><p>Finally, the genomic sequence of the highly virulent <i>F. tularensis</i> strain SCHU S4 was determined and analysed. Evidenced by numerous pseudogenes and disrupted metabolic pathways, the bacterium appears to be undergoing a genome reduction process whereby a large proportion of the genetic capacity gradually is lost. It is likely that <i>F. tularensis</i> has irreversibly has evolved into an obligate host-dependent bacterium, incapable of a free-living existence. Unexpectedly, the bacterium was found to be devoid of common virulence mechanisms such as classic toxins, or type III and IV secretion systems. Instead, the virulence of this bacterium is probably largely the result of specific and unusual mechanisms. </p>

<p>Although well established that human Vγ9Vδ2 T cells may expand in circulation during intracellular bacterial infections, most underlying studies included only a few cases and only some diseases had been studied so far. In tularemia, a severe invasive disease, only one patient had been described. Legionellosis, including the mild flue-like Pontiac disease caused by Legionella micdadei, had not been studied at all. The aim of the present thesis was to study the circulatory Vγ9Vδ2-T cell response in these two intracellular bacterial diseases. The number of cases included was large enough to draw general conclusions. At various intervals, Vγ9Vδ2-T-cell counts and the capability of the cells to produce proinflammatory cytokines were assayed. Finally, the nature of the stimulating antigens was determined.</p><p>In the acute phase of tularemia, we showed a marked increase of circulatory Vγ9Vδ2 T cells. When 181 samples from 108 patients with ulceroglandular tularemia were assayed, the percentage of Vγ9Vδ2 T cells was found to increase from ~5 to > 20% after the first week of disease. During the ensuing 24 months, levels were normalized. Vaccination with the live attenuated vaccine strain Francisella tularensis LVS, on the other hand, did not cause an increase in numbers of Vγ9Vδ2 T cells.</p><p>Within an outbreak of Pontiac fever, 14 cases were well defined with regard to incubation time and onset of disease. In samples obtained 4 to 6 days after onset of disease, the mean percentage of Vγ9Vδ2 T cells was ~ 1%, i.e., 20% of normal values. Thereafter, a pronounced increase occurred and at 2 to 7 weeks after onset of disease, values were ~ 15%. Later, values slowly decreased. In both tularemia and Pontiac fever, the capacity of Vγ9Vδ2 T cells to produce TNF-α in response to phorbol myristate acetate in vitro was transiently decreased, in tularemia up to 6 weeks after onset of disease and in Pontiac fever in samples obtained 5-7 weeks after onset of disease.</p><p>Nonpeptidic pyrophosphorylated molecules, referred to as phosphoantigens, are powerful stimuli for Vγ9Vδ2 T cells. Various strains of F. tularensis, including LVS, and a strain of L. micdadei were shown to produce Vγ9Vδ2 T-cell stimulating phosphoantigen. Notably, stimulation with an extract from each agent caused a similar degree of expansion of cells from subjects infected with the homologous and heterologous agent and also of cells from healthy subjects. Thus no immunospecific memory was detected in the Vγ9Vδ2-T cell response.</p><p>Since it had been suggested that homologs of the conserved heat shock protein, chaperon-60, may be recognized by human Vγ9Vδ2 T cells, we determined the subpopulation of T cells responding to this protein as well as to DnaK, another heat-shock protein. Under in vitro conditions allowing a vigorous expansion of Vγ9Vδ2 T in response to a phosphoantigen, no expansion of γδ T cells in response to Cpn60 or DnaK of F. tularensis occurred. αβ T cells of tularemia-primed subjects, on the other hand, responded vigorously to the heat-shock proteins.</p><p>In conclusion, two intracellular bacterial diseases with widely varying clinical expression were both associated with expansion of circulating Vγ9Vδ2 T cells. The expansion was prominent, long-lasting, and consistent within large numbers of individuals tested. In Pontiac fever, the expansion of Vγ9Vδ2 T cells was preceded by a depletion of the cells in circulation, implicating a possible extravasal migration into an infected site before the occurrence of rapid expansion and reentrance to blood. Both in tularemia and Pontiac fever, a modulation of the cytokine expression of Vγ9Vδ2 T cells was demonstrated in vitro, suggesting the presence of modulation of the inflammatory response. In extracts from in vitro culture of F. tularensis and L. micdadei, Vγ9Vδ2 T-cell stimulating phosphoantigens were identified and according to cross stimulation experiments, they induced expansion in vitro of Vγ9Vδ2 T cells without regard to immunospecific memory.</p>

Although well established that human Vγ9Vδ2 T cells may expand in circulation during intracellular bacterial infections, most underlying studies included only a few cases and only some diseases had been studied so far. In tularemia, a severe invasive disease, only one patient had been described. Legionellosis, including the mild flue-like Pontiac disease caused by Legionella micdadei, had not been studied at all. The aim of the present thesis was to study the circulatory Vγ9Vδ2-T cell response in these two intracellular bacterial diseases. The number of cases included was large enough to draw general conclusions. At various intervals, Vγ9Vδ2-T-cell counts and the capability of the cells to produce proinflammatory cytokines were assayed. Finally, the nature of the stimulating antigens was determined. In the acute phase of tularemia, we showed a marked increase of circulatory Vγ9Vδ2 T cells. When 181 samples from 108 patients with ulceroglandular tularemia were assayed, the percentage of Vγ9Vδ2 T cells was found to increase from ~5 to &gt; 20% after the first week of disease. During the ensuing 24 months, levels were normalized. Vaccination with the live attenuated vaccine strain Francisella tularensis LVS, on the other hand, did not cause an increase in numbers of Vγ9Vδ2 T cells. Within an outbreak of Pontiac fever, 14 cases were well defined with regard to incubation time and onset of disease. In samples obtained 4 to 6 days after onset of disease, the mean percentage of Vγ9Vδ2 T cells was ~ 1%, i.e., 20% of normal values. Thereafter, a pronounced increase occurred and at 2 to 7 weeks after onset of disease, values were ~ 15%. Later, values slowly decreased. In both tularemia and Pontiac fever, the capacity of Vγ9Vδ2 T cells to produce TNF-α in response to phorbol myristate acetate in vitro was transiently decreased, in tularemia up to 6 weeks after onset of disease and in Pontiac fever in samples obtained 5-7 weeks after onset of disease. Nonpeptidic pyrophosphorylated molecules, referred to as phosphoantigens, are powerful stimuli for Vγ9Vδ2 T cells. Various strains of F. tularensis, including LVS, and a strain of L. micdadei were shown to produce Vγ9Vδ2 T-cell stimulating phosphoantigen. Notably, stimulation with an extract from each agent caused a similar degree of expansion of cells from subjects infected with the homologous and heterologous agent and also of cells from healthy subjects. Thus no immunospecific memory was detected in the Vγ9Vδ2-T cell response. Since it had been suggested that homologs of the conserved heat shock protein, chaperon-60, may be recognized by human Vγ9Vδ2 T cells, we determined the subpopulation of T cells responding to this protein as well as to DnaK, another heat-shock protein. Under in vitro conditions allowing a vigorous expansion of Vγ9Vδ2 T in response to a phosphoantigen, no expansion of γδ T cells in response to Cpn60 or DnaK of F. tularensis occurred. αβ T cells of tularemia-primed subjects, on the other hand, responded vigorously to the heat-shock proteins. In conclusion, two intracellular bacterial diseases with widely varying clinical expression were both associated with expansion of circulating Vγ9Vδ2 T cells. The expansion was prominent, long-lasting, and consistent within large numbers of individuals tested. In Pontiac fever, the expansion of Vγ9Vδ2 T cells was preceded by a depletion of the cells in circulation, implicating a possible extravasal migration into an infected site before the occurrence of rapid expansion and reentrance to blood. Both in tularemia and Pontiac fever, a modulation of the cytokine expression of Vγ9Vδ2 T cells was demonstrated in vitro, suggesting the presence of modulation of the inflammatory response. In extracts from in vitro culture of F. tularensis and L. micdadei, Vγ9Vδ2 T-cell stimulating phosphoantigens were identified and according to cross stimulation experiments, they induced expansion in vitro of Vγ9Vδ2 T cells without regard to immunospecific memory.