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Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2006. / Härtill 6 uppsatser.

京都大学 / 0048 / 新制・論文博士 / 博士(医学) / 乙第13221号 / 論医博第2168号 / 新制||医||1033(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 松田 道行, 教授 小川 誠司, 教授 武藤 学 / 学位規則第4条第2項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Introdução: A hipóxia tumoral tem papel de fator prognóstico independente, estando relacionado a fenótipo mais agressivo, com maior capacidade de proliferação, invasão e disseminação metastática, além de maior resistência ao tratamento sistêmico e à radioterapia. As alterações do microambiente decorrente do baixo nível de oxigênio pode levar a formação de células tronco tumorais (CTTs) em células de câncer de mama, que são identificadas através da expressão de aldeído desidrogenase (ALDH1A1). Modelos experimentais para estudo da influência da hipóxia no desenvolvimento e progressão do câncer demonstram dados inconclusivos e controversos e estão limitados a modelos in vitro e modelos in vivo que submetem os camundongos a estado de hipóxia sistêmica. Em nosso estudo, desenvolvemos um modelo in vivo para estudar se o estado de hipóxia controlado, direcionado ao local do tumor, pode induzir a formação de CTT em câncer de mama de camundongos. Métodos: células da linhagem 67 NR foram introduzidas dentro do córtex renal de fêmeas de camundongos BALB/c. Foi colocado um clipe de aneurisma no hilo renal por 60 minutos para provocar hipóxia direcionada ao local do tumor. Os camundongos foram sacrificados após 24 horas ou 7 dias da hipóxia e foi realizada análise histológica para confirmar as mudanças induzidas pela isquemia na córtex renal e tumoral. Realizada dissecção tumoral microscópica e RT-PCR para análise da expressão CA9, HIF1A, HIF2A, Slug, SOX 9 e ALDHA1(TaqMan® Gene Expression Assay) no grupo controle e da hipóxia. TBP e HPRT foram os genes housekeeping e o crescimento in vitro de linhagem de células 67NR, usado como referência. Resultados: Todos os camundongos enxertados com células 67NR no cortex renal desenvolveram tumores locais. Foi observada necrose tubular aguda (NTA), decorrente da hipóxia tecidual direcionada. Os genes foram diferentemente expressos, comparando com as linhagens celulares. Notamos aumento significativo da ativação da via da hipóxia por aumento da expressão gênica de CA9, HIF1A e HIF2A. Ocorreu uma modulação para formação de CTTs. Obervamos aumento de 2,9 e de 5,7 respectivamente, na expressão de SLUG, relação SLUG/SOX9 após 24 horas de hipóxia, redução de 2,7 vezes na expressão de SOX9 e não houve aumento na expressão de ALDH1. Entretanto, houve aumento de 2,1 vezes na expressão de ALDH1 7 dias após a hipóxia. Conclusão: Houve aumento da expressão de Slug e Slug/SOX9 precocemente ao aumento da expressão de ALDH1, em ambiente de hipóxia tumoral, o que sugere que há probabilidade de participação de Slug e SOX9 na formação de CTTs / The tumoral hypoxia is an independent prognostic factor in many solid malignat tumors. Low oxygen tension has been related to more aggressive phenotype, greater proliferation capacity, increased invasiveness and metastatic dissemination, and resistance to systemic treatment and radiotherapy. Changes in the microenvironment due low oxygen level lead to cancer stem cells formation (CSC) in breast câncer. The aldehyde dehydrogenase (ALDH1) cellular expression has been decribed as a CSC marker. Experimental models to study the influence of hypoxia on the development and progression of cancer have shown inconclusive and controversial data and are restricted to models in vitro and in vivo models in mice undergoing a state of systemic hypoxia. In our study, we developed an in vivo model to study whether the state of hypoxia controlled targeted to the tumor site may induce the formation of CSC in breast cancer in mice. Methods: 67 NR lineage cells were engrafted into the renal cortex of female BALB / c mice. Aneurysm clip was placed in the renal hilum for 60 minutes to induce hypoxia targeted to the tumor site. Mice were sacrificed after 24 hours or 7 days of hypoxia, and histological analysis was performed to confirm ischemia-induced renal cortex changes. Tumors were microdissected and RT-PCR was carried out to analyze the expression of CA9, HIF1A, HIF2A, Slug, Sox 9 and ALDHA1 genes (TaqMan® Gene Expression Assay) in the control and hypoxia groups. TBP and HPRT were used as housekeeping genes and the cell lines 67NR gowing in culture plate was used as reference. Results: All mice engrafted with cells in the renal cortex 67NR developed local tumors. Acute tubular necrosis (ATN) was observed, resulting from the targeted tissue hypoxia. The genes were expressed differently, compared with cell lines. We notice a significant increase in activation of the hypoxia by increased gene expression of CA9, HIF1A and HIF2A, 24 hours after renal tumor ischemia. There was increased by 2.9 and 5.7 fold, respectively, in the expression of SLUG and SLUG/SOX9, no difference in ALDH1 and reduced by 2.7 fold in the expression of SOX 9, 24 hours after ischemia.There was increased by 2.1 fold in ALDH1 expression 7 days after ischemia. Conclusion: There was increased in expression of SLUG and SLUG/SOX9 early expression of ALDH1 in tumor hypoxia environment. This suggests are likely SLUG and SOX9 have role in cancer stem cell transformation

Introdução: A hipóxia tumoral tem papel de fator prognóstico independente, estando relacionado a fenótipo mais agressivo, com maior capacidade de proliferação, invasão e disseminação metastática, além de maior resistência ao tratamento sistêmico e à radioterapia. As alterações do microambiente decorrente do baixo nível de oxigênio pode levar a formação de células tronco tumorais (CTTs) em células de câncer de mama, que são identificadas através da expressão de aldeído desidrogenase (ALDH1A1). Modelos experimentais para estudo da influência da hipóxia no desenvolvimento e progressão do câncer demonstram dados inconclusivos e controversos e estão limitados a modelos in vitro e modelos in vivo que submetem os camundongos a estado de hipóxia sistêmica. Em nosso estudo, desenvolvemos um modelo in vivo para estudar se o estado de hipóxia controlado, direcionado ao local do tumor, pode induzir a formação de CTT em câncer de mama de camundongos. Métodos: células da linhagem 67 NR foram introduzidas dentro do córtex renal de fêmeas de camundongos BALB/c. Foi colocado um clipe de aneurisma no hilo renal por 60 minutos para provocar hipóxia direcionada ao local do tumor. Os camundongos foram sacrificados após 24 horas ou 7 dias da hipóxia e foi realizada análise histológica para confirmar as mudanças induzidas pela isquemia na córtex renal e tumoral. Realizada dissecção tumoral microscópica e RT-PCR para análise da expressão CA9, HIF1A, HIF2A, Slug, SOX 9 e ALDHA1(TaqMan® Gene Expression Assay) no grupo controle e da hipóxia. TBP e HPRT foram os genes housekeeping e o crescimento in vitro de linhagem de células 67NR, usado como referência. Resultados: Todos os camundongos enxertados com células 67NR no cortex renal desenvolveram tumores locais. Foi observada necrose tubular aguda (NTA), decorrente da hipóxia tecidual direcionada. Os genes foram diferentemente expressos, comparando com as linhagens celulares. Notamos aumento significativo da ativação da via da hipóxia por aumento da expressão gênica de CA9, HIF1A e HIF2A. Ocorreu uma modulação para formação de CTTs. Obervamos aumento de 2,9 e de 5,7 respectivamente, na expressão de SLUG, relação SLUG/SOX9 após 24 horas de hipóxia, redução de 2,7 vezes na expressão de SOX9 e não houve aumento na expressão de ALDH1. Entretanto, houve aumento de 2,1 vezes na expressão de ALDH1 7 dias após a hipóxia. Conclusão: Houve aumento da expressão de Slug e Slug/SOX9 precocemente ao aumento da expressão de ALDH1, em ambiente de hipóxia tumoral, o que sugere que há probabilidade de participação de Slug e SOX9 na formação de CTTs / The tumoral hypoxia is an independent prognostic factor in many solid malignat tumors. Low oxygen tension has been related to more aggressive phenotype, greater proliferation capacity, increased invasiveness and metastatic dissemination, and resistance to systemic treatment and radiotherapy. Changes in the microenvironment due low oxygen level lead to cancer stem cells formation (CSC) in breast câncer. The aldehyde dehydrogenase (ALDH1) cellular expression has been decribed as a CSC marker. Experimental models to study the influence of hypoxia on the development and progression of cancer have shown inconclusive and controversial data and are restricted to models in vitro and in vivo models in mice undergoing a state of systemic hypoxia. In our study, we developed an in vivo model to study whether the state of hypoxia controlled targeted to the tumor site may induce the formation of CSC in breast cancer in mice. Methods: 67 NR lineage cells were engrafted into the renal cortex of female BALB / c mice. Aneurysm clip was placed in the renal hilum for 60 minutes to induce hypoxia targeted to the tumor site. Mice were sacrificed after 24 hours or 7 days of hypoxia, and histological analysis was performed to confirm ischemia-induced renal cortex changes. Tumors were microdissected and RT-PCR was carried out to analyze the expression of CA9, HIF1A, HIF2A, Slug, Sox 9 and ALDHA1 genes (TaqMan® Gene Expression Assay) in the control and hypoxia groups. TBP and HPRT were used as housekeeping genes and the cell lines 67NR gowing in culture plate was used as reference. Results: All mice engrafted with cells in the renal cortex 67NR developed local tumors. Acute tubular necrosis (ATN) was observed, resulting from the targeted tissue hypoxia. The genes were expressed differently, compared with cell lines. We notice a significant increase in activation of the hypoxia by increased gene expression of CA9, HIF1A and HIF2A, 24 hours after renal tumor ischemia. There was increased by 2.9 and 5.7 fold, respectively, in the expression of SLUG and SLUG/SOX9, no difference in ALDH1 and reduced by 2.7 fold in the expression of SOX 9, 24 hours after ischemia.There was increased by 2.1 fold in ALDH1 expression 7 days after ischemia. Conclusion: There was increased in expression of SLUG and SLUG/SOX9 early expression of ALDH1 in tumor hypoxia environment. This suggests are likely SLUG and SOX9 have role in cancer stem cell transformation

Das weitaus häufigste aggressive Non-Hodgkin-Lymphom (NHL) ist mit 30-40% aller NHL das diffus großzellige B-Zell-Lymphom. Innerhalb zahlreicher Tumorentitäten, solide sowie hämatologisch, wurde bereits eine kleine Subpopulation von Tumorstammzellen identifiziert. Mit Hilfe des Farbstoffes Hoechst 33342 konnte mittels Durchflusszytometrie eine so genannte “Side Population” in allen 6 untersuchten Zelllinien von aggressiven NHL (BALM-3, Karpass 422, OCI-Ly1, OCI-Ly3, Ramos and SU-DHL-4) sowie in 8 von 11 untersuchten Primärmaterialien erkrankter Patienten nachgewiesen werden. Diese SP-Zellen wiesen ein erhöhtes Klonogenitätspotenzial und eine geringere Chemosuszeptibilität als die Non Side Population auf. Mischkulturen mit GFP-markierten Zellen ergaben Hinweise auf die Existenz eines dynamischen Systems, welches die Entstehung von SP- aus NSP-Zellen nahelegt. Auf molekulargenetischer Ebene ließ sich eine erhöhte ABCA3-Expressions detektieren, und mit Hilfe von Genanalysen konnten einige den SP-Phänotyp potenziell prägende Gene wie CD44,CXCL12 und JAG1 identifiziert werden.

[ES] El cáncer de pulmón es el tumor más frecuente y también el que presenta mayor mortalidad en términos absolutos, suponiendo hasta más del 18% de los fallecimientos por cáncer en el mundo al año. El cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) representa casi el 85% de todos los tumores de pulmón. Tanto las alteraciones genéticas como la heterogeneidad y el microambiente tumoral influyen en la agresividad de los tumores de CPNM. Un factor que contribuye a la heterogeneidad tumoral es la presencia de células madre tumorales (CSC, Cancer Stem Cells). La metástasis y recurrencia tumoral después del tratamiento han sido atribuidas al crecimiento y supervivencia de esta subpoblación celular. La falta de marcadores específicos de CSC de pulmón representa una dificultad para identificarlas, y los marcadores de superficie conocidos hasta el momento no son válidos para separar poblaciones de CSC, por lo que se hace necesaria la generación de nuevos ensayos experimentales para aislar CSC de manera más robusta. La identificación de CSC podría ser la base para el diseño de nuevas estrategias terapéuticas personalizadas, basadas en la selección de una combinación más racional de fármacos, que tendría como objetivo eliminar la población de CSC en los tumores de CPNM. Los objetivos de esta tesis doctoral han sido el aislamiento y caracterización de CSC derivadas de tumores de pacientes con CPNM, y de líneas de cultivo establecidas; la caracterización de proteínas involucradas en la transición epitelial mesenquimal (EMT) en CPNM que pueden ser relevantes para la adquisición y el mantenimiento de características de las células madre y para la progresión de la enfermedad; y el desarrollo de modelos experimentales de ratón a partir de xenoinjertos derivados de tumores de pacientes con CPNM (PDX) para la identificación de nuevos biomarcadores y para estudiar el fenotipo y evolución de los tumores de pacientes. En este trabajo se han optimizado los protocolos para la obtención de tumoresferas (ESF) con propiedades de células madre a partir de tejido tumoral de pacientes con CPNM y de líneas células de CPNM establecidas. Se ha confirmado el fenotipo característico de célula madre en las ESF mediante el análisis de la expresión de marcadores de superficie de CSC como CD326, CD166, CD44 y CD133, su capacidad de autorrenovación y diferenciación, así como la capacidad de iniciar tumores en ratones inmunodeprimidos. Se ha observado además que la señalización mediada por TGF-ß1 podría estar contribuyendo a un aumento de la población CSC, y que habría una relación entre el proceso de promoción de la EMT inducida por TGF-ß1 y las propiedades de CSC. El análisis de genes involucrados en la EMT y CSC en las ESF mostró que la expresión de CDKN1A, NOTCH3, CD44, NANOG, SNAI1 e ITGA6 es característica de las ESF, y por tanto la expresión combinada de estos genes podría identificar la subpoblación de CSC. Al correlacionar la expresión de estos genes con la supervivencia de los pacientes, se obtuvo una firma con valor pronóstico en ADC basada en la expresión de los genes CDKN1A, SNAI1 e ITGA6. Se ha estudiado además el papel de proteínas involucradas en la EMT cuya expresión podría promover la migración e invasión celular en CPNM. De esta manera se ha identificado que el factor de transcripción JunB y el factor de traducción eIF5A2 están involucrados en la iniciación de la EMT mediada por TGF-ß1. Finalmente, se han establecido 9 modelos de xenoinjertos derivados de tumores de pacientes con CPNM (PDX). La correlación del éxito de implantación del tumor en ratón con variables clínico-patológicas de los pacientes mostró que los tumores primarios que generaron PDX derivaban de pacientes con peor pronóstico. También se observó que la elevada expresión de Vimentina, Ezrina y Ki67 en tumores sugiere una mayor agresividad y, por tanto, estudiar su expresión podría utilizarse en / [CA] El càncer de pulmó és el tumor més frequent i també el que presenta major mortalitat en termes absoluts, suposant fins més del 18% de les defuncions per càncer en el món a l'any. El càncer de pulmó no microcític (CPNM) representa quasi el 85% de tots els tumors de pulmó. Tant les alteracions genètiques com l'heterogeneïtat i el microambient tumoral influeixen en l'agressivitat dels tumors de CPNM. Un factor que contribueix a l'heterogeneïtat tumoral és la presència de cèl·lules mare tumorals (CSC, Cancer Stem Cells). La metàstasi i recurrència tumoral després del tractament han sigut atribuïdes al creixement i supervivència d'aquesta subpoblació cel·lular. La falta de marcadors específics de CSC de pulmó representa una dificultat per a identificar-les, i els marcadors de superfície coneguts fins al moment no són vàlids per a separar poblacions de CSC, per la qual cosa es fa necessària la generació de nous assajos experimentals per a aïllar CSC de manera més robusta. La identificació de CSC podria ser la base per al disseny de noves estratègies terapèutiques personalitzades, basades en la selecció d'una combinació més racional de fàrmacs, que tindria com a objectiu eliminar la població de CSC en els tumors de CPNM. Els objectius d'aquesta tesi doctoral han sigut l'aïllament i caracterització de CSC derivades de tumors de pacients amb CPNM, i de línies de cultiu establides de CPNM; la caracterització de proteïnes involucrades en la transició epitelial mesenquimal (EMT) en CPNM que poden ser rellevants per a l'adquisició i el manteniment de característiques de les cèl·lules mare i per a la progressió de la malaltia; i el desenvolupament de models experimentals de ratolí a partir de xenotrasplantaments derivats de tumors de pacients amb CPNM (PDX) per a la identificació de nous biomarcadors i per a estudiar el fenotip i evolució dels tumors de pacients. En aquest treball s'han optimitzat els protocols per a l'obtenció de tumoresferes (ESF) amb propietats de cèl·lules mare a partir de teixit tumoral de pacients amb CPNM i de línies cel·lulars de CPNM establides. S'ha confirmat el fenotip característic de cèl·lula mare en les ESF mitjançant l'anàlisi de l'expressió de marcadors de superfície de CSC com CD326, CD166, CD44 i CD133, la seua capacitat d'autorenovació i diferenciació, així com la capacitat d'iniciar tumors en ratolins immunodeprimits. S'ha observat a més que la senyalització mediada per TGF-ß1 podria estar contribuint a un augment de la població CSC, i que hi hauria una relació entre el procés de promoció de l'EMT induïda per TGF-ß1 i les propietats de CSC. L'anàlisi de gens involucrats en l'EMT i CSC en les ESF va mostrar que l'expressió de CDKN1A, NOTCH3, CD44, NANOG, SNAI1 i ITGA6 és característica de les ESF, i per tant l'expressió combinada d'aquests gens podria identificar la subpoblació de CSC. En correlacionar l'expressió d'aquests gens amb la supervivència dels pacients, es va obtindre una signatura amb valor pronòstic en ADC basada en l'expressió dels gens CDKN1A, SNAI1 i ITGA6. S'ha estudiat a més el paper de proteïnes involucrades en l'EMT que la seua expressió podria promoure la migració i invasió cel·lular en CPNM. D'aquesta manera s'ha identificat que el factor de transcripció JunB i el factor de traducció eIF5A2 estan involucrats en la iniciació de l'EMT mediada per TGF-ß1. Finalment, s'han establit 9 models de xenotrasplantaments derivats de tumors de pacients amb CPNM (PDX). La correlació de l'èxit d'implantació del tumor en ratolí amb variables clinicopatològiques dels pacients va mostrar que els tumors primaris que van generar PDX derivaven de pacients amb pitjor pronòstic. També es va observar que l'elevada expressió de Vimentina, Ezrina i Ki67 en tumors suggereix una major agressivitat i, per tant, l'avaluació de la seua expressió podria utilitzar-se en combinació com a marcador de pr / [EN] Lung cancer is the most frequent and the most mortal tumor in absolute terms, accounting for up to more than 18% of cancer deaths worldwide per year. Non-small cell lung cancer (NSCLC) accounts for almost 85% of all lung tumors. Apart from genetic alterations, both tumor heterogeneity and tumor microenvironment influence the aggressiveness of NSCLC tumors. A factor that contributes to tumor heterogeneity is the presence of cancer stem cells (CSC). Tumor metastasis and recurrence after treatment have been attributed to the growth and survival of this cell subpopulation. The lack of specific markers for lung CSC represents a drawback for their identification, and the surface markers known to date are not valid for separating CSC subpopulations, so it is necessary to generate new experimental assays to isolate CSC in a more robust way. The identification of CSC could be the basis for the design of new personalized therapeutic strategies, based on the selection of a more rational combination of drugs, which would aim to eliminate the CSC population in NSCLC tumors. The objectives of this doctoral thesis have been the isolation and characterization of CSC derived from tumors of patients with NSCLC, and from established NSCLC cell lines; the characterization of proteins involved in the epithelial-mesenchymal transition (EMT) in NSCLC that may be relevant for the acquisition and maintenance of stem cell characteristics and for disease progression; and the development of experimental mouse models from patient-derived xenografts (PDX) of NSCLC for the identification of new biomarkers and to study the phenotype and evolution of patient tumors. In this work, the protocols for obtaining tumorspheres (SPH) with stem cell properties from tumor tissue of NSCLC patients and from established NSCLC cell lines have been optimized. The characteristic stem cell phenotype in SPH has been confirmed by analyzing the expression of CSC surface markers such as CD326, CD166, CD44 and CD133, their capacity for self-renewal and differentiation, as well as the ability to initiate tumors in immunosuppressed mice. It has also been observed that TGF-ß1-mediated signaling could be contributing to an increase in CSC population, and that there would be a relationship between the process of promoting TGF-ß1-induced EMT and CSC features. The analysis of genes involved in EMT and CSC in the SPH showed that the expression of CDKN1A, NOTCH3, CD44, NANOG, SNAI1 and ITGA6 is characteristic of the SPH, and therefore the combined expression of these genes could identify the CSC subpopulation in NSCLC tumors. By correlating the expression of these genes with the survival of the patients, a signature with prognostic value in ADC was obtained based on the expression of CDKN1A, SNAI1 and ITGA6. The role of proteins involved in EMT whose expression could promote cell migration and invasion in NSCLC has also been studied. Thus, it has been identified that the JunB transcription factor and the eIF5A2 translation factor are involved in the initiation of EMT mediated by TGF-ß1. Finally, 9 PDX models from tumors of NSCLC patients have been established. The correlation of implantation success of the tumor in mice with the clinical-pathological variables of the patients showed that primary tumors that generated PDX were derived from patients with bad prognosis. It was also observed that higher expression of Vimentin, Ezrin and Ki67 in tumors suggests higher aggressiveness and, therefore, the study of their expression could be used in combination as a prognostic marker to evaluate the progression of the disease. / Pardo Sánchez, JM. (2021). Aproximaciones moleculares para la identificación de nuevos biomarcadores y dianas terapéuticas del cáncer de pulmón no microcítico: células madre tumorales, transición epitelial-mesenquimal y modelos de xenoinjertos derivados de pacientes [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/172736