O melanoma é um dos tipos de câncer de pele cuja frequência tem crescido nos últimos anos e apresentado elevada taxa de mortalidade, apesar de ter reduzida prevalência. Mesmo havendo um considerável avanço nas propostas terapêuticas nos últimos anos, ainda se vê necessário o desenvolvimento de novas abordagens, sendo a terapia gênica uma promissora possibilidade para tal. Utilizando vetores adenovirais com promotor responsivo à p53 (PGTx beta) para a transferência gênica de p19Arf (proteína supressora de tumor) e interferon-beta (citocina imunomodulatória) em células de melanoma murino com o gene Trp53 selvagem, o nosso grupo demonstrou previamente que a combinação dos dois genes, mas não o tratamento individual, promove efeito citotóxico sinérgico com a liberação de marcadores de morte imunogênica, in vitro; e significativa redução da progressão tumoral acompanhada de uma forte resposta imunológica de linfócitos T CD4+ e CD8+, células NK e neutrófilos contra desafios tumorais, in vivo. Porém, como a translação para modelos de melanomas humanos ainda estava em estágio inicial, ainda não haviam sido confirmamos se esses benefícios também seriam recapitulados. Observações inicias sugeriam que apenas a transferência gênica de interferon-beta seja suficiente para induzir morte celular em linhagens humanas portadoras de TP53 selvagem, sem ainda terem sido identificado o efeito da transferência de p14ARF e nem a necessidade de p53 endógeno para a resposta. Dessa forma, o presente projeto buscou avaliar os efeitos antitumorais provocados pela terapia gênica combinada de p14ARF e interferon-beta em modelos de melanoma humano utilizando linhagens com e sem a via da p53 integra. Para isso, foram utilizadas diferentes linhagens celulares com TP53 selvagem ou com distintas mutações e também foram construídos vetores adenovirais com o promotor constitutivo CMV, tornando assim possível a expressão dos transgenes de maneira independente do status do TP53 endógeno. O presente trabalho revelou que a transferência combinada do interferon-beta e p14ARF revelou vantagem quanto ao estímulo citotóxico e regulação negativa na dinâmica da população em ambas as linhagens UACC-62 e SK-Mel-29, independentemente do estado da via da p53. Na avaliação dos mecanismos de morte foi observado que ambas a linhagens apresentaram marcação positiva para marcadores da via da apoptose, porém com possível participação de outras modalidades de morte-celular, como a necrose, para a linhagem com o TP53 mutado (SK-Mel-29). Além disso, mostramos que os tratamentos potencialmente induzem vias de morte com caráter imunogênico pela secreção de ATP e exposição da calreticulina, sendo este último marcador mais significantemente observado mediante o tratamento combinado. Assim, recapitulamos o benefício observado em modelo murino para a transferência gênica do interferon-beta e p14ARF em modelo de melanoma humano, e investigamos marcadores importantes à translação da proposta terapêutica para o melanoma / Melanoma is one of the types of skin cancer whose frequency has grown in the last years and presents a high mortality rate, despite its low prevalence. Although there has been considerable progress in therapeutic proposals in recent years, it is still necessary to develop new approaches, being gene therapy a promising possibility for this. With the use of adenoviral vectors with a p53 responsive promoter (PGTx beta) for the gene transfer of p19Arf (tumor suppressor protein) and interferon-beta (immunomodulatory cytokine) in murine melanoma cells bearing wild-type Trp53 gene, our group previously demonstrated that the combination of the two genes, but not individual treatment, promotes a synergistic cytotoxic effect with the release of immunogenic death markers in vitro; and significant reduction of tumor progression with a strong immune response mediated by CD4+ and CD8+ T lymphocytes, NK cells and neutrophils in tumor challenges in vivo. However, as the translation for human melanoma models was still at an early stage, it still was not possible to confirm whether these benefits would also be recapitulated in a human model. Initial observations suggested that interferon-beta gene transfer is sufficient to induce cell death in wild-type TP53-bearing human melanoma cell lines, with the effect of p14ARF gene transfer and the role for endogenous p53 in this response yet to be investigated. Thus, the present work aimed to evaluate the antitumor effects induced upon the combined gene transfer of p14ARF and interferon-beta in human melanoma cell lines with and without a functional p53 pathway. For this, different cell lines bearing wild-type TP53 or with different mutations were used and adenoviral vectors with the constitutive CMV promoter were also constructed, making possible the expression of the transgenes independently of the endogenous TP53 status. The present work showed that the combined transfer of interferon-beta and p14ARF was advantageous in cytotoxic stimulation and negative regulation in population dynamics for both cell lines UACC-62 and SK-Mel-29, regardless of p53 pathway status. In the evaluation of the triggered cell death mechanisms it was observed that both cell lines presented positive markers of the apoptosis pathway, but with possible participation of other cell death mechanism, such as necrosis, for the mutated TP53 cell line SK-Mel-29. In addition, we showed that the treatments potentially induced cell death pathways with immunogenic features including the secretion of ATP and calreticulin exposure, being the latter marker more significantly presented after the combined treatment. Thus, we recapitulated the benefit observed in murine model for the gene transfer of interferon-beta and p14ARF in the model of human melanoma, and investigated important markers for the translation of the melanoma therapeutic proposal

O melanoma é um dos tipos de câncer de pele cuja frequência tem crescido nos últimos anos e apresentado elevada taxa de mortalidade, apesar de ter reduzida prevalência. Mesmo havendo um considerável avanço nas propostas terapêuticas nos últimos anos, ainda se vê necessário o desenvolvimento de novas abordagens, sendo a terapia gênica uma promissora possibilidade para tal. Utilizando vetores adenovirais com promotor responsivo à p53 (PGTx beta) para a transferência gênica de p19Arf (proteína supressora de tumor) e interferon-beta (citocina imunomodulatória) em células de melanoma murino com o gene Trp53 selvagem, o nosso grupo demonstrou previamente que a combinação dos dois genes, mas não o tratamento individual, promove efeito citotóxico sinérgico com a liberação de marcadores de morte imunogênica, in vitro; e significativa redução da progressão tumoral acompanhada de uma forte resposta imunológica de linfócitos T CD4+ e CD8+, células NK e neutrófilos contra desafios tumorais, in vivo. Porém, como a translação para modelos de melanomas humanos ainda estava em estágio inicial, ainda não haviam sido confirmamos se esses benefícios também seriam recapitulados. Observações inicias sugeriam que apenas a transferência gênica de interferon-beta seja suficiente para induzir morte celular em linhagens humanas portadoras de TP53 selvagem, sem ainda terem sido identificado o efeito da transferência de p14ARF e nem a necessidade de p53 endógeno para a resposta. Dessa forma, o presente projeto buscou avaliar os efeitos antitumorais provocados pela terapia gênica combinada de p14ARF e interferon-beta em modelos de melanoma humano utilizando linhagens com e sem a via da p53 integra. Para isso, foram utilizadas diferentes linhagens celulares com TP53 selvagem ou com distintas mutações e também foram construídos vetores adenovirais com o promotor constitutivo CMV, tornando assim possível a expressão dos transgenes de maneira independente do status do TP53 endógeno. O presente trabalho revelou que a transferência combinada do interferon-beta e p14ARF revelou vantagem quanto ao estímulo citotóxico e regulação negativa na dinâmica da população em ambas as linhagens UACC-62 e SK-Mel-29, independentemente do estado da via da p53. Na avaliação dos mecanismos de morte foi observado que ambas a linhagens apresentaram marcação positiva para marcadores da via da apoptose, porém com possível participação de outras modalidades de morte-celular, como a necrose, para a linhagem com o TP53 mutado (SK-Mel-29). Além disso, mostramos que os tratamentos potencialmente induzem vias de morte com caráter imunogênico pela secreção de ATP e exposição da calreticulina, sendo este último marcador mais significantemente observado mediante o tratamento combinado. Assim, recapitulamos o benefício observado em modelo murino para a transferência gênica do interferon-beta e p14ARF em modelo de melanoma humano, e investigamos marcadores importantes à translação da proposta terapêutica para o melanoma / Melanoma is one of the types of skin cancer whose frequency has grown in the last years and presents a high mortality rate, despite its low prevalence. Although there has been considerable progress in therapeutic proposals in recent years, it is still necessary to develop new approaches, being gene therapy a promising possibility for this. With the use of adenoviral vectors with a p53 responsive promoter (PGTx beta) for the gene transfer of p19Arf (tumor suppressor protein) and interferon-beta (immunomodulatory cytokine) in murine melanoma cells bearing wild-type Trp53 gene, our group previously demonstrated that the combination of the two genes, but not individual treatment, promotes a synergistic cytotoxic effect with the release of immunogenic death markers in vitro; and significant reduction of tumor progression with a strong immune response mediated by CD4+ and CD8+ T lymphocytes, NK cells and neutrophils in tumor challenges in vivo. However, as the translation for human melanoma models was still at an early stage, it still was not possible to confirm whether these benefits would also be recapitulated in a human model. Initial observations suggested that interferon-beta gene transfer is sufficient to induce cell death in wild-type TP53-bearing human melanoma cell lines, with the effect of p14ARF gene transfer and the role for endogenous p53 in this response yet to be investigated. Thus, the present work aimed to evaluate the antitumor effects induced upon the combined gene transfer of p14ARF and interferon-beta in human melanoma cell lines with and without a functional p53 pathway. For this, different cell lines bearing wild-type TP53 or with different mutations were used and adenoviral vectors with the constitutive CMV promoter were also constructed, making possible the expression of the transgenes independently of the endogenous TP53 status. The present work showed that the combined transfer of interferon-beta and p14ARF was advantageous in cytotoxic stimulation and negative regulation in population dynamics for both cell lines UACC-62 and SK-Mel-29, regardless of p53 pathway status. In the evaluation of the triggered cell death mechanisms it was observed that both cell lines presented positive markers of the apoptosis pathway, but with possible participation of other cell death mechanism, such as necrosis, for the mutated TP53 cell line SK-Mel-29. In addition, we showed that the treatments potentially induced cell death pathways with immunogenic features including the secretion of ATP and calreticulin exposure, being the latter marker more significantly presented after the combined treatment. Thus, we recapitulated the benefit observed in murine model for the gene transfer of interferon-beta and p14ARF in the model of human melanoma, and investigated important markers for the translation of the melanoma therapeutic proposal