Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung und Anwendung elektrochemischer Biosensoren zur Erweiterung oder zum Ersatz herkömmlicher Diagnostikverfahren. Als Basis für die Biosensoren wurden Elektrodenarraychips entworfen und im Reinraum gefertigt. Die als 9WPtE bezeichneten Elektrodenarrays waren aus 3 x 3 Elektrodenpaaren im 96-well-Maßstab (ANSI-Standard) aufgebaut. Jedes Elektrodenpaar bestand aus einer kreisrunden Arbeitselektrode mit einem Durchmesser von 1,9 mm und einer Gegenelektrode als offenem Kreisring um die Arbeitselektrode mit einem Durchmesser von 7 mm. Außerhalb des Reinraums wurden separate Messkammern und Ag/AgCl-Referenzelektroden integriert. Sowohl das Referenzsystem als auch die Signalqualität der 9WPtE-Elektrodenarraychips wurden mittels Zyklovoltammetrie, Impedanzspektroskopie und Rasterkraftmikroskopie analysiert und anhand dieser Untersuchungen optimiert. Das Augenmerk lag hierbei auf den Produktionsprozessen zur Herstellung der Elektrodenarraychips, auf den Elektrolytbedingungen für die elektrochemischen Messungen und auf der Recyclebarkeit der Chips. Die Funktionalisierung der Arbeitselektroden der 9WPtE-Chips erfolgte mit sich selbst-organisierenden Schichten aus Thiolen. An die Thiole wurden mittels Chemoligation die biologischen Erkennungskomponenten kovalent gekoppelt. Mit dem 9WPtE-Elektrodenarray wurde auf diese Weise ein funktionsfähiger kompetitiver Immunosensoren gegen den Tumormarker Tenascin C entwickelt. Außerdem wurden der 9WPtE-Chip und ein zusätzlich entwickelter Durchflusssensor, basierend auf dem Prinzip des 9WPtE, genutzt, um die Möglichkeit der Detektion ganzer eukaryotischer Zellen zu untersuchen.

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung und Anwendung elektrochemischer Biosensoren zur Erweiterung oder zum Ersatz herkömmlicher Diagnostikverfahren. Als Basis für die Biosensoren wurden Elektrodenarraychips entworfen und im Reinraum gefertigt. Die als 9WPtE bezeichneten Elektrodenarrays waren aus 3 x 3 Elektrodenpaaren im 96-well-Maßstab (ANSI-Standard) aufgebaut. Jedes Elektrodenpaar bestand aus einer kreisrunden Arbeitselektrode mit einem Durchmesser von 1,9 mm und einer Gegenelektrode als offenem Kreisring um die Arbeitselektrode mit einem Durchmesser von 7 mm. Außerhalb des Reinraums wurden separate Messkammern und Ag/AgCl-Referenzelektroden integriert. Sowohl das Referenzsystem als auch die Signalqualität der 9WPtE-Elektrodenarraychips wurden mittels Zyklovoltammetrie, Impedanzspektroskopie und Rasterkraftmikroskopie analysiert und anhand dieser Untersuchungen optimiert. Das Augenmerk lag hierbei auf den Produktionsprozessen zur Herstellung der Elektrodenarraychips, auf den Elektrolytbedingungen für die elektrochemischen Messungen und auf der Recyclebarkeit der Chips. Die Funktionalisierung der Arbeitselektroden der 9WPtE-Chips erfolgte mit sich selbst-organisierenden Schichten aus Thiolen. An die Thiole wurden mittels Chemoligation die biologischen Erkennungskomponenten kovalent gekoppelt. Mit dem 9WPtE-Elektrodenarray wurde auf diese Weise ein funktionsfähiger kompetitiver Immunosensoren gegen den Tumormarker Tenascin C entwickelt. Außerdem wurden der 9WPtE-Chip und ein zusätzlich entwickelter Durchflusssensor, basierend auf dem Prinzip des 9WPtE, genutzt, um die Möglichkeit der Detektion ganzer eukaryotischer Zellen zu untersuchen.

Vasoaktives Intestinales Peptid (VIP) ist ein 28meres Neuropeptid, das eine Vielzahl biologischer Aktivitäten ausübt, welche durch die Bindung an die heptahelikalen Transmembranrezeptoren VPAC1 und VPAC2 vermittelt werden. VPAC1 ist auf der Oberfläche vieler Tumorzellen überexprimiert. Daher ist VIP gekoppelt mit Signalmolekülen wie z.B. Fluoreszenzfarbstoffen eine interessante Zielstruktur für die optische Detektion von Tumoren. Der Einsatz von VIP in der Tumordiagnostik ist jedoch aufgrund der schnellen proteolytischen Degradation stark limitiert. In der vorliegenden Arbeit wurden VIP-Analoga mit höherer in vitro und in vivo Stabilität identifiziert und synthetisiert. Hierfür wurde eine neue Synthesestrategie entwickelt, welche die hochparallele Herstellung von löslichen VIP-Farbstoff-Konjugaten auf Cellulosemembranen (Spotsynthese) erlaubt. Es wurden 533 N-terminal Carbocyanin-farbstoff-markierte VIP-Analoga synthetisiert, wobei jeder VIP-Rest durch alle übrigen 19 L-Aminosäuren ausgetauscht wurde (Substitutionsanalyse). Alle Analoga wurden mittels Durchflußzytometrie hinsichtlich ihrer Bindung/Internalisierung an VPAC1-überexprimieren-den Zellen getestet. Diese Ergebnisse führten zur Identifizierung von VIP Aminosäureresten, die für die Wechselwirkung mit VPAC1 essentiell sind und lieferten weiterhin Hinweise über eine vorwiegend helikale Struktur des Rezeptor-gebundenen VIPs. Durch Einbau des Farbstoffs an alle VIP-Reste wurden die für die Wechselwirkung mit VPAC1 günstigen Positionen ermittelt. In Kompetitionstudien und cAMP-Assays ausgewählter Farbstoff-markierter VIP-Konjugate wurde demonstriert, daß sowohl die Spezifität als auch die Produktion von cAMP mit Hilfe der Modifikation der Farbstoffposition gesteigert werden konnte. Für die in Rattenleber getestete metabolische Stabilität der VIP-Analoga zeigte die Farbstoffposition nur einen geringen Einfluß. Die metabolische Stabilität konnte jedoch durch eine einzige Modifikation an Position 8 (Asp8 ® Arg8) erhöht werden. Weiterhin wurde das [Arg8]-VIP-Analogon als Kontrastmittel in in vivo Imaging-Experimenten mit VPAC1-überexprimierenden Tumoren inokulierter Mäuse appliziert. Hierbei wurden die Ergebnisse der Stabilitätstests in Rattenleber bestätigt. Das N-terminal farbstoffmarkierte [Arg8]-VIP-Derivat zeigte gegenüber dem nativen N-terminal markierten VIP-Konjugat eine höhere Halbwertszeit in vivo. Darüber hinaus konnte mit [Arg8]-VIP ein höherer Fluoreszenzkontrast zwischen normalen und Tumorgewebe induziert werden. / Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) is a 28meric neuropeptide with a broad range of biological activities which are mediated via binding to the heptahelical transmembrane receptors VPAC1 and VPAC2. Since VPAC1 is overexpressed on the surface of numerous tumour cells, VIP coupled with signal structures like fluorescence dyes is an interesting target for the tumour detection in the near-infrared range. The use of VIP in tumour diagnosis is limited due to the rapid proteolytic degradation and therefore suggests need for optimised VIP-analogues with enhanced stability. In the present work a complete substitutional analysis of VIP N-terminally labelled with carbocyanine dyes was performed. For that reason a new synthetic strategy has been developed, which allows the parallel production of soluble VIP-dye conjugates using the spot synthesis technique. The resulting 560 derivatives were tested for binding and internalisation using VPAC1-overexpressing cells by means of flow cytometry. Based on these results a VIP binding motif has been delineated, which facilitates the modification of VIP concerning stability enhancement and preservation of binding characteristics. Using a dye-walk the dye-coupling positions beneficial for cell binding were identified. Radioactive competitions studies and cAMP assays of selected dye-labeled VIP-conjugates demonstrated that specifity as well as production of cAMP or biological activity has been increased by alteration of the dye-position. For increasing metabolic stability of labelled VIP-analogues the dye-position showed little influence. But is has been shown that stability of VIP was increased by only one modification at position 8 (Asp8®Arg8). Furthermore [Arg8]-VIP-derivative has been used as a contrasting agent in in vivo-Imaging experiments with VPAC1-overexpressing tumours inoculated in mice. Here the results of stability test in rat liver extract were confirmed. N-terminally dye-labelled [Arg8]-VIP analogue revealed higher half-life-time in vivo towards N-terminally labelled native VIP-derivative. In addition the [Arg8]-VIP induced a higher tumour contrast between normal and tumour tissue.

Die Raman-Spektroskopie ist eine optische Messtechnik, die in der Lage ist, spektroskopische Information zu liefern, welche molekülspezifisch und einzigartig in Bezug auf die Eigenschaften der untersuchten Spezies sind. Sie ist ein unverzichtbares analytisches Instrument, das Anwendung in verschiedenen Bereichen findet, wie etwa der Medizin oder der in situ Beobachtung von chemischen Prozessen. Wegen ihren Eigenschaften, wie der hohen Spezifität und der Möglichkeit von Tracer-freien Messung, hat die Raman-Spektroskopie die Tumordiagnostik stark beeinflusst. Aufgrund einer äußerst starken Beeinflussung der Raman-Spektren durch Hintergrundsignale, ist das Isolieren und Interpretieren von Raman-Spektren eine große Herausforderung. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Ansätze der Spektrenbearbeitung entwickelt, die benötigt werden um Raman-Spektren aus verrauschten und stark mit Hintergrundsignalen behafteten Rohspektren zu extrahieren. Diese Ansätze beinhalten im Speziellen eine auf dem Vector-Casting basierende Methode zur Rauschminimierung und eine auf dem deep neural networks basierende Methoden zur Entfernung von Rauschen und Hintergrundsignalen. Verschiedene neuronale Netze wurden mittels simulierter Spektren trainiert und an experimentell gemessenen Spektren evaluiert. Die im Rahmen dieser Arbeit vorgeschlagenen Ansätze wurden mit alternativen Methoden auf dem aktuellen Stand der Entwicklung unter Zuhilfenahme von verschiedenen Signal-Rausch-Verhältnissen, Standardabweichungen und dem Structural Similarity Index verglichen. Die hier entwickelten Ansätze zeigen gute Ergebnisse und sind bisher bekannten Methoden überlegen, vor allem für Raman-Spektren mit einem niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis und extrem starken Fluoreszenz-Hintergrund. Zusätzlich erfordern die auf Deep Neural Networks basierten Methoden keinerlei menschliches Eingreifen. Die Motivation hinter dieser Arbeit ist die Verbesserung der Raman-Spektroskopie, vor allem der Shifted-Excitation Raman Difference Spectroscopy (SERDS) hin zu einem noch besseren Instrument in der Prozessanalytik und Tumordiagnostik. Die Integration der oben genannten Ansätze zur Spektrenbearbeitung von SERDS in Kombination mit Methoden des maschinellen Lernens ermöglichen es, physiologische Schleimhaut, nicht-maligne Läsionen und orale Plattenepithelkarzinome mit einer Genauigkeit zu unterscheiden, die bisherigen Methoden überlegen ist. Die spezifischen Merkmale in den bearbeiteten Raman-Spektren können verschiedenen chemischen Zusammensetzungen in den jeweiligen Geweben zugeordnet werden. Die Übertragbarkeit auf einen ähnlichen Ansatz zur Erkennung von Brusttumoren wurde überprüft. Die bereinigten Raman-Spektren von normalem Brustgewebe, Fibroadenoma und invasiven Mammakarzinom konnten mithilfe der spektralen Eigenschaften von Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren unterschieden werden. Diese Erkenntnisse lassen das Potential von SERDS in Kombination mit Ansätzen des maschinellen Lernens als universelles Werkzeug zur Tumordiagnose erkennen.:Versicherung Abstract Zusammenfassung der Ergebnisse der Dissertation Table of Contents Abbreviations and symbols 1 Introduction 2 State of the art of the purification of Raman spectra 2.1 Experimental methods for the enhancement of the signal-to-background ratio and the signal-to-noise ratio 2.2 Mathematical methods for the extraction of pure Raman spectra from raw spectra 2.3 Raman based cancer diagnostics 2.4 Neural networks for the evaluation of Raman spectra 2.5 Objective 3 Application relevant fundaments 3.1 Basics of Raman spectroscopy 3.2 Simulation of raw Raman spectra 3.3 Shifted-excitation Raman difference Spectroscopy 3.4 Raman experimental setup 3.5 Mathematical method for Raman spectra refinement 3.6 Deep neural networks 4 Summary of the published results 4.1 A shifted-excitation Raman difference spectroscopy evaluation strategy for the efficient isolation of Raman spectra from extreme fluorescence interference 4.2 Vector casting for noise reduction 4.3 Refinement of spectra using a deep neural network; fully automated removal of noise and background 4.4 Breast Tumor Analysis using Shifted Excitation Raman difference Spectroscopy 4.5 Optical diagnosis of clinically apparent lesions of oral cavity by label free Raman spectroscopy Conclusion / Raman spectroscopy is an optical measurement technique able to provide spectroscopic information that is molecule-specific and unique to the nature of the specimen under investigation. It is an invaluable analytical tool that finds application in several fields such as medicine and in situ chemical processing. Due to its high specificity and label-free features, Raman spectroscopy greatly impacted cancer diagnostics. However, retrieving and interpreting the Raman spectrum that contains the molecular information is challenging because of extreme background interference. I have developed various spectra-processing approaches required to purify Raman spectra from noisy and heavily background interfered raw Raman spectra. In detail, these are a new noise reduction method based on vector casting and new deep neural networks for the efficient removal of noise and background. Several neural network models were trained on simulated spectra and then tested with experimental spectra. The here proposed approaches were compared with the state-of-the-art techniques via different signal-to-noise ratios, standard deviation, and the structural similarity index metric. The methods presented here perform well and are superior in comparison to what has been reported before, especially at small signal-to-noise ratios, and for extreme fluorescence interfered raw Raman spectra. Furthermore, the deep neural network-based methods do not rely on any human intervention. The motivation behind this study is to make Raman spectroscopy, especially the shifted-excitation Raman difference spectroscopy (SERDS), an even better tool for process analytics and cancer diagnostics. The integration of the above-mentioned spectra-processing approaches into SERDS in combination with machine learning tools enabled the differentiation between physiological mucosa, non-malignant lesions, and oral squamous cell carcinomas with high accuracy, above the state of the art. The distinguishable features obtained in the purified Raman spectra are assignable to different chemical compositions of the respective tissues. The feasibility of a similar approach for breast tumors was also investigated. The purified Raman spectra of normal breast tissue, fibroadenoma, and invasive carcinoma were discriminable with respect to the spectral features of proteins, lipids, and nucleic acid. These findings suggest the potential of SERDS combined with machine learning techniques as a universal tool for cancer diagnostics.:Versicherung Abstract Zusammenfassung der Ergebnisse der Dissertation Table of Contents Abbreviations and symbols 1 Introduction 2 State of the art of the purification of Raman spectra 2.1 Experimental methods for the enhancement of the signal-to-background ratio and the signal-to-noise ratio 2.2 Mathematical methods for the extraction of pure Raman spectra from raw spectra 2.3 Raman based cancer diagnostics 2.4 Neural networks for the evaluation of Raman spectra 2.5 Objective 3 Application relevant fundaments 3.1 Basics of Raman spectroscopy 3.2 Simulation of raw Raman spectra 3.3 Shifted-excitation Raman difference Spectroscopy 3.4 Raman experimental setup 3.5 Mathematical method for Raman spectra refinement 3.6 Deep neural networks 4 Summary of the published results 4.1 A shifted-excitation Raman difference spectroscopy evaluation strategy for the efficient isolation of Raman spectra from extreme fluorescence interference 4.2 Vector casting for noise reduction 4.3 Refinement of spectra using a deep neural network; fully automated removal of noise and background 4.4 Breast Tumor Analysis using Shifted Excitation Raman difference Spectroscopy 4.5 Optical diagnosis of clinically apparent lesions of oral cavity by label free Raman spectroscopy Conclusion