Die von Tumorzellen exzessiv exprimierte Laktat-Dehydrogenase 5 (LDH-A) ist das Schlüssel-Enzym für den katalytischen Stoffwechsel um Pyruvat in Laktat unter Gewinnung von Energie umzuwandeln. Bei LDH handelt es sich um einen wichtigen prognostischen Marker für die Einstufung der Aggressivität und die Behandlung von Tumoren. Ziel dieser Arbeit war es, das Wissen um die Funktion des Genproduktes von LDH-A (LDH-V) in Bezug auf die Proliferation von Tumorzellen, die Expression Angiogenese-Gene, maligne Konversion von Tumoren und die Metastasierung zu vertiefen. Zusätzlich sollte die Rolle von LDH auf die Genexpression HIF-regulierter Proteine, die das Überleben von Tumorzellen und vor allem der Glykolyse fördern, untersucht werden. Hierfür wurden LDH-A knockdown-Klone von dem murinen B16F10 Melanom und Lewis Lung Karzinom sowie dem humanem HT29 Kolonkarzinom generiert und in vitro und in vivo in den drei verschiedenen Tumormodellen untersucht. Der knockdown von LDH-A führte in vitro zu einer Hemmung der Proliferation in Lewis Lung und B16F10, während bei HT29 Tumorzellen kein solcher Effekt beobachtet werden konnte. Interessanterweise ließen sich nicht bei allen drei Zelllinien die durch limitierte LDH Aktivität ausgelösten Effekte auf die in vitro Proliferation auf das Tumorwachstum in vivo übertragen: Das Wachstum der Lewis Lung als auch der HT29 Tumoren in vivo war durch die Reduktion von LDH-A drastisch vermindert, während die Größe der B16F10 Tumoren davon nicht beeinflusst war. Es konnte gezeigt werden, dass B16F10 Tumoren unter LDH Suppression verstärkt VEGF exprimieren. Dadurch waren diese Zellen in vivo in der Lage, durch verstärkte Vaskularisierung des Tumors der durch LDH-A knockdown ausgelösten Hemmung des Tumorwachstums zu entkommen. Bei Lewis Lung Tumorzellen hingegen, führte die Unterdrückung von LDH-V zu einer beeinträchtigten Glukoseaufnahme unter normoxischen sowie hypoxischen Bedingungen. Die reduzierte Aufnahme von Glukose hatte in vivo, in einer vielschichtigen komplexen Struktur, deutlich größere Auswirkungen als auf einer eindimensionalen Zellkulturschale. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit liefern neue Erkenntnisse zur Rolle von LDH-V während der Tumorprogression und können als Grundlage für zukünftige, neue Therapiestrategien bei Krebspatienten dienen. / LDH is an important prognostic marker in cancer staging and therapy. High serum LDH activity is associated with poor patient prognosis in different tumor types. LDH-A has been shown to play a major role in tumor malignancy, but the molecular mechanism behind this role is only starting to be understood. The objective of this work was to broaden our knowledge about the role of LDH-A gene product (LDH-V) in tumor cell proliferation, angiogenesis-related gene expression, tumor malignancy and metastasis. Herein, LDH-A shRNA knockdown clones of murine B16F10 melanoma, Lewis Lung carcinoma and human HT29 colon carcinoma were generated to uncover the molecular mechanisms between diminished ability of metabolizing pyruvate to lactate and tumor cell growth in vitro and in vivo. In this study, a significant correlation between tumor weight and serum LDH in in vivo tumor models was found, which additionally correlated with the in vitro LDH secretion. In vitro, suppression of LDH-A led to anti-proliferative effects in Lewis Lung and B16F10 tumor cells, while having no effect on HT29 cells. Interestingly, the consequence of limiting LDH activity in vitro did not show a direct correlation to the in vivo anti-tumor effects in LDH-deficient tumors: B16F10 tumor growth was unaffected by silencing LDH-A, while Lewis Lung and HT29 demonstrated a drastic reduction in tumor growth in vivo. B16F10 tumors were found to have increased VEGF expression upon LDH knockdown, and therefore were able to compensate the tumor growth inhibition-driven by LDH deficiency through increased tumor vascularization in vivo. In contrast, LDH-V suppressed Lewis Lung cells demonstrated an impeded glucose uptake ability under normoxic and hypoxic conditions. Subsequently, a genome-wide gene expression analysis and functional assays of LDH-A deficient and control HT29 clones revealed potential new oncogenic features of LDH-A in tumor migration and invasion as well as a feedback loop to HIF1alpha. In summary, the collective data presented in this thesis provide new insights of LDH-V in tumor progression and therapeutic strategies for the treatment of cancer.

Vasoaktives Intestinales Peptid (VIP) ist ein 28meres Neuropeptid, das eine Vielzahl biologischer Aktivitäten ausübt, welche durch die Bindung an die heptahelikalen Transmembranrezeptoren VPAC1 und VPAC2 vermittelt werden. VPAC1 ist auf der Oberfläche vieler Tumorzellen überexprimiert. Daher ist VIP gekoppelt mit Signalmolekülen wie z.B. Fluoreszenzfarbstoffen eine interessante Zielstruktur für die optische Detektion von Tumoren. Der Einsatz von VIP in der Tumordiagnostik ist jedoch aufgrund der schnellen proteolytischen Degradation stark limitiert. In der vorliegenden Arbeit wurden VIP-Analoga mit höherer in vitro und in vivo Stabilität identifiziert und synthetisiert. Hierfür wurde eine neue Synthesestrategie entwickelt, welche die hochparallele Herstellung von löslichen VIP-Farbstoff-Konjugaten auf Cellulosemembranen (Spotsynthese) erlaubt. Es wurden 533 N-terminal Carbocyanin-farbstoff-markierte VIP-Analoga synthetisiert, wobei jeder VIP-Rest durch alle übrigen 19 L-Aminosäuren ausgetauscht wurde (Substitutionsanalyse). Alle Analoga wurden mittels Durchflußzytometrie hinsichtlich ihrer Bindung/Internalisierung an VPAC1-überexprimieren-den Zellen getestet. Diese Ergebnisse führten zur Identifizierung von VIP Aminosäureresten, die für die Wechselwirkung mit VPAC1 essentiell sind und lieferten weiterhin Hinweise über eine vorwiegend helikale Struktur des Rezeptor-gebundenen VIPs. Durch Einbau des Farbstoffs an alle VIP-Reste wurden die für die Wechselwirkung mit VPAC1 günstigen Positionen ermittelt. In Kompetitionstudien und cAMP-Assays ausgewählter Farbstoff-markierter VIP-Konjugate wurde demonstriert, daß sowohl die Spezifität als auch die Produktion von cAMP mit Hilfe der Modifikation der Farbstoffposition gesteigert werden konnte. Für die in Rattenleber getestete metabolische Stabilität der VIP-Analoga zeigte die Farbstoffposition nur einen geringen Einfluß. Die metabolische Stabilität konnte jedoch durch eine einzige Modifikation an Position 8 (Asp8 ® Arg8) erhöht werden. Weiterhin wurde das [Arg8]-VIP-Analogon als Kontrastmittel in in vivo Imaging-Experimenten mit VPAC1-überexprimierenden Tumoren inokulierter Mäuse appliziert. Hierbei wurden die Ergebnisse der Stabilitätstests in Rattenleber bestätigt. Das N-terminal farbstoffmarkierte [Arg8]-VIP-Derivat zeigte gegenüber dem nativen N-terminal markierten VIP-Konjugat eine höhere Halbwertszeit in vivo. Darüber hinaus konnte mit [Arg8]-VIP ein höherer Fluoreszenzkontrast zwischen normalen und Tumorgewebe induziert werden. / Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) is a 28meric neuropeptide with a broad range of biological activities which are mediated via binding to the heptahelical transmembrane receptors VPAC1 and VPAC2. Since VPAC1 is overexpressed on the surface of numerous tumour cells, VIP coupled with signal structures like fluorescence dyes is an interesting target for the tumour detection in the near-infrared range. The use of VIP in tumour diagnosis is limited due to the rapid proteolytic degradation and therefore suggests need for optimised VIP-analogues with enhanced stability. In the present work a complete substitutional analysis of VIP N-terminally labelled with carbocyanine dyes was performed. For that reason a new synthetic strategy has been developed, which allows the parallel production of soluble VIP-dye conjugates using the spot synthesis technique. The resulting 560 derivatives were tested for binding and internalisation using VPAC1-overexpressing cells by means of flow cytometry. Based on these results a VIP binding motif has been delineated, which facilitates the modification of VIP concerning stability enhancement and preservation of binding characteristics. Using a dye-walk the dye-coupling positions beneficial for cell binding were identified. Radioactive competitions studies and cAMP assays of selected dye-labeled VIP-conjugates demonstrated that specifity as well as production of cAMP or biological activity has been increased by alteration of the dye-position. For increasing metabolic stability of labelled VIP-analogues the dye-position showed little influence. But is has been shown that stability of VIP was increased by only one modification at position 8 (Asp8®Arg8). Furthermore [Arg8]-VIP-derivative has been used as a contrasting agent in in vivo-Imaging experiments with VPAC1-overexpressing tumours inoculated in mice. Here the results of stability test in rat liver extract were confirmed. N-terminally dye-labelled [Arg8]-VIP analogue revealed higher half-life-time in vivo towards N-terminally labelled native VIP-derivative. In addition the [Arg8]-VIP induced a higher tumour contrast between normal and tumour tissue.

EBAG9 (estrogen receptor-binding fragment-associated gene 9) hat als unabhängiger prognostischer Marker viel Aufmerksamkeit erregt, da in einigen Tumoren hohe Expressionsraten und Tumorentwicklung korrelieren. In diesen Fällen ist eine hohe EBAG9 Expression häufig mit einer schlechten klinischen Prognose verbunden. EBAG9 ist ein ubiquitär exprimiertes Golgi Protein. Aktuelle Daten demonstrieren, dass es in sekretorischen Zellen an der regulierten Exozytose und an der zytotoxischen Funktion von Lymphozyten beteiligt ist. In epithelialen Zellen führt es zur Generierung von Tumor-assoziierten O-Glykanen, welche ein Erkennungsmerkmal vieler Krebsarten sind. In dieser Arbeit wurde der pathogenetische Zusammenhang zwischen EBAG9 Expression und der Veränderung des zellulären Glykoms untersucht. Um einen tieferen Einblick in die zelluläre Funktion von EBAG9 in epithelialen Zellen zu gewinnen, wurden Zellen mit tumorähnlicher EBAG9 Expression verwendet. Innerhalb dieser Arbeit wurde demonstriert, dass EBAG9 mit anterograden COPI Vesikeln assoziiert und zwischen dem ER-Golgi intermediären Kompartiment und cis-Golgi pendelt. EBAG9 verursacht eine Verzögerung des anterograden Transportes vom ER zum Golgi und verändert die Lokalisation von Komponenten der ER Qualitätskontrolle und des Glycosylierungsapparates. Auf der anderen Seite beschleunigt die verminderte Expression von EBAG9 den Proteintransport durch den Golgi und verstärkt die Aktivität von Mannosidase II. Mechanistisch betrachtet verhindert EBAG9 die Rekrutierung von ArfGAP1 an die Membran. Dies beeinträchtigt das Auflösen der COPI Vesikelhülle und somit die Fusion von Vesikeln am cis-Golgi. Damit agiert EBAG9 in epithelialen Zellen als negativer Regulator des COPI-abhängigen ERGolgi Transportes und stellt damit ein neues phatogenetisches Prinzip dar, bei dem die Beeinflussung des intrazellulären Transportes zu der Entstehung von Tumor-assoziierten Glykanen führt. / The estrogen receptor-binding fragment-associated gene 9 (EBAG9) has received increased attention as an independent prognostic marker for disease-specific survival since in some human tumor entities high expression levels correlate with tumor progression and poor clinical prognosis. Interestingly, EBAG9 was identified as an ubiquitously expressed Golgi protein. Recent data demonstrate an involvement in regulated exocytosis in secretory cells and the cytotoxic functions of lymphocytes. However, EBAG9 is expressed in essentially all mammalian tissues, and in epithelial cells it has been identified as a modulator of tumorassociated O-linked glycan expression, a hallmark of many carcinomas. This thesis addresses the pathogenetic link between EBAG9 expression and the alteration of the cellular glycome. To gain further insights into the cellular functions of EBAG9 in epithelial cells, tumor-associated EBAG9 overexpression was mimicked in living cells. It was demonstrated that EBAG9 associates with anterograde COPI-coated carriers and shuttles between the ER-Golgi intermediate compartment and cis-Golgi stacks. EBAG9 overexpression imposes a delay in anterograde ER-to-Golgi transport and mislocalizes components of the ER quality-control and glycosylation machinery. Conversely, EBAG9 downregulation accelerates glycoprotein transport through the Golgi and enhances mannosidase activity. Functionally, EBAG9 impairs ArfGAP1 recruitment to membranes and consequently, interferes with the disassembly of the coat lattice at the cis-Golgi prior to fusion. Thus, EBAG9 acts as a negative regulator of a COPI-dependent ER-to-Golgi transport pathway in epithelial cells and represents a novel pathogenetic principle in which interference with intracellular membrane trafficking results in the emergence of a tumor-associated glycome.