München, Techn. Universiẗat, Diss., 2007.

Tübingen, Univ., Diss., 2004.

Leipzig, Universiẗat, Diss., 2004.

Charakteristisch für viele maligne Tumorzellen ist eine erhöhte Aufnahme von Glucose und die Bildung großer Mengen Milchsäure auch in Anwesenheit von Sauerstoff (Warburg Effekt) und eine verminderte Nutzung des Zitratzyklus. Als Grund werden Defekte in der mitochondrialen Atmungskette diskutiert. Aber auch eine durch Onkogene gesteigerte Glykolyserate, könnte ursächlich sein. Ein weiterer für Tumorzellen wichtiger Stoffwechselweg, in dem Glucose abgebaut wird, ist der Pentosephosphatweg, dessen Blockade das Wachstum der Krebszellen hemmen könnte. Zudem stellt die Manipulation derjenigen Signalwege, die in den Tumorstoffwechsel involviert und in Tumorzellen überaktiviert (Ras/PI3K/Akt/mTOR- und Raf/MEK/ERK-Signalweg) oder unterdrückt (oxidative Phosphorylierung) sind, mögliche Ansatzpunkte dar. In dieser Arbeit wurde daher in vitro die Wirkung von 15 Substanzen an drei verschiedenen Tumorzelllinien und vier verschiedenen benignen Zellen untersucht, welche in die oben genannten charakteristischen Stoffwechselwege von Tumorzellen eingreifen und gegenwärtig intensiv als mögliche Tumortherapeutika diskutiert werden. Ziel war es, geeignete Kandidaten für eine zielgerichtete Therapie zu identifizieren. Der Schwerpunkt dieser Arbeit war die Beeinflussung des Glucosestoffwechsels in Tumorzellen. Da Glucose sowohl aerob als auch anaerob verstoffwechselt werden kann, wurden in einem ersten Ansatz zum einen Substanzen gestestet, die die Glykolyse auf verschiedenen Ebenen hemmen, zum anderen wurden Substanzen untersucht, die den mitochondrialen Stoffwechsel beeinflussen. Die Wirkung aller 15 Substanzen wurde zunächst jeweils als Einzelbehandlung getestet. Hierbei führten nur sehr hohe Konzentrationen in Tumorzellen zu einem drastisch verminderten ATP-Gehalt, die für benigne Zellen aber ebenfalls toxisch waren. Daher wurde in einem zweiten Schritt untersucht, ob durch die gleichzeitige Manipulation des Glucosestoffwechsels und des mitochondrialen Stoffwechsels mit jeweils subtoxischen Konzentrationen eine tumorselektive Wirkung erreicht werden kann. Bei der Kombination der Substanzen Oxythiamin/NaDCA bzw. 2-DG/Rotenon ergaben sich zwar synergistische Effekte auf die Verminderung des ATP-Gehaltes in den getesteten Tumorzellen, eine generelle tumorselektive Wirkung konnte jedoch durch die kombinierte Behandlung nicht erreicht werden. In jüngster Zeit mehren sich die Hinweise, dass die Glutaminolyse einen sehr wichtigen Stoffwechselweg für Energiegewinnung und Syntheseprozesse von Tumorzellen darstellt. Deshalb wurde in einem dritten Schritt untersucht, ob durch die Hemmung der Glutaminolyse mit der Substanz 6-Diazo-5-oxo-L-norleuzin (DON) eine tumorspezifische Wirkung erreicht werden kann. In der Tat konnte durch DON eine andeutungsweise tumorselektive Wirkung auf den ATP-Gehalt der Zellen erzielt werden, jedoch war das therapeutische Fenster sehr eng. Durch die Hemmung der oxidativen Phosphorylierung wurde in allen drei untersuchten Tumorzelllinien eine gesteigerte Milchsäureproduktion nachgewiesen. Dies ist ein eindeutiger Hinweis dafür, dass in diesen Tumorzellen die Mitochondrien keine Defekte aufweisen. Die hier untersuchten benignen und malignen Zellen wurden hinsichtlich des Glucosestoffwechsels mit verschiedenen Methoden näher charakterisiert, um zu beurteilen, ob sich die Zellen in ihrem Stoffwechselphänotyp unterscheiden. Bei der Quantifizierung der Glucoseaufnahme wurde deutlich, dass auch manche benigne Zellen deutliche Mengen an Glucose aufnehmen, welche allerdings nur der Tumorzelllinie mit der niedrigsten Aufnahme glich. Mittels immunhistochemischer Färbungen wurden charakteristische Proteine des Zuckerstoffwechsels dargestellt. Zudem wurde die Expression von zentralen Genen des Stoffwechsels auf mRNA- bzw. Proteinebene untersucht. Hierbei wurde deutlich, dass sowohl Tumorzellen als auch manche benigne Zellen für die Glykolyse typische Proteine bzw. mRNA stark exprimieren. Fazit der Charakterisierung ist, dass es zwischen den hier verwendeten malignen und benignen Zellen keine eindeutige Differenzierung aufgrund des Stoffwechselprofils gibt, sondern sich die getesteten Zellen nur graduell unterscheiden. Dieses Ergebnis erklärt möglicherweise die geringe Tumorspezifität der getesteten Substanzen. Im Vergleich mit den vielversprechenden Ergebnissen aus der Literatur zeigten die hier gewonnenen in vitro-Daten eindeutig, dass die Wirkung von potenziell tumorhemmenden Substanzen je nach Tumorzelltyp extrem verschieden war. Dies beruht darauf, dass der vorherrschende Stoffwechseltyp (oxidativ bzw. glykolytisch) für jede Tumorentität verschieden ist. Daher muss vermutlich für jede Tumorentität bzw. sogar für jeden Patienten individuell die Wirkung und der Nutzen einer Hemmung des Tumorstoffwechsels untersucht werden, bevor künftig an eine zielgerichtete Therapie gedacht werden kann. / A characteristic feature of aggressive tumour cells is a high uptake of glucose and enhanced lactic acid production even in the presence of oxygen (aerobic glycolysis, “Warburg effect”) with a reduced use of the tricarboxylic acid cycle. Defects in mitochondrial function and oncogene activation are supposed to contribute to increased glycolysis, that is not subjected to the Pasteur effect (reduced rate of glycolysis in the presence of oxygen). The pentose phosphate pathway (PPP) is an important metabolic pathway in cancer cells, supplying building blocks for nucleotide synthesis and NADPH for proper redox control. Hence, inhibition of the PPP might block tumour cell growth. Perturbation of signalling pathways that are involved in tumour cell metabolism and are hyperactivated (Ras/PI3K/Akt/mTOR- and Raf/MEK/ERK-pathway) or suppressed (oxidative phosphorylation, p53) in cancer cells are possible targets for anticancer drugs. Thus, in this work the effect of 15 substances highly discussed as potential anticancer agents which influence the aforementioned metabolic and signalling pathways was evaluated in vitro on three different tumour cells lines [two breast cancer cells lines with different metastatic phenotype (MDA-MB 231 and 468) and one gastric cancer cell line (23132/87)] and four normal cell types [endometrial fibroblasts, endothelial cells (HUVEC), peripheral blood leukocytes and skin keratinocytes]. Aim of the study was to identify suitable candidates for targeted therapies. ATP-level was measured as readout to determine the efficacy of the substances, because the ATP content of cells correlates well with cell viability. The main focus of this work was to selectively modulate the glucose metabolism of cancer cells. Because glucose can be metabolized aerobically and anaerobically, we first tested substances that inhibit glycolysis at different steps and substances that interfere with mitochondrial metabolism. All of the 15 substances were tested as single treatment. Here, only very high concentrations of the respective substance significantly decreased ATP-levels in cancer cells - but to a much greater extend in normal cells. Therefore, in the next step we determined if impairing glucose and mitochondrial metabolism simultaneously with less toxic drug concentrations would be more specific in targeting cancer cells. Although synergistic effects were observed by co-treatment with oyxthiamine/NaDCA and 2-DG/rotenone respectively on reducing ATP-levels, this effect was not selective for tumour cells too. Recently, evidence is coming up that glutaminolysis (degradation of glutamine) is an important metabolic pathway for cancer cells providing energy substrates and building blocks. Thus, we examined if a tumour-specific effect could be achieved by inhibition of glutaminolysis with 6-Diazo-5-oxo-L-norleuzin (DON). Actually, other than the substances interfering with glucose metabolism, DON showed a tumour-specific effect to some extent, although the therapeutical range was very small. Inhibition of oxidative mitochondrial metabolism with the substances rotenone, oligomycin, 2,4-dinitrophenol and rhodamine 123 increased lactic acid production in all three cancer cell lines. Thus, it was possible to impede oxidative phosphorylation and to force the cells to increase glycolysis, indicating that mitochondria had no defects. To determine if tumour cells and normal cells differ in regard of their metabolic phenotype, the cells were analyzed for parameters concerning glucose metabolism with different methods. Quantifying glucose uptake of the cells revealed that some normal cells (fibroblasts, T-cells) take up significant amounts of glucose that are similar to those of cancer cells (MDA-MB 231) which showed the lowest glucose uptake among the three tumour cell lines tested. Characteristic proteins of glucose metabolism were analyzed using immunohistochemistry. Furthermore expression patterns of crucial genes involved in glucose metabolism were analyzed on mRNA and protein level. Thereby, it became obvious that both tumour cells as well as normal cells have very similar expression patterns regarding these typical genes. In conclusion, the characterization of tumour and normal cells did not show any substantial but rather gradual differences concerning the metabolic phenotype. These results might explain the marginal tumour specific effect of the drugs tested herein Compared to the promising results from the literature our in vitro data clearly show that the effect of potential anticancer drugs is extremely different for several tumour cell types. This might be due to the predominant metabolic phenotype (oxidative or glycolytic) of different tumour entities. Thus, we suppose that inhibition of tumour cell metabolism has to be evaluated for every single cancer cell type or even every cancer patient on regard of effect and benefit for implementation of selective cancer pharmacotherapy.

Pro-migratory signals mediated by the tumor microenvironment contribute to the cancer progression cascade, including invasion, metastasis and resistance to therapy. Derived from in vitro studies, isolated molecular steps of cancer invasion programs have been identified but their integration into the tumor microenvironment and suitability as molecular targets remain elusive. The purpose of the study was to visualize central aspects of tumor progression, including proliferation, survival and invasion by real-time intravital microscopy. The specific aims were to monitor the kinetics, mode, adhesion and chemoattraction mechanisms of tumor cell invasion, the involved guidance structures, and the response of invasion zones to anti-cancer therapy. To reach deeper tumor regions by optical imaging with subcellular resolution, near-infrared and infrared excited multiphoton microscopy was combined with a modified dorsal skinfold chamber model. Implanted HT-1080 fibrosarcoma and B16/F10 and MV3 melanoma tumors developed zones of invasive growth consisting of collective invasion strands that retained cell-cell contacts and high mitotic activity while invading at velocities of up to 200 μm per day. Collective invasion occurred predominantly along preexisting tissue structures, including blood and lymph vessels, collagen fibers and muscle strands of the deep dermis, and was thereby insensitive to RNAi based knockdown and/or antibody-based treatment against β1 and β3 integrins, chemokine (SDF-1/CXCL12) and growth factor (EGF) signaling. Therapeutic hypofractionated irradiation induced partial to complete regression of the tumor main mass, yet failed to eradicate the collective invasion strands, suggesting a microenvironmentally privileged niche. Whereas no radiosensitization was achieved by interference with EGFR or doxorubicin, the simultaneous inhibition of β1 and β3 integrins impaired cell proliferation and survival in spontaneously growing tumors and strongly enhanced the radiation response up to complete eradication of both main tumor and invasion strands. In conclusion, collective invasion in vivo is a robust process which follows preexisting tissue structures and is mainly independent of established adhesion and chemoattractant signaling. Due to its altered biological response to irradiation, collective invasion strands represent a microenvironmentally controlled and clinically relevant resistance niche to therapy. Therefore supportive regimens, such as anoikisinduction by anti-integrin therapy, may serve to enhance radio- and chemoefficacy and complement classical treatment regimens. / Die Progression von Tumorerkrankungen, einschließlich Tumorinvasion, Metastasierung und Therapieresistenz wird unter anderem durch migrationsfördernde Signale aus der Tumorumgebung vermittelt. Zur bisherigen Aufklärung einzelner Schritte des Tumorinvasions- und Progressionsprogramms trugen dabei wesentlich In-vitro-Studien bei, jedoch erfordert die Darstellung der Relevanz molekularer Zielstrukturen und deren Funktion im Tumormikromilieu die Validierung in geeigneten In-vivo-Tumormodellen. Ziel dieser Studie war, zelluläre und molekulare Mechanismen der Tumorprogression inklusive Proliferation, Überleben und Invasion mittels Echtzeit-Intravitalmikroskopie darzustellen. Untersucht wurden insbesondere die Kinetik und Arten der Tumorzellinvasion, die zugrunde liegenden Adhäsionswege und pro-migratorischen Signale (EGF, SDF-1), beteiligte Leitstrukturen des Tumorstromas, und Strategien, therapeutisch gegen Invasionszonen vorzugehen. Um tiefe Tumorareale mittels subzellulär aufgelöster optischer Bildgebung zu erreichen, wurde nah-infrarote und infrarote Multiphotonenmikroskopie mit einem modifizierten Rückenkammermodell kombiniert. Orthotope Xeno- und Allotransplantate von HT-1080-Fibrosarkom- und B16/F10- oder MV3-Melanomzellen entwickelten dabei ausgeprägte invasive Wachstumszonen bestehend aus kollektiven Invasionssträngen mit intakten Zell-Zell-Kontakten und zeitgleicher Mitoseaktivität, die Geschwindigkeiten von bis zu 200 μm pro Tag erreichten. Diese kollektive Invasion orientierte sich bevorzugt entlang von Funktionsstrukturen der tiefen Dermis wie Blut- und Lymphgefäßen, Kollagenfasern und Muskelsträngen. RNAibasierende Herrunterregulation und/oder Injektion blockierender Antikörper gegen β1 und β3 Integrine, wie auch Inhibition von EGF führten nur zu minimaler Änderung der Invasionseffizienz. Therapeutische hypofraktionierte Bestrahlung induzierte partielle bis komplette Regression der Tumorhauptmasse, nicht jedoch der kollektiven Invasionsstränge, was auf eine kombinierte Invasions- und Resistenznische hinweist. Weder Doxorubicin noch gegen EGFR gerichtete Antikörper steigerten die Radiosensitivität, jedoch führte die simultane Inhibition von β1 und β3 Integrinen zu einer starken Hemmung von Proliferation und Überleben spontan wachsender Tumoren (Anoikis) und verstärkte die Strahlungssensitivität bis hin zum kompletten Verschwinden von sowohl Tumorhauptmasse wie auch Invasionsträngen. Kollektive Invasion ist somit ein wichtiger Invasionsmodus, der sich an vorbestehenden Gewebsstrukturen orientiert und unabhängig von Integrinen und EGF- und SDF-1-Signalen erfolgt. Die kollektiven Stränge entwickeln dabei eine vom Haupttumor verschiedene biologische Reaktion auf Bestrahlung und entsprechen damit einer durch die Mikroumgebung kontrollierten und von Integrinsignalen abhängenden Resistenznische. Somit könnte eine zusätzliche anti- Integrin-Therapie die Effizienz von Bestrahlung und Chemotherapie erhöhen und klassische Behandlungsschemen/-programme ergänzen.

Erlangen, Nürnberg, University, Diss., 2007. / Enth. 3 Sonderabdr. aus verschiedenen Zeitschr.

Zugl.: Berlin, Freie Univ., Diss., 2005. / Dateiformat: zip, Dateien im PDF-Format. - Erscheinunggsjahr an der Haupttitelstelle: 2005.

In spite of the progress made in deciphering regulatory networks of cancer cells on the molecular level, the interaction of tumour cells with their stroma has not been adequately analyzed. Earlier, we have addressed the hypothesis that the murine embryonic microenvironment can induce the differentiation of human tumour cells. To examine such interactions, human leukaemic AML cells were injected into pre-implantation murine blastocysts at embryonic day 3.5 of gestation. Analysis of developing mice revealed the presence of human AML cells in chimaeric embryos and adults and the appearance of haematopoietic differentiation markers on progeny of injected human AML cells. This finding strengthens the notion that the embryonic microenvironment is capable of regulating the proliferation and differentiation of leukaemic AML cells. Based on these results, I embarked to analyse the consequences of stromal environment-induced changes in human AML cells upon in vitro coculture with selected haematopoietic stromal cell lines in terms of changes in differentiation and proliferation properties of AML cells. For this purpose, established human AML cell lines were cocultured on a variety of mitotically inactivated stromal cell lines derived from different murine embryonic/foetal haematopoietic sites such as yolk sac, aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and foetal liver. To score for coculture-induced changes, I compared the morphology, histo-chemical properties, immunophenotype, proliferation rate, and gene expression profile in cocultured and non-cocultured AML cells. Results show that, upon coculture of Kasumi-1 cells- a cell line established from a FAB class M2 patient - with AGM-derived DAS 104-4, but not with other stromal cell lines, Kasumi-1 AML cells exibit decreased proliferation and colony formation capabilities and acquire differentiated morphologies. Along this line, coculturing of Kasumi-1 cells resulted in the up-regulation of the myelo-monocytic lineage cell surface markers CD11b and CD14. Coculture also resulted in increase in lysosomal marker CD68, a hallmark of myeloid differentiation. Interestingly, apart from cell lines, coculture on DAS 104-4 stroma was also efficient in inducing myeloid differentiation of patient derived primary M2-AML cells. Moreover, cocultivation of KG-1 cell line on DAS 104-4 showed activation of -globin transcription and up-regulation of Glycophorin A on its surface, which indicate DAS 104-4 coculture-induced erythroid differentiation of KG-1 cells. Analysis of the proliferation rate of Kasumi-1 cells using the CFSE retention assay revealed that upon cocultivation on DAS 104-4, but not on NIH 3T3 cells, there is a decrease both in the proliferation rate and in the frequency of colony forming cells in clonogenic methyl cellulose cultures. Cell cycle analysis revealed the coculture-induced accumulation of G1-G0 stage cells. Gene-expression analysis by quantitative RT-PCR revealed a substantial decrease in the amount of AML1 and AML1-ETO fusion transcripts in parallel with an increase in p16, p21, C/EBP and PU.1 transcription levels. Interestingly, AML1-ETO transcription down-regulation of AML cells needs direct contact with DAS 104-4 cells. Knocking down AML1-ETO expression by siRNA strategy led to reduction in proliferation and depletion of colony forming cells in Kasumi1 cell population. siRNA-mediated AML1-ETO knock-down Kasumi-1 cells showed increased susceptibility to stroma-induced myeloid differentiation. However, on its own, AML1-ETO down-regulation was not sufficient to induce myeloid differentiation. This indicates that AML1-ETO down-regulation may have an active role on the coculture-induced effect but in addition to AML1-ETO down-regulation, further stimuli are required for the coculture-induced myeloid differentiation in the AML cells. In summary, in the present study I established and characterised a coculture-based in vitro system, which is capable of reducing the proliferation while inducing differentiation of human AML cells. The concept emerging from the studies indicates that the stroma environment can affect leukaemic cell proliferation and differentiation in contact-dependent and CD44 activation-independent manner. Furthermore, this study emphasizes the role of AML1-ETO in AML and indicates that AML1-ETO down-regulation is involved in the stroma-induced differentiation of Kasumi-1 cells. The result described here encourages further investigation into the mechanistic details of molecular and cellular interactions between the leukaemic cells and their stroma, which in turn may lead to the identification of new paradigms for a knowledge-based control and reprogramming of leukaemic cells. / Neuere Erkenntnisse in der Tumorforschung belegen, dass die Mikroumgebung neben anderen Faktoren eine bedeutende Komponente im komplexen regulatorischen Netzwerk von Tumorzellen darstellt. Doch obwohl in den letzten Jahren große Fortschritte hinsichtlich des molekularen Verständnisses der Tumorzell-Regulation gemacht wurden, wurden die Interaktionen zwischen Tumor- und Stromazellen bislang nur unzureichend analysiert. In früheren Untersuchungen stellten wir die Hypothese auf, dass die murine embryonale Mikroumgebung humane Tumorzellen zur Differenzierung anregen kann. Um diese Wechselwirkungen zu untersuchen, wurden humane AML-Zellen in murine Blastozysten injiziert und diese in scheinträchtige Ammentiere implantiert. Humane Zellen konnten sowohl in den sich entwickelnden Embryonen als auch in daraus hervorgegangenen adulten Tieren nachgewiesen werden. Außerdem exprimierten die Nachkommen der injizierten AML-Zellen hämatopoetische Differenzierungsmarker. Diese Beobachtungen unterstützen die Hypothese, dass die embryonale Mikroumgebung in der Lage ist, die Proliferation und Differenzierung humaner Leukämiezellen zu beeinflussen. Aufbauend auf diesen Ergebnissen habe ich damit begonnen, die Stroma-vermittelten Veränderungen in humanen AML-Zellen hinsichtlich ihres Proliferations- und Differenzierungsverhaltens in einem in vitro Kokultur-System zu untersuchen. Hierzu wurden etablierte humane AML-Zelllinien mit verschiedenen murinen Stromazelllinien kokultiviert, die embryonalen hämatopoetisch aktiven Geweben (Dottersack, Aorta-Gonaden-Mesonephros-Region, foetale Leber) entstammen. Anschließend wurden verschiedene Parameter, wie Morphology, Histochemie, Immunphänotyp, Proliferationsrate und Expression bestimmter Gene, kokultivierter und nicht kokultivierter AML-Zellen verglichen. Die Ergebnisse zeigen für Kasumi-1 Zellen, eine etablierte humane Leukämie-Zelllinie vom AML FAB-Typ M2, dass die Kokultur mit DAS 104-4, einer murinen Sromazelllinie, die der AGM-Region entstammt, eine Reduzierung der Proliferations- und Koloniebildungs-Fähigkeit hervorruft und sich die Morphologie der AML-Zellen in Richtung eines differenzierteren Zelltyps ändert. Übereinstimmend damit können nach Kokultur die myelo-monozytären Differenzierungsmarker CD11b und CD14 auf der Oberfläche der Kasumi-1-Zellen nachgewiesen werden. Die Kokultur führte ebenfalls zu einer Zunahme des lysosomalen Markers CD68, der ebenfalls eine myeloide Differenzierung kennzeichnet. Bemerkenswert ist, dass DAS 104-4 Stromazellen in der Lage sind, myeloide Differenzierung auch in primären M2-AML-Zellen aus einem leukämischen Patienten zu induzieren. Außerdem wurde in KG-1 AML Zellen nach Kokultur mit DAS 104-4 eine Aktivierung der -Globin-Transkription und eine verstärkte Glycophorin-A-Expression beobachtet, was auf eine Differenzierung der KG-1-Zellen in Richtung erythroide Linie hindeutet. Untersuchungen zur Proliferationsfähigkeit von Kasumi-1-Zellen mittels CFSE-Retentions-Messungen ergaben, dass nach Kokultur mit DAS 104-4 - nicht aber mit NIH 3T3-Kontrollzellen - die Zellteilungsrate vermindert ist. Gleiches gilt für die Koloniebildungs-Kapazität in Methylzellulose-Kulturen. Zellzyklus-Analysen zeigen eine kokulturinduzierte Akkumulation der AML-Zellen im G1-G0 Stadium. Genexpressionsanalysen mit Hilfe quantitativer RT-PCR verweisen auf eine deutlich herabgesetzte Transkription von AML1 und dem AML1-ETO-Fusionsgen, verbunden mit einem Anstieg der p16-, p21-, C/EBP und PU.1-Transkription. Interessanterweise ist die Abnahme von AML1-ETO Transkripten abhängig vom direkten Zellkontakt zwischen AML- und DAS 104-4-Zellen. Wird die AML1-ETO-Expression nach Einsatz spezifischer siRNA herunter reguliert, führt dies zu einer verminderten Proliferation und zur Depletion koloniebildender Zellen innerhalb der Kasumi-1-Population. Außerdem bewirkt der siRNA-vermittelte knockdown von AML1-ETO eine höhere Empfänglichkeit der Kasumi-1-Zellen für die Stroma-induzierte myeloide Differenzierung. Die Verringerung von AML1-ETO Transkripten allein hat allerdings keinen differenzierenden Effekt. Diese Beobachtungen sprechen dafür, dass AML1-ETO zwar aktiv an der kokultur-vermittelten Reaktion beteiligt ist, dass aber zusätzliche Stimuli nötig sind, um myeloide Differenzierung in den AML-Zellen auszulösen. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass in der vorliegenden Arbeit ein Kokultur-basiertes in vitro System entwickelt und charakterisiert wurde, das in der Lage ist, die Proliferationsfähigkeit von humanen AML-Zellen zu senken und ihre Differenzierung in die myeloide Linie zu induzieren. Aus den dargestellten Ergebnissen lässt sich schließen, dass das umgebende embryonale Stroma die Proliferation und Differenzierung leukämischer Zellen beeinflussen kann. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind abhängig vom direkten Kontakt zwischen Stroma- und AML-Zellen. Eine CD44-Aktivierung konnte nicht beobachtet werden. Weiterhin liefert die vorliegende Arbeit Hinweise darauf, dass die Verminderung der AML1-ETO-Transkription ein bedeutendes, jedoch nicht das allein auslösende, Ereignis der stroma-induzierten Differenzierung von Kasumi-1-Zellen darstellt. Die hier beschriebenen Resultate regen zu weiterführenden Untersuchungen an, die Aufschluss über zelluläre und molekulare Details der Interaktionen zwischen Leukämischen und Stromazellen geben sollen. Neue Erkenntnisse über die beteiligten Mechanismen könnten den Ansatz bieten, der es erlaubt, leukämische Zellen aktiv zu kontrollieren und zu reprogrammieren.

Die Migration von Tumorzellen im Bindegewebe erfordert adhäsive Zell-Matrix-Interaktionen, die durch Integrine und andere Adhäsionsmoleküle auf der Zelloberfläche vermittelt werden. In 3DKollagenmatrices benötigen hochinvasive MV3-Melanomzellen überwiegend &#945;2&#946;1-Integrine zur Elongation, Adhäsion an den Kollagenfasern und zur Faserbündelung, sowie zur Kraftgenerierung und Migration. Wir haben untersucht, ob die Migration von Tumorzellen in 3D-Kollagenmatrices vollständig durch die Blockade der Integrinfunktion inhibierbar ist, oder ob es kompensatorische Mechanismen gibt, die zur Migration beitragen. Die &#946;1-Integrinfunktion wurde durch verschiedene Methoden reduziert: a) durchflusszytometrische Sortierung der Zellen in Subgruppen mit niedriger und hoher &#946;1-Integrin-Oberflächenexpression; b) Adhäsionsblockade mit monoklonalem anti &#946;1-Antikörper 4B4 oder Rhodocetin, einem selektiven &#945;2&#946;1-Integrininantagonist; und c) Expression von dominant-negativen Peptiden zur Blockade der Funktion der &#946;1-Integrin-zytoplasmatischen Domäne. Alle &#946;1-Integrin-Interferenzstrategien induzierten einen Übergang der konstitutiv vorhandenen mesenchymalen Migration in einen neuen, amöboiden Migrationstyp (Mesenchymal-Amoeboid Transition, MAT), ähnlich der Migrationsweise von Monozyten oder Lymphozyten. Der Übergang zu amöboider Migration ging einher mit dem Verlust der zellvermittelten Kollagenkontraktion und -reorganisation. Subtotale Inhibition der Integrinfunktion (ca. 50%) durch Antikörper 4B4 ergab eine schnelle (0,3-0,4 >m/min) amöboide Migration, während 90-95%ige Absättigung des &#946;1-Integrin- Epitops zu langsamer amöboider Migration (0,03-0,2 >m/min) führte. Induzierte amöboide Migration verursachte eine gleichmäßige Verteilung der &#946;1-Integrine auf der Zelloberfläche, ein diffuses kortikales Aktin-Zytoskelett, und war mit einer ausgeprägten Formanpassung der Zelle an die Matrixstrukturen verbunden, die von kleinen Filopodien oder Oberflächenblebs getragen wurde. Die Befunde wurden für &#946;1-Integrin-defiziente murine embryonale Fibroblasten (MEF) und murine embryonale Stammzellen (GD25) bestätigt. &#946;1-Integrin-defiziente Fibroblasten zeigten eine schnelle, und GD25 ES-Zellen eine langsame amöboide Migration. Somit erfolgte die amöboide Migration ohne &#946;1-Integrin-vermittelte Zell-Matrix-Interaktionen. Weil keine vollständige Immobilisierung der Zellen erzielt wurde, haben wir alternative Mechanismen von Zell-Matrix-Interaktionen untersucht, die zur Restaktivität der amöboiden Migration beitragen. Als potentielle Kandidaten wurden &#945;v-Integrine, die an denaturiertes Kollagen binden, und Oberflächen-Glycokonjugate getestet. Es wurden keine promigratorischen Funktionen RGDabhängiger Integrine (&#945;v oder &#946;3) mittels zyklischer Arginin-Glycin-Asparaginsäure (cRGD)beobachtet. Um herauszufinden, welche Rolle die Oberfächen-Glycokalyx bei der Zellmigration spielen, wurden verschiedene Methoden angewandt: a) Die an die Proteine gebundenen Glycokonjugate wurden mit Hilfe von N- und O-Glycosidasen von der Oberfläche der lebenden Zellen enzymatisch abgespalten; b) um die Sulfatierung der Glycokonjugate zu verhindern, wurden die Zellen in sulfatfreiem Medium kultiviert. Durch beide Methoden wurde die Bindung von Rutheniumrot an die Zelloberfläche(Glycokalyx) um 60% bzw. die von Heparansulfat der Zelloberfläche um 60% bis 100% reduziert. Nicht die Desulfatierung führte zur Ablösung der Zellen vom Kulturflaschenboden, sondern allein dieBehandlung mit N- und O-Glycosidasen. Die gleichzeitige Behandlung von MV3 Melanomzellen mit N-, O- Glycosidase mit Inhibition der &#946;1-, &#945;v&#946;3-Integrine führten zur Abrundung der Mehrzahl der Zellen, gefolgt von oszillierender Immobilität (‚Running on the spot’) bzw. sehr langsamer Restmigration (<0,1 >m/min). Dagegen war die Migration der MV3-Zellen nach Kultivierung in sulfatfreiem Medium unverändert. Eine ähnliche Hemmung der Migration erfolgte in &#946;1-/- MEFs nach Glycanverdau. Folglich sind &#946;1-Integrine essentiell für fokalisierte Zell-Matrix-Interaktionen, für die mesenchymale Migration und den Matrixumbau, während amöboide Migration ohne Beteiligung von &#946;1-Integrinen erfolgt, aber durch niedrigaffine, diffuse Zell-Matrix-Interaktionen von Oberflächenglycanen vermittelt wird. Somit ist die Glycokalyx ein alternatives Adhäsionssystem für die integrinunabhängige Zellmigration. / Cancer cell migration through connective tissue requires adhesive cell matrix interactions mediated by surface integrins and other adhesion molecules. We investigated whether invasive migration in 3D ECM environments is fully abrogated by blocking integrin functions and whether compensation mechanisms might support migratory rescue. Within 3D collagen matrices, highly invasive MV3 melanoma cells preferentially utilize &#945;2&#946;1 integrins for elongation, adhesion to collagen fibers, fiber bundling, force generation, and migration. &#946;1 integrin function was reduced by a) flow cytometric sorting for subsets expressing low integrin levels; b) blocking anti &#946;1 mAb 4B4 at different concentrations or using rhodocetin, a selective &#945;2&#946;1 integrin inhibitor; and c) expression of dominantnegative peptides to compete with the &#946;1 integrin cytoplasmatic domain function. For migration in 3D collagen lattices, all &#946;1 integrin-lowering strategies uniformly resulted in conversion from constitutive mesenchymal migration to a novel amoeboid type of migration resembling monocytes or lymphocytes. The conversion to amoeboid movement was accompanied by abrogation of cell-mediated collagen contraction and reorganisation. Inhibition of integrin function by blocking antibody by approximately 50% led to fast (0.3-0.4 >m/min) but near-100% amoeboid migration, whereas 90 to 95% epitope saturation let to slow (0.03-0.2 >m/min) amoeboid migration. Induced amoeboid migration was accompanied by cell shape changes supported by small filopodia and/or surface blebs, uniform distribution of surface integrins and the lack of focalization of the cytoskeleton. Results were corroborated in &#946;1-deficient murine embryonic fibroblasts (MEFs)and murine embryonic stem cells (GD25). &#946;1-/- MEFs displayed a fast, and GD25 ES cells a slow amoeboid migration. Thus, migration could be sustained without &#946;1 integrin-mediated cell-matrix interactions. Because no complete immobilization was achieved, alternative cell-matrix interaction mechanisms underlying residual amoeboid migration were investigated. As candidates, &#945;v integrins binding denatured collagen and the surface glycoconjugates were tested, yet no promigratory role of RGD dependent integrins (&#945;v or &#946;3) was found using cyclic tripeptide arginine-glycine-aspartic acid (cRGD). To investigate the role of surface glycoconjugates, we a) enzymatically removed protein-bound glycoconjugates of the living cells using N-and O-glycosidases and b) prevented sulphation of glycoconjugates by culturing cells in sulphate-free medium. Both methods reduced surface Ruthenium red binding by 60% and heparan sulphate surface levels by 60 and 100% respectively, however only N- and O-glycosidase treatment but not desulphation caused cell detachment from the culture flask. Simultaneous treatment of MV3 melanoma cells with N- and O-glycosidase and inhibition of &#946;1, &#945;v&#946;3 integrins resulted in complete loss of polarity, cell rounding of most cells and oscillating immobility (“running on the spot”), or extremely slow residual migration below 0.1 >m/min. Sulphate-depleted medium alone did not yield any migration reduction in MV3 cells. Similar inhibition after N- und O-glycosidase treatment was obtained in &#946;1-/- MEFs. In conclusion, &#946;1 integrins are sufficient to maintain focalized cell-matrix interactions, mesenchymal migration, and matrix remodelling the abrogation of with supports transition to amoeboid migration mediated by low affinity interactions via surface glycans but not sulphated residues. Thus, the surface glycocalyx provides an alternative adhesion system sustaining integrin-independent amoeboid migration, which may approximate the minimal requirements of cell migration in an interstitial 3D tissue.

Hyaluronsäure (HS) ist ein weit verbreitetes Glykosaminoglykan in der Extrazellulärmatrix vieler Gewebe und tritt in erhöhten Konzentrationen in der Umgebung solider Tumore auf. Es ist bekannt, daß HS die Zellmigration vieler Zellarten stimuliert. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle der HS in der Tumorzellmigration auf der Basis eines dreidimensionalen Fibringel-Systems, in welches Tumorzell-bedeckte Microcarrier eingebettet wurden, untersucht. Ein Vergleich zwischen zwei- und dreidimensionaler Migration unterverschiedenen Bedingungen ergab, daß die dreidimensionale Migration nicht von HS-spezifischen Oberflächenrezeptoren abhängt, sondern hauptsächlich von der Porosität der Matrix. In zweidimensionalen Systemen war die Migration durch Antikörper gegen den HS-Rezeptor CD44 inhibierbar, unter dreidimensionalen Bedingungen jedoch nicht. Zur Bestimmung der strukturellen Eigenschaften der Fibringele wurden spektrometrische Messungen, konfokale Mikroskopie, Kompaktionsmessungen und Flüssigkeitspermeation herangezogen. Eine weitere Lokalisation ergab ein intrazelluläres Auftreten von HS vorwiegend perinukleär mit dem Zytoskelett assoziiert. Ein direkter Einfluß auf die Aktinpolymerisation konnte ausgeschlossen werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die direktionale Migration von Tumorzellen auf Endothelzellen sowohl in dreidimensionalen Fibringelsystemen als auch unter zweidimensionalen Bedingungen untersucht. Endothelzell-konditioniertes Medium wurde weiter aufgereinigt und es konnten massenspektrometrisch mehrere potentiell chemotaktisch aktive Moleküle im Medium bestimmt werden. / Hyaluronic acid (HA) is a glycosaminoglycan which is ubiquitously present in the extracellular matrix of many tissues and increased concentrations are found in the environment of solid tumors. In the first part of this work the role of HA in tumor cell migration based on a three-dimensional fibrin gel-sytem was investigated. The comparison of two- and threedimensional migration resulted in the conclusion that threedimensional migration mainly depends on the porosity of the matrix and not on specific HA-receptors. The HA-induced migration could be inhibited under two-dimensional conditions by antibodies to the HA-receptor CD44 while in three-dimensional systems the migration was unaffected by these antibodies. The structural properties of the fibrin gels were analyzed by turbidity measurement, confocal microscopy, compaction assay and liquid permeation. Further experiments resulted in perinuclear localization of this macromolecule. A direct mechanical influence of HA on actin polymerization could not be detected. The second part of this work concentrated on the directional migration of tumor cells to endothelial cells. In three-dimensional cocultures of tumor cells and endothelial cells it was found that the tumor cells were chemotactically attracted by endothelial cells. This effect could be verified in two-dimensional Boyden chamber assays. Endothelial-derived conditioned medium was further purified and possible chemotaxins for tumor cell migration could be identified by mass spectrometry.