In der Plastischen Chirurgie erfordert die Rekonstruktion von ästhetisch anspruchsvollen Bereichen in vielen Fällen die Wiederherstellung von subkutanem Fettgewebe. Neben chirurgischen Rekonstruktionen könnte das Tissue Engineering von Fettgewebe einen wertvollen Beitrag leisten. Jedoch bringt es vielschichtige Herausforderungen mit sich und ist zum aktuellen Zeitpunkt nur limitiert möglich. Ein Ansatz ist die Schaffung einer Trägermatrix zur Besiedelung und Differenzierung von Stammzellen. Auf dieser Basis sollten in der vorliegenden Arbeit zwei Teilbereiche untersucht werden. In dem ersten Teilbereich erfolgten Untersuchungen verschiedener Gewinnungsmethoden von ASCs aus dem subkutanen Fettgewebe bezogen auf ihr Effizienz. Die untersuchten Liposuktionstechniken zeigten eine deutlich höhere Effizienz gegenüber der mechanischen Gewinnungsmethode bezogen auf die gewonnene Zellzahl. In den Viabilitätsuntersuchungen zeigte sich eine ähnliche Tendenz. ASCs aller drei Gewinnungsmethoden proliferierten durchaus gleich gut, jedoch zeigten die histologischen und quantitativen Adipogeneseuntersuchungen tendenziell mehr Lipidbildung bei den Liposuktionstechniken. Das übergeordnete Ziel des zweiten Abschnittes dieser Arbeit war es eine Trägermatrix auf Hyaluronsäure-Basis mit dem vielseitig modifizierbarem Crosslinker Polyglycidol zu untersuchen, sie mit mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe zu besiedeln und diese adipogen zu differenzieren. Des Weiteren erfolgten erste Versuche die Hydrogele mit funktionellen Gruppen zu modifizieren um eine Verbesserung der Adhäsion der Zellen im Hydrogel zu erreichen. Die unmodifizierten Hydrogele waren zu jeder Zeit stabil in ihrer Form und zeigten nach Besiedelung mit ASCs eine gleichmäßige Verteilung der Zellen im Gel. Auch ließ sich die Adipogenese histologisch visualisieren und biochemisch bestätigen. Die inkorporierten Peptide brachten eine peptidabhängige und konzentrationsabhängige Veränderung der Zellverteilung im Hydrogel. Eine Steigerung der Funktionalität der Zellen bezogen auf das Überleben und die Adipogenese konnte in diesen ersten Versuchen noch nicht gezeigt werden. Generell zeigt sich eine Eignung der hyaluronsäurebasierten mit Polyglycidol-verlinkten Hydrogele für das Tissue Engineering von Fettgewebe. Weitere Untersuchungen bezüglich der Modifikation der Hydrogele mit adhäsiven und adipogenen funktionellen Gruppen bietet sich daher an und könnte ein fettgewebsähnliches Umgebungsmilieu hervorbringen. / To reconstruct complex soft tissue defects, tissue engineering of subcutaneous fat could make a valuable contribution. To generate adipose tissue, bioactive functionalized hyaluronic acid based scaffolds could be an option. Therefor ASCs isolated from subcutaneous adipose tissue, were seeded in hyaluronic acid based hydrogels crosslinked with Polyglycidol. Additionally, the hydrogels were functionalized with adhesive peptide sequences. At any time, the hydrogels were stable and showed a homogenous cell contribution. Furthermore, adipogenesis was demonstrated. Differences between the pure and functionalized hydrogel could not be seen.

Gelenkknorpel besitzt aufgrund seiner avaskulären Natur und der fehlenden mitotischen Aktivität der Chondrozyten bei Schäden kaum Potential zur Selbstheilung. Traumatische Läsionen und degenerative Veränderungen münden im Krankheitsbild der Osteoarthrose, welches mit dem Untergang des Gelenkknorpels einhergeht. Ein neuerer Therapieansatz ist das Tissue Engineering von Gelenkknorpel, wobei jedoch die laterale Integration der Implantate mit dem nativen Knorpelgewebe problematisch bleibt. Ein Adhäsivum kann neben einer adäquaten Sofortadhäsion die Langzeitintegration fördern. In dieser Arbeit wurden verschiedene Polyethylenglykol (PEG)-basierte Zweikomponentenkleber, ausgehend vom kommerziell erhältlichen Gewebekleber CoSeal™, auf ihre Eignung für Gelenkknorpel untersucht. Dabei wurde Hyaluronsäure (HA) als physiologischer Bestandteil von Gelenkknorpel in thiolierter Form (HA-SH) als Komponente verwendet und auf seine prointegrativen Eigenschaften untersucht. Der den CoSeal™-Komponenten entsprechende 4-Succinimidyl-Glutarat/4-Thiol-PEG (4SG/4T-PEG)-Kleber hatte sich trotz seiner hohen Sofortadhäsionskraft auch nach der Substitution des 4T-PEG mit HA-SH als zu schnell in flüssiger Umgebung degradierend gezeigt, um eine suffiziente Langzeitintegration zu erreichen. Durch die Verwendung der langsamer degradierenden funktionellen 4-Succinimidyl-Carbonat-PEG (4C-PEG)-Komponente konnte die Langzeitadhäsionskraft in Kombination mit 4-Amin-PEG (4A-PEG) durch die stabilere Amid-Bindung zum einen und in Kombination mit HA-SH zum anderen signifikant gesteigert werden. Immunhistochemisch konnten bei beiden HA-haltigen Klebern Zeichen von Knorpelintegration nachgewiesen werden, während der 4C/4A-PEG-Kleber keine Integrationszeichen aufwies. Im 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromid (MTT)-Assay war bei keinem Adhäsivum eine zytotoxische Wirkung zu erkennen. Insgesamt bieten die untersuchten PEG-basierten Adhäsiva im Vergleich zu den weitverbreiteten Fibrinklebern eine deutlich höhere Sofortadhäsion, welche vergleichbar mit glutaraldehydbasierten Klebern ist. Allerdings können die initialen adhäsiven Kräfte, trotz histologisch nachweisbaren Integrationszeichen bei Inkorporation von HA, nicht langfristig aufrechterhalten werden, so dass Fibrinkleber weiterhin die Spitzengruppe in Sachen Langzeitadhäsion bilden. Da PEG eine ausgezeichnete Biokompatibilität, einfache Anwendbarkeit und zahlreiche weitere chemische Anpassungsmöglichkeiten zur Feinabstimmung der Degradationseigenschaften bietet, ist in Zukunft ein erfolgreicher Einsatz auch im Bereich von Gelenkknorpel denkbar. Für die experimentelle Untersuchung von Adhäsiva und Gelenkknorpel werden biomechanische Versuchsmodelle benötigt. Der Tensile-Test des Sandwich-Modells konnte im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich etabliert und ein Protokoll festgelegt werden. In einem vergleichenden Versuch mit dem Push-Out-Test des Disc-Ring-Modells, welches als Referenzmodell dient, konnte in Bezug auf die Reproduzierbarkeit und Qualität der Messergebnisse die Gleichwertigkeit gezeigt werden. Insgesamt bietet er eine gute Alternative zum Push-Out-Test, um weiterführende Fragestellung, wie z.B. extrinsische Kraftwirkungen auf das Konstrukt, zu untersuchen. / Articular cartilage has little potential for self-healing due to its avascular nature and the lack of mitotic activity of chondrocytes in case of damage. Traumatic injuries and degenerative changes lead to the development of osteoarthritis, which is characterized by the destruction of articular cartilage. A more recent therapeutic approach is tissue engineering of articular cartilage, but the lateral integration of implants with native cartilage tissue remains problematic. An adhesive can promote long-term integration in addition to adequate immediate adhesion. In this thesis, various polyethylene glycol (PEG)-based two-component adhesives, derived from the commercially available tissue adhesive CoSeal™, were investigated for their suitability for articular cartilage. Hyaluronic acid (HA), a physiological component of articular cartilage, was used as a component in its thiolated form (HA-SH) and examined for its pro-integrative properties. Despite its high immediate adhesive strength, the 4-succinimidyl-glutarate/4-thiol-PEG (4SG/4T-PEG) adhesive, whose components correspond to the CoSeal™ components, showed rapid degradation in a liquid environment even after substituting the 4T-PEG-component with HA-SH, which hindered sufficient long-term integration. By using the slower degrading functional 4-succinimidyl-carbonate-PEG (4C-PEG) component, the long-term adhesive strength was significantly increased in combination with 4-amine-PEG (4A-PEG) due to the resulting more stable amide bond an in combination with HA-SH. Immunohistochemical analysis showed signs of cartilage integration for both HA-containing adhesives, while the 4C/4A-PEG-adhesive showed no signs of integration. In the 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, none of the adhesives exhibited cytotoxic effects. Overall, the investigated PEG-based adhesives offer a significantly higher immediate adhesive strength compared to the widely used fibrin glues, which is comparable to glutaraldehyde-based adhesives. However, despite histologically detectable signs of integration when HA was incorporated, the initial adhesive forces cannot be maintained in the long term, so fibrin glue continues to be at the forefront in terms of long-term adhesion. Since PEG offers excellent biocompatibility, easy applicability, and numerous other chemical customization options for fine-tuning degradation properties, successful use in the field of articular cartilage is conceivable in the future. For the experimental investigation of adhesives and articular cartilage, biomechanical test models are required. The tensile test of the sandwich model including a corresponding protocol was successfully established in this thesis. In a comparative experiment with the push-out test of the disc-ring model, which serves as a reference model, equivalence was demonstrated in terms of reproducibility and quality of test results. Overall, it provides a good alternative to the push-out test for investigating further questions, such as extrinsic force effects on the construct.

In dieser Arbeit sollte die Funktion von FGF-Signalen im Herzfeld und in der Entwicklung des Proepikards im Hühnerembryo untersucht werden. Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF) sind eine große Gruppe von Signalmolekülen und in eine Vielzahl von Entwicklungsprozessen involviert. Das Proepikard (PE), welches sich asymmetrisch auf dem rechten Sinushorn des Sinus venosus entwickelt, bildet die Grundlage des Koronargefäßsystems des Herzens. FGF-Liganden (FGF2, FGF10, FGF12) werden insbesondere in den epithelialen Zellen des Proepikards exprimiert, sowie an der sinomyokardialen Basis dieser embryonalen Progenitorpopulation. Die FGF-Rezeptoren (FGFR1, FGFR2, FGFR4) weisen ein ähnliches Expressionsmuster auf und deren Inhibition, durch spezifische Antagonisten, war der Ausgangspunkt für die funktionelle Analyse der proepikardialen FGF-Signalaktivität. Die Inhibition von FGF-Signalen in vitro führt zu einem verringerten Wachstum sowie einer erhöhten Apoptoserate in proepikardialen Explantaten, die unter serumfreien Bedingungen kultiviert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl der Ras/MAPK- als auch der PI3-Kinase-Signalweg, beides Bestandteile der FGF-Signaltransduktion, für das Wachstum und Überleben proepikardialer Zellen verantwortlich sind. Dagegen sind FGF-Signale nicht in die Etablierung proepikardialer Identität involviert, wie die Analyse der Expression etablierter proepikardialer Markergene wie TBX18, WT1 und TBX5 nach FGF-Inhibition zeigte. Dies konnte gleichfalls durch in vivo-Experimente gezeigt werden, in denen die rechtsseitige Inhibition von FGF zu einem retardierten Proepikardwachstum führte. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die asymmetrische Apoptose in der sich transient entwickelnden linksseitigen Proepikardanlage auf eine frühe differentielle Expression von Apoptosegenen wie Caspase 2 zurückgeht. Diese asymmetrische Expression wird von FGF8 reguliert, wahrscheinlich als Teil eines frühen rechtsseitigen Signalweges, der Apoptose im rechten Sinushorn des kardialen Einflusstraktes verhindert. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Expression der Hyaluronansynthase 2 (HAS2) in Abhängigkeit von FGF in der Herzfeldregion analysiert. Hyaluronansynthasen produzieren Hyaluronsäure, welches eine essentielle Komponente der extrazellulären Matrix ist. Es wurde in vivo gezeigt, dass die Expression von HAS2 im primären Herzfeld in gleicher Weise von FGF reguliert wird wie die des kardialen Transkriptionsfaktors NKX2.5. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass FGF während der frühen Entwicklung des Herzens und der Entstehung des Proepikards diverse Funktionen besitzt. / The aim of this study was the functional analysis of FGF signaling during early heart field formation and proepicardial development in the chick embryo. Fibroblast growth factors (FGF) belong to a large group of signaling molecules and play crucial roles in many different developmental processes. The proepicardium (PE) develops asymmetrically on the right sinus horn of the cardiac inflow tract and is the source of the coronary vasculature of the heart. FGF ligands (FGF2, FGF10, and FGF12) are specifically expressed in epithelial cells of the proepicardium as well as in the underlying inflow tract myocardium. FGF receptors (FGFR1, FGFR2, and FGFR4) display similar expression patterns in the proepicardium and their inhibition by specific antagonists was the entry point into the functional analysis of FGF signaling in proepicardial cells. The inhibition of FGF signaling in vitro leads to retarded outgrowth as well as increased apoptosis in proepicardial explants, which were cultured under serum free conditions. It was shown that both Ras/MAPK and PI3 kinase signaling as integral parts of FGF signaling transduction are responsible for growth and survival of proepicardial cells in this context. However, FGF signaling is not involved in the establishment of proepicardial identity as shown by the maintenance of expression of well-established proepicardial marker genes such as TBX18, WT1 and TBX5 after FGF inhibition. These findings were verified by in vivo experiments, showing that inhibition of FGF leads to retarded outgrowth of the proepicardium. Furthermore it was shown that asymmetric apoptosis in a transiently established left-sided PE-anlage is based on an early differential expression of apoptosis-inducing genes like Caspase 2. This asymmetric expression is regulated by FGF8 probably as part of an early right-sided signaling pathway, which prevents apoptosis in the right sinus horn of the cardiac inflow tract. In a second topic of this thesis the expression of the hyaluronan synthase 2 (HAS2) in the control of FGF signaling during early heart field formation was analyzed. Hyaluronan synthases are involved in the production of hyaluronic acid, which is an essential component of the extracellular matrix. The role of FGF signaling was tested in vivo and it is shown here, that the expression of HAS2 in the primary heart field is dependent on FGF as well as other cardiac marker genes such as the transcription factor NKX2.5. This thesis demonstrates that FGF has multiple roles during early heart development and formation of the proepicardium.

Hyaluronsäure (HS) ist ein weit verbreitetes Glykosaminoglykan in der Extrazellulärmatrix vieler Gewebe und tritt in erhöhten Konzentrationen in der Umgebung solider Tumore auf. Es ist bekannt, daß HS die Zellmigration vieler Zellarten stimuliert. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle der HS in der Tumorzellmigration auf der Basis eines dreidimensionalen Fibringel-Systems, in welches Tumorzell-bedeckte Microcarrier eingebettet wurden, untersucht. Ein Vergleich zwischen zwei- und dreidimensionaler Migration unterverschiedenen Bedingungen ergab, daß die dreidimensionale Migration nicht von HS-spezifischen Oberflächenrezeptoren abhängt, sondern hauptsächlich von der Porosität der Matrix. In zweidimensionalen Systemen war die Migration durch Antikörper gegen den HS-Rezeptor CD44 inhibierbar, unter dreidimensionalen Bedingungen jedoch nicht. Zur Bestimmung der strukturellen Eigenschaften der Fibringele wurden spektrometrische Messungen, konfokale Mikroskopie, Kompaktionsmessungen und Flüssigkeitspermeation herangezogen. Eine weitere Lokalisation ergab ein intrazelluläres Auftreten von HS vorwiegend perinukleär mit dem Zytoskelett assoziiert. Ein direkter Einfluß auf die Aktinpolymerisation konnte ausgeschlossen werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die direktionale Migration von Tumorzellen auf Endothelzellen sowohl in dreidimensionalen Fibringelsystemen als auch unter zweidimensionalen Bedingungen untersucht. Endothelzell-konditioniertes Medium wurde weiter aufgereinigt und es konnten massenspektrometrisch mehrere potentiell chemotaktisch aktive Moleküle im Medium bestimmt werden. / Hyaluronic acid (HA) is a glycosaminoglycan which is ubiquitously present in the extracellular matrix of many tissues and increased concentrations are found in the environment of solid tumors. In the first part of this work the role of HA in tumor cell migration based on a three-dimensional fibrin gel-sytem was investigated. The comparison of two- and threedimensional migration resulted in the conclusion that threedimensional migration mainly depends on the porosity of the matrix and not on specific HA-receptors. The HA-induced migration could be inhibited under two-dimensional conditions by antibodies to the HA-receptor CD44 while in three-dimensional systems the migration was unaffected by these antibodies. The structural properties of the fibrin gels were analyzed by turbidity measurement, confocal microscopy, compaction assay and liquid permeation. Further experiments resulted in perinuclear localization of this macromolecule. A direct mechanical influence of HA on actin polymerization could not be detected. The second part of this work concentrated on the directional migration of tumor cells to endothelial cells. In three-dimensional cocultures of tumor cells and endothelial cells it was found that the tumor cells were chemotactically attracted by endothelial cells. This effect could be verified in two-dimensional Boyden chamber assays. Endothelial-derived conditioned medium was further purified and possible chemotaxins for tumor cell migration could be identified by mass spectrometry.

The aim of the work was the development of thiol-ene cross-linked hydrogels based on functionalized poly(glycidol)s (PG) and hyaluronic acid (HA) for extrusion based 3D bioprinting. Additionally, the functionalization of the synthesized PG with peptides and the suitability of these polymers for physically cross-linked gels were investigated, in a proof of principle study in order to demonstrate the versatile use of PG polymers in hydrogel development. First, the precursor polymers of the different hydrogel systems were synthesized. For thiol-ene cross-linked hydogels, linear allyl-functionalized PG (P(AGE-co-G)) and three different thiol-(SH-)functionalized polymers, ester-containing PG-SH (PG SHec), ester-free PG-SH (PG-SHef) and HA-SH were synthesized and analysed, The degree of functionalization of these polymers was adjustable. For physically cross-linked hydrogels, peptide-functionalized PG (P(peptide-co-G)), was synthesized through polymer analogue thiol-ene modification of P(AGE-co-G). Subsequently, thiol-ene cross-linked hydrogels were prepared with the synthesized thiol- and allyl-functionalized polymers. Depending on the origin of the used polymers, two different systems were obtained: on the one hand synthetic hydrogels consisting of PG-SHec/ef and P(AGE-co-G) and on the other hand hybrid gels, consisting of HA-SH and P(AGE-co-G). In synthetic gels, the degradability of the gels was determined by the applied PG-SH. The use of PG-SHec resulted in hydrolytically degradable hydrogels, whereas the cross-linking with PG-SHef resulted in non-degradable gels. The physical properties of these different hydrogel systems were determined by swelling, mechanical and diffusion studies and subsequently compared among each other. In swelling studies the differences of degradable and non-degradable synthetic hydrogels as well as the differences of synthetic compared to hybrid hydrogels were demonstrated. Next, the stiffness and the swelling ratios (SR) of the established hydrogel systems were examined in dependency of different parameters, such as incubation time, polymer concentration and UV irradiation. In general, these measurements revealed the same trends for synthetic and hybrid hydrogels: an increased polymer concentration as well as prolonged UV irradiation led to an increased network density. Moreover, it was demonstrated that the incorporation of additional non-bound HMW HA hampered the hydrogel cross-linking resulting in gels with decreased stiffness and increased SR. This effect was strongly dependent on the amount of additional HMW HA. The diffusion of different molecular weight fluorescein isothiocyanate-dextran (FITC-dextran) through hybrid hydrogels (with/without HMW HA) gave information about the mesh size of these gels. The smallest FITC-dextran (4 kDa) completely diffused through both hydrogel systems within the first week, whereas only 55 % of 40 kDa and 5-10 % HMW FITC-dextrans (500 kDa and 2 MDa) could diffuse through the networks. The applicability of synthetic and hybrid hydrogels for cartilage regeneration purpose was investigated through by biological examinations. It was proven that both gels support the survival of embedded human mesenchymal stromal cells (hMSCs) (21/28 d in vitro culture), however, the chondrogenic differentiation was significantly improved in hybrid hydrogels compared to synthetic gels. The addition of non-bound HMW HA resulted in a slightly less distinct chondrogenesis. Lastly the printability of the established hydrogel systems was examined. Therefore, the viscoelastic properties of the hydrogel solutions were adjusted by incorporation of non-bound HMW HA. Both systems could be successfully printed with high resolution and high shape fidelity. The introduction of the double printing approach with reinforcing PCL allowed printing of hydrogel solutions with lower viscosities. As a consequence, the amount of additional HMW HA necessary for printing could be reduced allowing successful printing of hybrid hydrogel solutions with embedded cells. It was demonstrated that the integrated cells survived the printing process with high viability measured after 21 d. Moreover, by this reinforcing technique, robust hydrogel-containing constructs were fabricated. In addition to thiol-ene cross-linked hydrogels, hydrogel cross-linking via ionic interactions was investigated with a hybrid hydrogel based on HMW HA and peptide-functionalized PG. Rheological measurements revealed an increase in the viscosity of a 2 wt.% HMW HA solution by the addition of peptide-functionalized PG. The increase in viscosity could be attributed to the ionic interactions between the positively charge PG and the negatively charge HMW HA. In conclusion, throughout this thesis thiol-ene chemistry and PG were introduced as promising cross-linking reaction and polymer precursor for the field of biofabrication. Furthermore, the differences of hybrid and synthetic hydrogels as well as chemically and physically cross-linked hydrogels were demonstrated. Moreover, the double printing approach was demonstrated to be a promising tool for the fabrication of robust hydrogel-containing constructs. It opens the possibility of printing hydrogels that were not printable yet, due to too low viscosities. / Ziel der Arbeit war die Entwicklung von Thiol-En-vernetzten Hydrogelen basierend auf funktionalisierten Poly(glyzidolen) (PG) und Hyaluronsäure (HA) für das extrusionsbasierte 3D-Biodrucken. Um die vielseitigen Anwendungsmöglichkeiten von PG-Polymeren für die Hydrogelentwicklung zu zeigen, wurde darüber hinaus, in einer Proof-of-Principle-Studie, PG mit Peptiden funktionalisiert und die Eignung dieser Polymere für die Herstellung von physikalisch vernetzten Gelen untersucht. Zunächst wurden die Vorläuferpolymere für die verschiedenen Hydrogelsysteme synthetisiert. Für die Thiol-En-vernetzten Hydrogele wurde lineares Allyl-funktionalisiertes PG (P(AGE-co-G)) und drei verschiedene Thiol-(SH )funktionalisierte Polymere, Ester haltiges PG-SH (PG-SHec), Ester freies PG SH (PG-SHef) und HA-SH synthetisiert und analysiert. Dabei war der Funktionalisierungsgrad dieser Polymere einstellbar. Für physikalisch vernetzte Hydrogele wurde Peptid-funktionalisierte PGs (P(Peptid co-G)) mittels polymeranaloger Thiol-En-Modifikation von P(AGE-co-G) synthetisiert. Anschließend wurden Thiol-En-vernetzte Hydrogele auf Basis der synthetisierten Thiol- und Allyl-funktionalisierten Polymeren hergestellt. Je nach Ursprung der verwendeten Polymere wurden zwei verschiedene Systeme erhalten: einerseits synthetische Hydrogele bestehend aus PG-SHec/ef und P(AGE-co-G) und andererseits hybride Gele, bestehend aus HA-SH und P(AGE-co-G). Bei den synthetischen Gelen wurde die Abbaubarkeit der Gele durch das verwendete PG-SH bestimmt. Die Verwendung von PG-SHec resultierte in hydrolytisch abbaubaren Hydrogelen, während die Vernetzung mit PG-SHef zu nicht abbaubaren Gelen führte. Die physikalischen Eigenschaften der verschiedenen Hydrogelsysteme wurden mittels Quell-, mechanischen und Diffusionsexperimenten bestimmt und anschließend miteinander verglichen. Die Quellungsstudien zeigten die Unterschiede von abbaubaren und nicht abbaubaren synthetischen Hydrogelen, sowie die Unterschiede von synthetischen gegenüber hybriden Hydrogelen. Als nächstes wurden die Steifigkeit und das Quellverhältnis (SR) der etablierten Hydrogelsysteme in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern wie Inkubationszeit, Polymerkonzentration und UV-Bestrahlung untersucht. Im Allgemeinen zeigten diese Messungen für synthetische und hybride Hydrogele die gleichen Trends: eine erhöhte Polymerkonzentration sowie eine verlängerte UV-Bestrahlung führten zu einer erhöhten Netzwerkdichte. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass das Einbringen zusätzlicher, nicht gebundener HMW HA die Hydrogelvernetzung behinderte, was zu Gelen mit verringerter Steifigkeit und erhöhtem SR führte. Dieser Effekt war stark abhängig von der Menge an zusätzlich eingebrachter HMW HA. Die Diffusion von Fluorescein-Isothiocyanat-Dextran (FITC-Dextran) mit unterschiedlichem Molekulargewichten durch hybride Hydrogele (mit/ohne HMW HA) lieferte Informationen über die Maschengröße dieser Gele. Das kleinste FITC-Dextran (4 kDa) diffundierte innerhalb der ersten Woche vollständig durch beide Hydrogelsysteme, während nur 55 % der 40 kDa und 5-10 % HMW FITC-Dextrane (500 kDa und 2 MDa) durch die Netzwerke diffundieren konnten. Die Anwendbarkeit von synthetischen und hybriden Hydrogelen für Knorpelregenerationszwecke wurde durch biologische Experimente untersucht. Es wurde bewiesen, dass beide Gele das Überleben von eingebetteten humanen mesenchymalen Stromazellen (hMSCs) unterstützen (21/28 d in vitro Kultur), jedoch war die chondrogene Differenzierung in hybriden Hydrogelen im Vergleich zu synthetischen Gelen signifikant verbessert. Die Zugabe von nicht gebundenem HMW HA führte zu einer etwas weniger ausgeprägten Chondrogenese. Zuletzt wurde die Druckbarkeit der etablierten Hydrogelsysteme untersucht. Dafür wurden die viskoelastischen Eigenschaften der Hydrogellösungen durch das Einbringen von nicht gebundener HMW HA eingestellt. Beide Systeme konnten erfolgreich mit hoher Auflösung und hoher Formgenauigkeit gedruckt werden. Die Einführung des Doppeldruck-Konzeptes mit verstärkendem PCL ermöglichte das Drucken von Hydrogellösungen mit niedrigeren Viskositäten. Infolgedessen konnte die für den Druck notwendige Menge an HMW HA reduziert und hybride Hydrogellösungen mit eingebetteten Zellen erfolgreich gedruckt werden. Es wurde gezeigt, dass die integrierten Zellen den Druckprozess mit hoher Vitalität überlebten (gemessen nach 21 d). Darüber hinaus wurden mit dieser Verstärkungstechnik robuste Hydrogel-enthaltende Konstrukte hergestellt. Zusätzlich zu den Thiol-En-vernetzten Hydrogelen wurde die Hydrogelvernetzung mittels elektrostatischen Wechselwirkungen mit einem hybriden Gel auf der Basis von HMW HA und Peptid-funktionalisiertem PG untersucht. Rheologische Messungen ergaben eine Erhöhung der Viskosität einer 2 wt.% HMW HA Lösungen durch die Zugabe von Peptid-funktionalisiertem PG. Der Viskositätsanstieg konnte auf die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen dem positiv geladenen PG und der negativ geladenen HMW HA zurückgeführt werden. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit die Thiol-En-Chemie und PG als vielversprechende Vernetzungsreaktion bzw. Polymervorstufe für die Biofabrikation eingeführt. Des Weiteren wurden die Unterschiede von hybriden und synthetischen Hydrogelen sowie von chemisch und physikalisch vernetzten Hydrogelen aufgezeigt. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass das Doppeldruck-Konzept eine vielversprechende Methode für die Herstellung von robusten Hydrogel-enthaltenden Konstrukten ist. Es eröffnet die Möglichkeit, Hydrogele zu drucken, die aufgrund zu geringer Viskositäten bis jetzt nicht druckbar waren.

Improved treatment options for the degenerative joint disease osteoarthritis (OA) are of major interest, since OA is one of the main sources of disability, pain, and socioeconomic burden worldwide [202]. According to epidemiological data, already 27 million people suffer from OA in the US [23]. Moreover, the WHO expects OA to be the fourth most common cause of disability in 2020 [203], illustrating the need for effective and long-lasting therapy options of severe cartilage defects. Despite numerous clinically available products for the treatment of cartilage defects [62], the development of more cartilage-specific materials is still at the beginning. Hyaluronic acid (HA) is a major component of the cartilaginous extracellular matrix (ECM) and inherently creates a cell-friendly niche by providing cell attachment and migration sites. Furthermore, it is known that the functional groups of HA are well suited for chemical modification. These characteristics render HA an attractive material for hydrogel-based tissue engineering approaches. Poly(glycidol) (PG) as chemical crosslinker basically features similar chemical characteristics as the widely used poly(ethylene glycol) (PEG), but provides additional side groups at each repeating unit that can be further chemically functionalized. With the introduction of PG as multifunctional crosslinker for HA gels, a higher cross-linking density and, accordingly, a greater potential for biomimetic functionalization may be achieved. However, despite the mentioned potential benefits, PG has not been used for cartilage regeneration approaches so far. The initial aim of the study was to set up and optimize a HA-based hydrogel for the chondrogenic differentiation of mesenchymal stromal cells (MSCs), using different amounts and variations of cross-linkers. Therefore, the hydrogel composition was optimized by the utilization of different PEG diacrylate (PEGDA) concentrations to cross-link thiol-modified HA (Glycosil, HA-SH) via Michael addition. We aimed to generate volumestable scaffolds that simultaneously enable a maximum of ECM deposition. Histological and biochemical analysis showed 0.4% PEGDA as the most suitable concentration for these requirements (Section 5.1.2). In order to evaluate the impact of a differently designed cross-linker on MSC chondrogenesis, HA-SH was cross-linked with PEGTA (0.6%) and compared to PEGDA (0.4%) in a next step. Following this, acrylated PG (PG-Acr) as multifunctional cross-linker alternative to acrylated PEG was evaluated. It provides around five times more functional groups when utilized in PG-Acr (0.6%) HA-SH hydrogels compared to PEGTA (0.6%) HA-SH hydrogels, thus enabling higher degrees of biomimetic functionalization. Determination of cartilage-specific ECM components showed no substantial differences between both cross-linkers while the deposition of cartilaginous matrix appeared more homogeneous in HA-SH PG-Acr gels. Taken together, we were able to successfully increase the possibilities for biomimetic functionalization in the developed HA-SH hydrogel system by the introduction of PG-Acr as cross-linker without negatively affecting MSC chondrogenesis (Section 5.1.3). The next part of this thesis focused extensively on the biomimetic functionalization of PG-Acr (0.6%) cross-linked HA-SH hydrogels. Here, either biomimetic peptides or a chondrogenic growth factor were covalently bound into the hydrogels. Interestingly, the incorporation of a N-cadherin mimetic (HAV), a collagen type II binding (KLER), or a cell adhesion-mediating peptide (RGD) yielded no improvement of MSC chondrogenesis. For instance, the covalent binding of 2.5mM HAV changed morphology of cell nuclei and reduced GAG production while the incorporation of 1.0mM RGD impaired collagen production. These findings may be attributed to the already supportive conditions of the employed HA-based hydrogels for chondrogenic differentiation. Most of the previous studies reporting positive peptide effects on chondrogenesis have been carried out in less supportive PEG hydrogels or in significantly stiffer MeHA-based hydrogels [99, 101, 160]. Thus, the incorporation of peptides may be more important under unfavorable conditions while inert gel systems may be useful for studying single peptide effects (Section 5.2.1). The chondrogenic factor transforming growth factor beta 1 (TGF-b1) served as an example for growth factor binding to PG-Acr. The utilization of covalently bound TGF-b1 may thereby help overcome the need for repeated administration of TGF-b1 in in vivo applications, which may be an advantage for potential clinical application. Thus, the effect of covalently incorporated TGF-b1 was compared to the effect of the same amount of TGF-b1 without covalent binding (100nM TGF-b1) on MSC chondrogenesis. It was successfully demonstrated that covalent incorporation of TGF-b1 had a significant positive effect in a dose-dependent manner. Chondrogenesis of MSCs in hydrogels with covalently bound TGF-b1 showed enhanced levels of chondrogenesis compared to hydrogels into which TGF-b1 was merely mixed, as shown by stronger staining for GAGs, total collagen, aggrecan and collagen type II. Biochemical evaluation of GAG and collagen amounts, as well as Western blot analysis confirmed the histological results. Furthermore, the positive effect of covalently bound TGF-b1 was shown by increased expression of chondrogenic marker genes COL2A1, ACAN and SOX9. In summary, covalent growth factor incorporation utilizing PG-Acr as cross-linker demonstrated significant positive effects on chondrogenic differentiation of MSCs (Section 5.2.2). In general, PG-Acr cross-linked HA hydrogels generated by Michael addition represent a versatile hydrogel platform due to their high degree of acrylate functionality. These hydrogels may further offer the opportunity to combine several biological modifications, such as the incorporation of biomimetic peptides together with growth factors, within one cell carrier. A proof-of-principle experiment demonstrated the suitability of pure PG gels for studying single peptide effects. Here, the hydrogels were generated by the utilization of thiol-ene-click reaction. In this setting, without the supportive background of hyaluronic acid, MSCs showed enhanced chondrogenic differentiation in response to the incorporation of 1.0mM HAV. This was demonstrated by staining for GAGs, the cartilage-specific ECM molecules aggrecan and type II collagen, and by increased GAG and total collagen amounts shown by biochemical analysis. Thus, pure PG gels exhibit the potential to study the effects and interplay of peptides and growth factors in a highly modifiable, bioinert hydrogel environment. The last section of the thesis was carried out as part of the EU project HydroZONES that aims to develop and generate zonal constructs. The importance of zonal organization has attracted increased attention in the last years [127, 128], however, it is still underrepresented in tissue engineering approaches so far. Thus, the feasibility of zonal distribution of cells in a scaffold combining two differently composed hydrogels was investigated. A HA-SH(FMZ) containing bottom layer was generated and a pure PG top layer was subsequently cast on top of it, utilizing both times thiol-ene-click reaction. Indeed, stable, hierarchical constructs were generated that allowed encapsulated MSCs to differentiate chondrogenically in both zones as shown by staining for GAGs and collagen type II, and by quantification of GAG amount. Thus, the feasibility of differently composed zonal hydrogels utilizing PG as a main component was successfully demonstrated (Section 5.4). With the first-time utilization and evaluation of PG-Acr as versatile multifunctional cross-linker for the preparation of Michael addition-generated HA-SH hydrogels in the context of cartilage tissue engineering, a highly modifiable HA-based hydrogel system was introduced. It may be used in future studies as an easily applicable and versatile toolbox for the generation of biomimetically functionalized hydrogels for cell-based cartilage regeneration. The introduction of reinforcement structures to enhance mechanical resistance may thereby further increase the potential of this system for clinical applications. Additionally, it was also demonstrated that thiol-ene clickable hydrogels can be used for the generation of cell-laden, pure PG gels or for the generation of more complex, coherent zonal constructs. Furthermore, thiol-ene clickable PG hydrogels have already been further modified and successfully been used in 3D bioprinting experiments [204]. 3D bioprinting, as part of the evolving biofabrication field [205], offers the possibilities to generate complex and hierarchical structures, and to exactly position defined layers, yet at the same time alters the requirements for the utilized hydrogels [159, 206–209]. Since a robust chondrogenesis of MSCs was demonstrated in the thiol-ene clickable hydrogel systems, they may serve as a basis for the development of hydrogels as so called bioinks which may be utilized in more sophisticated biofabrication processes. / Es ist von großem Interesse die Therapieoptionen für die degenerative Gelenkerkrankung Osteoarthrose (OA) zu verbessern, da OA als eine der weltweit häufigsten Ursachen von Bewegungseinschränkungen und Schmerzen gilt und somit eine sozioökonomische Belastung darstellt [202]. Laut epidemiologischen Studien leiden bereits 27 Millionen Menschen in den USA an OA [23]. Darüber hinaus geht die WHO davon aus, dass OA bereits im Jahr 2020 die vierthäufigste Ursache von körperlichen Behinderungen sein wird [203], was die Notwendigkeit für effektive und langanhaltende Therapien von schweren Knorpeldefekten zeigt. Obwohl sich bereits eine Vielzahl von Therapien in klinischer Anwendung für die Behandlung von Knorpeldefekten befindet [62], ist die Entwicklung von knorpelspezifischen Produkten noch nicht weit fortgeschritten. Hyaluronsäure (HA), als Hauptbestandteil der Extrazellulären Matrix (ECM) von Knorpel, stellt eine generell zytokompatible Umgebung dar, die Zellen von Natur aus Bindungsstellen zur Adhäsion und Fortbewegung bietet. Zudem ist bekannt, dass die funktionellen Gruppen von HA besonders gut für chemische Modifikationen geeignet sind. Aufgrund dieser Eigenschaften wird HA häufig als Material für das hydrogelbasierte Tissue Engineering verwendet. Durch die Verwendung von Poly(glycidol) (PG) als Cross-linker stehen die gleichen chemischen Eigenschaften wie bei der Verwendung des gängigen Cross-linkers Poly(ethylene glycol) (PEG) zur Verfügung, allerdings bietet es zusätzliche Seitenketten an jeder Wiederholungseinheit. Durch die Einführung von PG als multifunktionalem Cross-linker zur Herstellung von HA-Gelen ergibt sich letztlich eine höhere Vernetzungsdichte und damit auch ein größeres Potenzial für biomimetische Funktionalisierungen. Trotz dieser genannten Vorteile wird PG bisher noch nicht im Bereich der Knorpelregeneration verwendet. Das erste Ziel dieser Arbeit beinhaltete die Etablierung und Optimierung eines HA-basierten Hydrogels für die chondrogene Differenzierung von Mesenchymalen Stromazellen (MSCs). Hierzu wurden verschiedene Mengen und Derivate von Cross-linkern eingesetzt. Zunächst wurde die Hydrogelzusammensetzung mithilfe von verschiedenen PEG-Diacrylat (PEGDA)-Konzentrationen zur Vernetzung von thiolmodifizierter HA (Glycosil, HASH) mittels Michael-Addition optimiert. Das Ziel war hierbei die Herstellung eines volumenstabilen Konstrukts, das gleichzeitig die größtmögliche Ablagerung von ECM erlaubt. Histologische und biochemische Analysen zeigten in Bezug darauf, dass eine Konzentration von 0,4% PEGDA die zuvor genannten Anforderungen am besten erfüllte (Abschnitt 5.1.2). Um im weiteren Verlauf den Einfluss von verschiedenen Cross-linkern auf die chondrogene Differenzierung von MSCs zu untersuchen, wurde die HA-SH vergleichend mit PEGTA (0,6%) und PEGDA (0,4%) vernetzt. Nachfolgend wurde acryliertes PG (PG-Acr) als eine Alternative zu acrylierten PEG-Derivaten evaluiert. Der Vorteil in der Verwendung von PG-Acr (0,6%) im Vergleich zu PEGTA (0,6%) liegt darin, dass es eine ca. fünfmal höhere Anzahl an funktionellen Gruppen bietet, was wiederum ein deutlich höheres Maß an biomimetischer Funktionalisierung ermöglicht. Hierbei zeigte die Untersuchung der knorpelspezifischen ECM-Bestandteile keine grundlegenden Unterschiede zwischen beiden Cross-linkern, wobei durch die Verwendung von PG-Acr eine gleichmäßigere Ablagerung von Knorpelmatrix in die entsprechenden Gele zu erkennen war. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Möglichkeiten für eine biomimetische Funktionalisierung durch die Verwendung von PG-Acr deutlich erhöht wurden, ohne dabei die Chondrogenese von MSCs negativ zu beeinträchtigen (Abschnitt 5.1.3). Der nächste Teil dieser Arbeit befasste sich mit der umfangreichen biomimetischen Funktionalisierung von mit PG-Acr (0,6%) vernetzten HA-SH Hydrogelen. Hierzu wurden entweder biomimetische Peptide oder ein chondrogener Wachstumsfaktor kovalent in das Hydrogel eingebunden. Interessanterweise führte weder das Einbringen des N-Cadherin-mimetischen (HAV), des Kollagen II-bindenden (KLER), noch des Zelladhäsions-vermittelnden (RGD) Peptids zu einer Verbesserung der chondrogenen Differenzierung der MSCs. Beispielsweise führte das kovalente Anbinden von 2,5mM HAV zu einer Veränderung der Zellkernmorphologie und einer Verringerung der Glykosaminoglykan (GAG)-Produktion, wohingegen das Einbringen von 1,0mM RGD die Kollagenproduktion hemmte. Diese Ergebnisse könnten möglicherweise darauf zurückzuführen sein, dass die hier verwendeten HA-SH-Hydrogele selbst bereits ausreichend effizient für die chondrogene Differenzierung von MSCs sind. Im Vergleich dazu wurden die vorherigen Studien, die positive Effekte von Peptiden nachweisen konnten, entweder in neutralen PEG-Hydrogelen oder in wesentlich festeren MeHA-Hydrogelen durchgeführt [99, 101, 160]. Daraus lässt sich folgern, dass die Verwendung von Peptiden gerade unter ungünstigen Bedingungen von Bedeutung sein könnte und ein neutrales Gelsystem für die Untersuchung von einzelnen Peptideffekten geeignet scheint (Abschnitt 5.2.1). Als nächstes wurde exemplarisch der chondrogene Wachstumsfaktor Transforming Growth Factor Beta 1 (TGF-b1) kovalent an PG-Acr angebunden. Durch die Verwendung von kovalent gebundenem TGF-b1 könnte somit die Notwendigkeit einer wiederholten Zugabe von TGF-b1 bei in vivo-Anwendungen vermieden werden, was wiederum bei einer potentiellen klinischen Anwendung von Vorteil sein könnte. Deshalb wurde der Einfluss von kovalent gebundenem TGF-b1 auf die Chondrogenese von MSCs mit der gleichen Menge ungebundenem TGF-b1 (100nM TGF-b1) verglichen. Hierbei wurde ein signifikant positiver, dosisabhängiger Effekt von kovalent gebundenem TGF-b1 erfolgreich nachgewiesen. Die Chondrogenese von MSCs in Hydrogelen mit kovalent gebundenem TGF-b1 war dabei der Chondrogenese von MSCs in Hydrogelen, in die TGF-b1 lediglich gemischt wurde, deutlich überlegen. Dies wurde anhand von stärkeren Färbungen für GAGs, Gesamtkollagen, Aggrecan und Kollagen II in den TGF-b1-modifizierten Gelen gezeigt. Darüber hinaus bestätigten sowohl biochemische Analysen des GAG- und Kollagengehalts, als auch Western Blot-Analysen die histologischen Daten. Zusätzlich wurde der positive Effekt von kovalent gebundenem TGF-b1 durch erhöhte Expressionsraten der chondrogenen Markergene COL2A1, ACAN und SOX9 nachgewiesen. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass durch die kovalente Bindung des Wachstumsfaktors TGF-b1 ein signifikant positiver Effekt auf die chondrogene Differenzierung von MSCs entsteht (Abschnitt 5.2.2). Generell stellen die auf Basis von Michael-Addition hergestellten PG-Acr-HA-SH-Hydrogele aufgrund ihrer hohen Acrylat-Funktionalität eine vielseitige Hydrogelplattform dar. So bieten diese Hydrogele zahlreiche Möglichkeiten für das Einbringen von verschiedensten biologischen Modifikationen wie die kovalente Bindung von biomimetischen Peptiden zusammen mit Wachstumsfaktoren in ein und demselben Zellträger. Anhand eines Proof-of-principle-Experiments wurde die generelle Eignung von reinen PG-Hydrogelen für die Evaluation von einzelnen Peptideffekten demonstriert. Dazu wurden die Hydrogele unter Verwendung der Thiol-ene-click-Reaktion hergestellt. In diesem Hydrogelsystem, ohne den unterstützenden Effekt von HA, zeigten MSCs eine verstärkte chondrogene Differenzierung in Anwesenheit von 1,0mM HAV. Diese ließ sich anhand von stärkeren Färbungen für GAGs, Aggrecan und Kollagen II nachweisen. Außerdem waren die GAG- und Gesamtkollagen-Werte deutlich erhöht. Hiermit wurde gezeigt, dass sich die vielseitig modifizierbaren, reinen PG-Hydrogele für die Analyse von Peptideffekten und deren Interaktion mit Wachstumsfaktoren eignen (Abschnitt 5.3). Der letzte Teil dieser Arbeit wurde im Rahmen des EU-Projektes HydroZONES durchgeführt, welches an der Entwicklung und Herstellung von zonalen Konstrukten arbeitet. Der Aspekt der zonalen Organisation von Knorpel rückte in den letzten Jahren verstärkt in den Fokus [127, 128], jedoch findet er im Bereich des Tissue Engineering noch immer wenig Beachtung. Deshalb wurde im Folgenden die zonale Verteilung von Zellen innerhalb eines Zellträgers realisiert. Dazu wurden zwei unterschiedlich zusammengesetzte Hydrogele mithilfe der Thiol-ene-click-Reaktion hergestellt: eine aus HA-SH(FMZ) bestehende untere Lage und eine darauf liegende Lage aus reinem PG. Hierbei gelang es stabile, zonale Konstrukte herzustellen, in denen MSCs in beiden Zonen chondrogen differenzierten, was anhand von GAG- und Kollagen II-Färbungen, sowie durch die Quantifizierung des GAG-Gehalts bestätigt wurde. Hiermit konnte ein aus zwei verschiedenen Hydrogelen zusammengesetztes zonales Konstrukt erfolgreich hergestellt werden (Abschnitt 5.4). Durch den erstmaligen Einsatz des multifunktionalen Cross-linkers PG-Acr für das Tissue Engineering von Knorpel wurde ein auf Michael-Addition basierendes, vielseitiges HA-SH-Hydrogelsystem etabliert. Das hier vorgestellte Hydrogelsystem besitzt das Potenzial zukünftig als eine einfach anwendbare und vielseitige Toolbox zur Herstellung von biomimetischen Hydrogelen für die zellbasierte Knorpelregeneration verwendet zu werden. Vor allem könnte dabei der Einsatz von Stützstrukturen von entscheidender Bedeutung sein, um die mechanische Widerstandskraft der Zellträger zu erhöhen und somit das Potenzial für klinische Anwendungen zu vergrößern. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Thiol-ene-click-Hydrogele sowohl zur Herstellung von zellbeladenen, reinen PG-Gelen, als auch zur Herstellung von deutlich komplexeren, zonalen Konstrukten geeignet sind. Diese Thiol-ene-click-Hydrogele wurden bereits erfolgreich weiterentwickelt und für 3D-Bioprinting-Prozesse verwendet [204]. 3D-Bioprinting ist eine Teildisziplin des sich immer weiter entwickelnden Feldes der Biofabrikation [205]. Die Verwendung in diesem Bereich verändert zwar die Anforderungen an die hierfür verwendeten Hydrogele, ermöglicht es aber gleichzeitig deutlich komplexere sowie hierarchische Strukturen herzustellen und kleinere Lagen noch exakter zu positionieren [159, 206–209]. Da in den hier vorgestellten Thiol-ene-click-Hydrogelen eine deutliche chondrogene Differenzierung von MSCs nachgewiesen wurde, ist es vorstellbar, dass sie als Basis für die Herstellung sogenannter Bioinks dienen, welche in zukünftigen, anspruchsvollen Biofabrikationsprozessen Anwendung finden sollen.

In this work, the synthesis of biopolymer-based hydrogel networks with defined architecture is presented. In order to obtain materials with defined properties, the chemoselective copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (or Click Chemistry) was used for the synthesis of gelatin-based hydrogels. Alkyne-functionalized gelatin was reacted with four different diazide crosslinkers above its sol-gel transition to suppress the formation of triple helices. By variation of the crosslinking density and the crosslinker flexibility, the swelling (Q: 150-470 vol.-%;) and the Young’s and shear moduli (E: 50 kPa - 635 kPa, G’: 0.1 kPa - 16 kPa) could be tuned in the kPa range. In order to understand the network structure, a method based on the labelling of free functional groups within the hydrogel was developed. Gelatin-based hydrogels were incubated with alkyne-functionalized fluorescein to detect the free azide groups, resulting from the formation of dangling chains. Gelatin hydrogels were also incubated with azido-functionalized fluorescein to check the presence of alkyne groups available for the attachment of bioactive molecules. By using confocal laser scanning microscopy and fluorescence spectroscopy, the amount of crosslinking, grafting and free alkyne groups could be determined. Dangling chains were observed in samples prepared by using an excess of crosslinker and also when using equimolar amounts of alkyne:azide. In the latter case the amount of dangling chains was affected by the crosslinker structure. Specifically, 0.1% of dangling chains were found using 4,4’-diazido-2,2’-stilbene-disulfonic acid as cosslinker, 0.06% with 1,8-diazidooctane, 0.05% with 1,12-diazidododecane and 0.022 % with PEG-diazide. This observation could be explained considering the structure of the crosslinkers. During network formation, the movements of the gelatin chains are restricted due to the formation of covalent netpoints. A further crosslinking will be possible only in the case of crosslinker that are flexible and long enough to reach another chain. The method used to obtain defined gelatin-based hydrogels enabled also the synthesis of hyaluronic acid-based hydrogels with tailorable properties. Alkyne-functionalized hyaluronic acid was crosslinked with three different linkers having two terminal azide functionalities. By variation of the crosslinking density and crosslinker type, hydrogels with elastic moduli in the range of 0.5-3 kPa have been prepared. The variation of the crosslinking density and crosslinker type had furthermore an influence also on the hydrolytic and enzymatic degradation of gelatin-based hydrogels. Hydrogels with a low crosslinker amount experienced a faster decrease in mass loss and elastic modulus compared to hydrogels with higher crosslinker content. Moreover, the structure of the crosslinker had a strong influence on the enzymatic degradation. Hydrogels containing a crosslinker with a rigid structure were much more resistant to enzymatic degradation than hydrogels containing a flexible crosslinker. During hydrolytic degradation, the hydrogel became softer while maintaining the same outer dimensions. These observations are in agreement with a bulk degradation mechanism, while the decrease in size of the hydrogels during enzymatic degradation suggested a surface erosion mechanism. Because of the use of small amount of crosslinker (0.002 mol.% 0.02 mol.%) the networks synthesized can still be defined as biopolymer-based hydrogels. However, they contain a small percentage of synthetic residues. Alternatively, a possible method to obtain biopolymer-based telechelics, which could be used as crosslinkers, was investigated. Gelatin-based fragments with defined molecular weight were obtained by controlled degradation of gelatin with hydroxylamine, due to its specific action on asparaginyl-glycine bonds. The reaction of gelatin with hydroxylamine resulted in fragments with molecular weights of 15, 25, 37, and 50 kDa (determined by SDS-PAGE) independently of the reaction time and conditions. Each of these fragments could be potentially used for the synthesis of hydrogels in which all components are biopolymer-based materials. / In dieser Arbeit wird die Synthese Biopolymer-basierter Hydrogelnetzwerke mit definierter Architektur beschrieben. Um Materialien mit definierten und einstellbaren Eigenschaften zu erhalten, wurde die chemoselektive Kupferkatalysierte Azid-Alkin-Cycloadditionsreaktion (auch als Click-Chemie bezeichnet) für die Synthese Gelatine-basierter Netzwerke eingesetzt. Alkin-funktionalisierte Gelatine wurde mit vier verschiedenen Diazid-Quervernetzern oberhalb der Gel-Sol-Übergangstemperatur umgesetzt, um die Formierung tripelhelikaler Bereiche durch Gelatineketten zu unterdrücken. Durch Variation der Menge an Quervernetzer (und damit der Netzdichte) sowie der Länge und Flexibilität der Quervernetzer konnten u.a. die Quellung (Q: 150-470 vol.-%) sowie der Young’s - und Schermodul im kPa Bereich eingestellt werden (E: 50 kPa - 635 kPa, G’: 0.1 kPa - 16 kPa). Um die Netzwerkarchitektur zu verstehen, wurde eine Methode basierend auf dem Labeln unreagierter Azid- und Alkingruppen im Hydrogel entwickelt. Die Gelatine-basierten Hydrogele wurden mit Alkin-funktionalisiertem Fluorescein umgesetzt, um freie Azidgruppen zu detektieren, die bei einem Grafting entstehen. Darüber hinaus wurden die Hydrogele mit Azid-funktionalisiertem Fluorescein reagiert, um die Menge an freien Alkingruppen zu bestimmen, die zudem potentiell für die Anbindung bioaktiver Moleküle geeignet sind. Quervernetzung, Grafting, und die Anzahl freier Alkingruppen konnten dann mit Hilfe der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie und der Fluoreszenzmikroskopie qualitativ und quantitativ nachgewiesen werden. Gegraftete Ketten wurden in Systemen nachgewiesen, die mit einem Überschuss an Quervernetzer hergestellt wurden, entstanden aber auch beim Einsatz äquimolarer Mengen Alkin- und Azidgruppen. Im letzteren Fall wurde in Abhängigkeit von der Struktur des Diazids unterschiedliche Anteile gegrafteter Ketten festgestellt. 0.1 mol-% von gegrafteten Ketten wurden für 4,4’-Diazido-2,2’-stilbendisulfonsäure gefunden, 0.06 mol-% für 1,8-Diazidooktan, 0.05 mol% für 1,12-diazidododecan und 0.022 mol-% für PEG-Diazid. Diese Beobachtung kann durch die unterschiedliche Flexibilität der Vernetzer erklärt werden. Während der Netzwerkbildung werden die Bewegungen der Gelatineketten eingeschränkt, so dass kovalente Netzpunkte nur erhalten werden können, wenn der Vernetzer lang und flexibel genug ist, um eine andere Alkingruppe zu erreichen. Die Strategie zur Synthese von Biopolymer-basierten Hydrogelen mit einstellbaren Eigenschaften wurde von Gelatine- auf Hyaluronsäure-basierte Gele übertragen. Alkin-funktionalisierte Hyaluronäure wurde mit drei verschiedenen Diaziden quervernetzt, wobei Menge, Länge, und Flexibilität des Quervernetzers variiert wurden. In dieser Weise wurden sehr weiche Hydrogele mit E-Moduli im Bereich von 0.5-3 kPa hergestellt. Die Variation der Vernetzungsdichte und des Vernetzertyps beeinflusste weiterhin den hydrolytischen und enzymatischen Abbau der Hydrogele. Hydrogele mit einem geringerem Anteil an Quervernetzer wurden schneller abgebaut als solche mit einem höheren Quervernetzeranteil. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Hydrogele mit Quervernetzern mit einer rigiden Struktur deutlich langsamer degradierten als Hydrogele mit flexibleren Quervernetzern. Während des hydrolytischen Abbau wurden die Materialien weicher, behielten aber ihre Form bei, was mit einem Bulk-Abbau-Modell übereinstimmt. Während des enzymatischen Abbaus hingegen änderten sich die Materialeigenschaften kaum, jedoch wurden die Proben kleiner. Diese Beobachtung stimmt mit einem Oberflächenabbaumechanismus überein. Da in allen vorgestellten Systemen nur eine kleine Menge synthetischer Vernetzer eingesetzt wurde (0.002 – 0.02 mol%), können die Materialien noch als Biopolymer-basierte Materialien klassifiziert werden. Jedoch enthalten die Materialien synthetische Abschnitte. In Zukunft könnte es interessant sein, einen Zugang zu Materialien zu haben, die ausschließlich aus Biopolymeren aufgebaut sind. Daher wurde der Zugang zu Biopolymer basierten Telechelen untersucht, die potentiell als Vernetzer dienen können. Dazu wurden durch die kontrollierte Spaltung von Gelatine mit Hydroxylamin Gelatinefragmente mit definiertem Molekulargewicht hergestellt. Hydroxalamin reagiert unter Spaltung mit der Amidbindung zwischen Asparagin und Glycin, wobei Aspartylhydroxamate und Aminoendgruppen entstehen. Die Reaktion von Gelatine mit Hydroxylamin ergab Fragmente mit Molekulargewichten von 15, 25, 37, und 50 kDa (bestimmt mit SDS-PAGE), und die Formierung dieser Fragmente war unabhängig von den weiteren Reaktionsbedingungen und der Reaktionszeit. Jedes dieser Fragmente kann potentiell für die Synthese von Hydrogelen eingesetzt werden, die ausschließlich aus Biopolymeren bestehen.

Das Basalzellkarzinom (BZK) der Haut gilt als einer der häufigsten semimalignen Tumoren. Trotz der niedrigen Metastasierungsrate von < 0,1 % können BZK schwerwiegende Infiltrationen und Destruktionen knorpeliger sowie knöcherner Strukturen verursachen. Für die Tumorentstehung ist vor allem die kumulative UVB-Dosis in Kindheit und Adoleszenz bedeutsam. Aber auch die Embryonalentwicklung scheint eine Rolle in der Pathogenese von Tumoren zu spielen. Die so genannte embryonale Fusionszone (eFZ) entsteht zwischen der 5-10 Entwicklungswoche durch die Verschmelzung der fünf Gesichtswülste. Es konnte gezeigt werden, dass BZK innerhalb dieses Kompartiments nicht nur gehäuft auftreten sondern auch durch ein ausgeprägtes Tiefenwachstum charakterisiert sind. Als mögliche Ursache für das verstärkt invasive Wachstum von BZK innerhalb der eFZ wurden Änderungen im Hyaluronsäure (HA)-Stoffwechsel der Stromazellen angenommen. Neben der Bedeutung in der Embryonalentwicklung und bei der Geweberegeneration zeigten verschiedene Studien zudem die essentielle Rolle von HA im Rahmen von malignen Zelltransformationen. Vermehrte HA-Ablagerungen in der Tumorumgebung oder erhöhte HA-Serumkonzentrationen wurden bei einer Vielzahl von Tumoren als Zeichen einer fortschreitenden Tumorprogression beschrieben. Um den HA-Stoffwechsel von Stromafibroblasten um BZK gezielt zu untersuchen, wurden der HA-Gehalt, die HA-Größe und die exprimierten Enzyme des HA-Stoffwechsels in Abhängigkeit von ihrer Lokalisationen miteinander verglichen. Dabei zeigte sich, dass sowohl innerhalb als auch außerhalb der eFZ vergleichbare Mengen und Polymergrößen von HA sezerniert werden. Molekularbiologische Untersuchungen an expandierten Fibroblasten aus Biopsien verschiedener Lokalisationen zeigten ebenfalls keine Unterschiede in der Expression von mRNA der HA Stoffwechselenzyme nach Herkunft der Fibroblasten. Somit wird geschlussfolgert, dass HA zwar auch im Stroma von BZK gebildet wird, der HA-Stoffwechsel von Stromafibroblasten jedoch kein Merkmal ist, das mit dem vermehrten Auftreten und invasiven Wachstum von BZK im Bereich der embryonalen Fusionszone des Mittelgesichts korreliert.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist eine erste Bewertung eines neu entwickelten Cryogels auf Basis von acrylierter Hyaluronsäure für den Einsatz als künstliche Extrazellulärmatrix (ECM) zur Unterstützung des Wundheilungsprozesses. Zu diesem Zweck wurden die Cryogele bis zu einer Dauer von 4 Wochen mit Fibroblasten, die neben Keratinozyten, Endothel- und Immunzellen eine besondere Rolle für den Wundverschluss spielen, kultiviert. Dadurch konnten grundlegende Erkenntnisse hinsichtlich der Proliferation, Migration und Matrixsynthese gewonnen werden Ein maßgeblicher Bestandteil war dabei auch die Untersuchung der Genexpression von Kollagen-1 (coll-1), Hyaluronsynthase-2 (HAS-2) und Matrixmetalloproteinase-1(MMP-1) nach Stimulation mit den wundheilungsassoziierten Zytokinen Transforming Growth Factor β (TGF-β ) und Platelet Derived Growth Factor BB (PDGF-BB). Die Produkte der drei Gene spielen für den Wundheilungsprozess eine entscheidende Rolle, da sie wesentlich am Auf- und Umbau der ECM beteiligt sind. Zudem wurden in der Versuchsplanung die Auswirkungen auf Morphologie und Funktion der Fibroblasten bei 3-dimensionaler Kultur im Vergleich zur 2-dimensionalen Monolayerkultur berücksichtigt. Um eine bestmögliche Vergleichbarkeit zu erreichen, wurde aus diesem Grund ein 3-dimensionales Kollagengel als Kontrollmodell genutzt. Die Ergebnisse spiegeln ein physiologisches Verhalten von Fibroblasten bei Kultur in den Cryogelen wider. Die Zellen adhärieren an der Gelstruktur, proliferieren und verteilen sich im Cryogel, indem sie in die Tiefe wandern. In den mikroskopischen und makroskopischen Färbungen zeigt sich eine kontrollierte Neusynthese von ECM. Die Applikation von TGF-β und PDGF-BB führt zu einer adäquaten Reaktion der Fibroblasten und einer Regulation des Matrixstoffwechsels. Die Ergebnisse sind mit denen aus einem 3-dimensionalen Kollagengelmodell vergleichbar und stimmen im Wesentlichen mit der Literatur zur Wirkung der beiden Zytokine auf Monolayerkulturen von Fibroblasten überein. Messungen zeigen eine leichte Zunahme der Porengröße der Cryogele im zeitlichen Verlauf, was möglicherweise auf einen Abbau durch die Fibroblasten hindeutet. Die Stabilität der Gele wird dadurch jedoch nicht merklich beeinflusst. Durch ihre Zusammensetzung und grundlegende Struktur sowie den damit verbundenen Eigenschaften ergeben sich Anwendungsmöglichkeiten sowohl im klinisch-therapeutischen Bereich als auch in der Forschung.:Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Physiologische Wundheilung 1.2. Phasen der Wundheilung 1.2.1. Exsudative Phase 1.2.2. Resorptive Phase 1.2.3. Proliferationsphase 1.2.4. Reparation/Regeneration 1.3. Rolle der Fibroblasten während der Wundheilung 1.4. Einfluss ausgewählter Zytokine auf die Wundheilung 1.5. Rolle der ECM während der Wundheilung 1.5.1. Kollagen 1.5.2. Hyaluronsäure und Hyaluronsynthasen 1.5.3. Matrixmetalloproteinasen 1.6. Probleme bei der Wundheilung und Folgen komplizierter Wunden 1.6.1. Die Brandverletzung - ein Sonderfall der akuten Wunde 1.6.2. Chronische Wunden 1.6.3. Folgen von Wunden und pathologischer Narbenbildung 1.7 Funktionelle Biomaterialien 1.8. Fragestellung und Ziele der Arbeit 2. Materialien 2.1. Nährmedien und Zusätze 2.2. Antikörper, Enzyme und Wachstumsfaktoren 2.3. Chemikalien und andere Substanzen 2.4. Verbrauchsmaterialien 2.5. Geräte 3. Methoden 3.1. Methoden der Zellkultivierung 3.1.1. Isolierung humaner Fibroblasten aus Haut 3.1.2. Dispaseverdau 3.1.3. Kollagenaseverdau 3.1.4. Passagieren der Zellen 3.1.5. Bestimmung der Zellzahl 3.1.6. Aussäen und Kultivierung von Fibroblasten auf Cryogelen aus acrylierter Hyaluronsäure 3.1.7. Aussäen und Kultivierung von Fibroblasten in Gelen aus Kollagen Typ I 3.1.8. Aussäen und Kultivierung von Fibroblasten auf einer Kollagenbeschichtung für die XTT-Messung 3.2. Molekularbiologische Methoden 3.2.1. Isolation der RNA aus Fibroblasten in den Cryogelen aus acrylierter Hyaluronsäure 3.2.2. Isolation der RNA aus Fibroblasten im Kollagengel 3.2.3. Reverse Transkription in cDNA 3.2.4. Die quantitative Real-Time-Polymerasekettenreaktion 3.2.5. XTT-Assay zum Nachweis von Proliferation und metabolischer Aktivität 3.3. Histologische Methoden 3.3.1. Anfertigen von Paraffinschnitten 3.3.2. Färbemethoden der Paraffinschnitte 3.3.3. Immunhistochemie PCNA 3.4. Auswertung der Paraffinschnitte 3.5. Färbung von Gelen mit Siriusrot 3.6. Statistische Auswertung 4. Ergebnisse 4.1. Eigenschaften der Gele 4.2. Histologische Auswertung 4.2.1. Fibroblasten lassen sich im HA-Gel kultivieren 4.2.2. Fibroblasten proliferieren im HA-Gel 4.2.3. Fibroblasten bilden Kollagen und lagern dieses im Gel ein 4.2.4. Messung der Porengröße 4.3. Untersuchung der Stoffwechselaktivität und Proliferation 4.4. Analyse der Genexpression der Fibroblasten nach Stimulation mit TGF-β und PDGF-BB 4.4.1. Untersuchung der Genexpression von Kollagen Typ I 4.4.2. Untersuchung der Genexpression von HAS-2 4.4.3. Untersuchung der Genexpression von MMP-1 4.5. Zusammenfassung der Ergebnisse 5. Diskussion 5.1. Epidemiologie dermaler Verletzungen und die Notwendigkeit neuer Therapien 5.2. Interaktionen der Zellen mit ihrer Umgebung - die Rolle der Kulturbedingungen 5.3. Cryogele aus Hyaluronsäure – ein geeignetes Substrat für die in vitro Kultur von Fibroblasten 5.4. Der Einfluss von TGF-β 1 und PDGF-BB auf den Matrixstoffwechsel der Fibroblasten 5.5. Mögliche Anwendungs- und Entwicklungsmöglichkeiten für Cryogele aus Hyaluronsäure 5.6. Klinische Relevanz der Cryogele in Anlehnung an die derzeitig gültigen Leitlinien 5.7. Fazit Zusammenfassung der Arbeit Literaturverzeichnis Anlagen Histologische Bilder der Alcianblau-HE-Färbung Eigenständigkeitserklärung Lebenslauf Danksagung / Die erhobenen Ergebnisse dieser Dissertation zeigen, dass die Zusammensetzung, Struk-tur und damit verbundenen grundlegenden Eigenschaften die Cryogele zu einem geeig-neten Substrat für die 3-dimensionale in vitro Kultur von Fibroblastenmachen. Aus der Literatur ist bekannt, dass eine Besiedelung ähnlich gearteter Hydrogele auch mit anderen Zelltypen möglich ist. Daraus ergeben sich Optionen sowohl für die Anwendung im klinisch-therapeutischen Bereich als auch in der Forschung. Die statistischen Daten verdeutlichen den Innovati-onsbedarf für die Therapie chronischer Wunden und für Alternativen zu Voll-und Spalt-hauttransplantaten bei der Behandlung großflächiger Brandverletzungen. Um für die Be-handlung beider Wundentitäten in Betracht zu kommen, müssen Materialien zur Wund-versorgung den Anforderungen der aktuellen Therapieleitlinien gerecht werden. Aufgrund des natürlichen Vorkommens von Hyaluronsäure im dermalen Gewebe und der Möglichkeit dem körpereigenen Um-und Abbau unterworfen werden zu können, haben die Cryogele entscheidende Vorteile gegenüber bereits zugelassener Materialien, die syn-thetischen oder tierischen Ursprungs sind und nicht selten Allergien oder Fremdkörper-reaktionen hervorrufen. Weitere Eigenschaften der Cryogele lassen vermuten, dass sie mit Hilfe einiger Modifikationen den Kriterien der Leitlinien entsprechen könnten. Die 2-dimensionale Monolayerzellkultur stößt als Forschungsmedium immer dann an ihre Grenzen, wenn die erhobenen Ergebnisse nicht auf die Verhältnisse in vivo übertrag-bar sind. 3-dimensionale Zell-Zell-und Zell-Matrixkontakte sind die Grundlage für eine korrekte Zellfunktion, weswegen die Forderung nach einer Matrix für den Einsatz in der Zellforschung, die die physiologischen Verhältnisse so gut wie möglich abbilden kann, immer präsenter wird. Die Besiedlung der Cryogele aus Hyaluronsäure und anschlie-ßende Untersuchung mit unterschiedlichen Methoden erwies sichim Wesentlichen als unkompliziert. Darüber hinaus zeigten die ausgesäten Fibroblasten eine adäquates Wachstums-und Matrixsyntheseverhalten, weswegen eine Nutzung zu Forschungszwe-cken denkbar erscheint. Die gewonnen Erkenntnisse sowie die in der Diskussion behandelte Literatur und aufgezeigten Möglichkeiten zur Weiterentwicklung der Cryo-gele bilden die Basis für die Planung weiterer und richtungsspezifischerer Untersuchungen.:Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Physiologische Wundheilung 1.2. Phasen der Wundheilung 1.2.1. Exsudative Phase 1.2.2. Resorptive Phase 1.2.3. Proliferationsphase 1.2.4. Reparation/Regeneration 1.3. Rolle der Fibroblasten während der Wundheilung 1.4. Einfluss ausgewählter Zytokine auf die Wundheilung 1.5. Rolle der ECM während der Wundheilung 1.5.1. Kollagen 1.5.2. Hyaluronsäure und Hyaluronsynthasen 1.5.3. Matrixmetalloproteinasen 1.6. Probleme bei der Wundheilung und Folgen komplizierter Wunden 1.6.1. Die Brandverletzung - ein Sonderfall der akuten Wunde 1.6.2. Chronische Wunden 1.6.3. Folgen von Wunden und pathologischer Narbenbildung 1.7 Funktionelle Biomaterialien 1.8. Fragestellung und Ziele der Arbeit 2. Materialien 2.1. Nährmedien und Zusätze 2.2. Antikörper, Enzyme und Wachstumsfaktoren 2.3. Chemikalien und andere Substanzen 2.4. Verbrauchsmaterialien 2.5. Geräte 3. Methoden 3.1. Methoden der Zellkultivierung 3.1.1. Isolierung humaner Fibroblasten aus Haut 3.1.2. Dispaseverdau 3.1.3. Kollagenaseverdau 3.1.4. Passagieren der Zellen 3.1.5. Bestimmung der Zellzahl 3.1.6. Aussäen und Kultivierung von Fibroblasten auf Cryogelen aus acrylierter Hyaluronsäure 3.1.7. Aussäen und Kultivierung von Fibroblasten in Gelen aus Kollagen Typ I 3.1.8. Aussäen und Kultivierung von Fibroblasten auf einer Kollagenbeschichtung für die XTT-Messung 3.2. Molekularbiologische Methoden 3.2.1. Isolation der RNA aus Fibroblasten in den Cryogelen aus acrylierter Hyaluronsäure 3.2.2. Isolation der RNA aus Fibroblasten im Kollagengel 3.2.3. Reverse Transkription in cDNA 3.2.4. Die quantitative Real-Time-Polymerasekettenreaktion 3.2.5. XTT-Assay zum Nachweis von Proliferation und metabolischer Aktivität 3.3. Histologische Methoden 3.3.1. Anfertigen von Paraffinschnitten 3.3.2. Färbemethoden der Paraffinschnitte 3.3.3. Immunhistochemie PCNA 3.4. Auswertung der Paraffinschnitte 3.5. Färbung von Gelen mit Siriusrot 3.6. Statistische Auswertung 4. Ergebnisse 4.1. Eigenschaften der Gele 4.2. Histologische Auswertung 4.2.1. Fibroblasten lassen sich im HA-Gel kultivieren 4.2.2. Fibroblasten proliferieren im HA-Gel 4.2.3. Fibroblasten bilden Kollagen und lagern dieses im Gel ein 4.2.4. Messung der Porengröße 4.3. Untersuchung der Stoffwechselaktivität und Proliferation 4.4. Analyse der Genexpression der Fibroblasten nach Stimulation mit TGF-β und PDGF-BB 4.4.1. Untersuchung der Genexpression von Kollagen Typ I 4.4.2. Untersuchung der Genexpression von HAS-2 4.4.3. Untersuchung der Genexpression von MMP-1 4.5. Zusammenfassung der Ergebnisse 5. Diskussion 5.1. Epidemiologie dermaler Verletzungen und die Notwendigkeit neuer Therapien 5.2. Interaktionen der Zellen mit ihrer Umgebung - die Rolle der Kulturbedingungen 5.3. Cryogele aus Hyaluronsäure – ein geeignetes Substrat für die in vitro Kultur von Fibroblasten 5.4. Der Einfluss von TGF-β 1 und PDGF-BB auf den Matrixstoffwechsel der Fibroblasten 5.5. Mögliche Anwendungs- und Entwicklungsmöglichkeiten für Cryogele aus Hyaluronsäure 5.6. Klinische Relevanz der Cryogele in Anlehnung an die derzeitig gültigen Leitlinien 5.7. Fazit Zusammenfassung der Arbeit Literaturverzeichnis Anlagen Histologische Bilder der Alcianblau-HE-Färbung Eigenständigkeitserklärung Lebenslauf Danksagung

Articular cartilage is a highly specialized tissue which provides a lubricated gliding surface in joints and thereby enables low-friction movement. If damaged once it has a very low intrinsic healing capacity and there is still no treatment in the clinic which can restore healthy cartilage tissue. 3D biofabrication presents a promising perspective in the field by combining healthy cells and bioactive ink materials. Thereby, the composition of the applied bioink is crucial for defect restoration, as it needs to have the physical properties for the fabrication process and also suitable chemical cues to provide a supportive environment for embedded cells. In the last years, ink compositions with high polymer contents and crosslink densities were frequently used to provide 3D printability and construct stability. But these dense polymeric networks were often associated with restricted bioactivity and impaired cell processes like differentiation and the distribution of newly produced extracellular matrix (ECM), which is especially important in the field of cartilage engineering. Therefore, the aim of this thesis was the development of hyaluronic acid (HA)-based bioinks with a reduced polymer content which are 3D printable and additionally facilitate chondrogenic differentiation of mesenchymal stromal cells (MSCs) and the homogeneous distribution of newly produced ECM. Starting from not-printable hydrogels with high polymer contents and restricted bioactivity, distinct stepwise improvements were achieved regarding stand-alone 3D printability as well as MSC differentiation and homogeneous ECM distribution. All newly developed inks in this thesis made a valuable contribution in the field of cartilage regeneration and represent promising approaches for potential clinical applications. The underlying mechanisms and established ink design criteria can further be applied to other biofabricated tissues, emphasizing their importance also in a more general research setting. / Gelenkknorpel ermöglicht durch seine gleitfähige Oberfläche reibungsarme Bewegungen der Gelenke. Ist der Knorpel jedoch einmal geschädigt, kann er sich kaum selbst regenerieren und es gibt noch keine klinische Lösung, die das native Gewebe wiederherstellen kann. Ein vielversprechender Ansatz im Feld ist die 3D Biofabrikation, da sie gesunde Zellen mit bioaktiven Tintenmaterialen kombiniert. Hierbei ist die Zusammensetzung der Tinte besonders wichtig für die Funktionsweise des Konstruktes, da sie sowohl die physikalischen Voraussetzungen für den 3D Druck als auch die biologische Unterstützung für die Zellkultivierung mitbringen muss. Bisher wurden häufig Tintenzusammensetzungen mit hohen Polymergehalten und Vernetzungsdichten verwendet, um 3D-Druckbarkeit und Konstruktstabilität zu gewährleisten. Das verursachte jedoch häufig eine eingeschränkte Bioaktivität und die Beeinträchtigung von Zellprozessen wie Differenzierung und der Verteilung der neu gebildeten Extrazellulärmatrix (ECM), die insbesondere in der Knorpelregeneration von großer Bedeutung ist. Daher war das Ziel dieser Arbeit 3D-druckbare Tinten auf Hyaluronsäure (HA)-Basis mit reduziertem Polymergehalt zu entwickeln, die die chondrogene Differenzierung von mesenchymalen Stromazellen (MSCs) unterstützen und eine homogene Verteilung der neu produzierten ECM ermöglichen. Ausgehend von nicht-druckbaren Hydrogelen mit hohem Polymergehalt und eingeschränkter Bioaktivität wurde eine schrittweise Verbesserung hinsichtlich 3D-Druckbarkeit, MSC-Differenzierung und homogener ECM-Verteilung erreicht. Alle hier neu entwickelten Tinten leisten einen wertvollen Beitrag auf dem Gebiet der Knorpelregeneration mit Potenzial zur klinischen Anwendung. Die zugrunde liegenden Mechanismen und etablierten Designkriterien können weiterhin auch auf andere biofabrizierte Gewebe übertragen werden, was ihre Bedeutung auch für ein weiter gefasstes Forschungsfeld unterstreicht.