Type II secretion system (T2SS) is one of the secretion systems found in gram-negative bacteria that provides transport of some bacterial proteins across the outer membrane. The passage through the membrane is mediated by a pore assembled from subunits called GspD or secretin. Together with three other components of T2SS, GspD was discovered in the genome of several protists including Naegleria gruberi, Andalucia godoyi, Reclinomonas americana, Neovahlkampfia damariscottae or in s species of genus Malawimonas. Previously it was found out that these proteins localize into the mitochondria. If found functional and with analogous topology to the bacterial system, the eukaryotic T2SS would represent unique mitochondrial protein export system. Secretin is essential subunit of T2SS which is not only the passive membrane channel, but also participates in the recognition of the substrate. Therefore, the research of the eukaryotic secretin could bring a valuable knowledge about the function of the mitochondrial T2SS. The experimental part of this thesis tries to characterize the eukaryotic secretin and it focuses on (i) the assembly of the secretin channel, in both, the bacteria and in the artificial membranes, (ii) the interactions of GspD with the other subunits of T2SS and (iii) the mechanism of import...

Le système de sécrétion de type II (T2SS) assure le transport de protéines sous une forme repliée du périplasme dans le milieu extracellulaire. Ce système est largement exploité par les bactéries à Gram négatif pathogènes des plantes, des animaux et de l'homme où il permet la sécrétion de facteurs de virulence (des toxines et des enzymes lytiques). La bactérie phytopathogène Dickeya dadantii utilise le T2SS appelé Out, pour sécréter une douzaine de pectinases qui dégradent les parois des cellules végétales. Les protéines sécrétées par le T2SS n'ont pas de motif de sécrétion apparent et leur sécrétion implique plusieurs interactions transitoires avec les composants du système. La nature moléculaire de ces interactions n'est pas connue. Afin de capter ces interactions transitoires lors du processus de sécrétion, j'ai utilisé le pontage dirigé in vivo. Cette technique repose sur l'incorporation d'un analogue photoréactif d'un acide aminé (le para-benzoyl Lphénylalanine, pBpa) à la place des résidus soupçonnés de faire partie d'un site d'interaction. Le pontage est ensuite activé par une courte exposition des cellules aux UV ce qui permet la formation des complexes protéiques. Tout d'abord, cette technique a été utilisée pour introduire le pBpa dans plusieurs régions exposées à la surface d'une exoprotéine, PelI. Cette stratégie a permis de mettre en évidence qu'un élément structural, la boucle 3 du domaine Fn3 de PelI, est impliquée dans l'interaction avec la sécrétine OutD, le composant du T2SS situé dans la membrane externe, et avec le domaine PDZ d'OutC, un composant de la membrane interne. Ces résultats suggèrent que la boucle 3 fait partie d'un motif de sécrétion. Deux autres régions ont été identifiées au sein de PelI : le linker entre les deux domaines de PelI qui est impliqué dans l'interaction avec OutD et une région exposée du domaine catalytique qui interagit avec la protéine OutC. La même approche a été utilisée pour introduire le pBpa dans les deux composants du T2SS, OutC et OutD. Ces expériences ont suggéré que le domaine PDZ d'OutC interagit avec une autre exoprotéine, PelB. Cette étude, de façon complémentaire à d'autres approches, nous a permis de démontrer certains détails moléculaires essentiels de la sécrétion par le T2SS / The type II secretion system (T2SS) transports folded proteins from the periplasm through the outer membrane into the milieu. In many pathogenic Gram-negative bacteria, the T2SS secretes various virulence factors in host tissue and is directly involved in pathogenesis. The phytopathogen Dickeya dadantii secretes a dozen of pectinases through a T2SS named Out. The secreted proteins are lacking an obvious common signal and secretion is thought to involve multiple transient interactions of folded exoproteins with several T2SS components. Molecular nature of these interactions remains unknown. To address this question we used an in vivo sitespecific photo-crosslinking approach to capture such transient interactions within the functional T2SS of D. dadantii. In this technique, the photo-crosslinker para-benzoyl-L-phenylalanine, pBpa, is introduced in vivo in place of a residue of interest and UV-irradiation of living cells provokes the formation of complexes between the protein of interest and its partners. First, in a systematic approach, pBpa was introduced at several surface-exposed sites of the secreted protein PelI. This strategy permitted us to identify that one structural element, loop 3 of Fn3 domain in PelI, interacts both with the secretin, the outer membrane T2SS component, and with the PDZ domain of OutC, an inner membrane T2SS component. These results suggest that this loop 3 is a part of the secretion motif. The same approach permitted us to identify two other regions of PelI interacting with the T2SS: a linker situated between the two domains of PelI, which interacts with OutD, and an exposed region of the catalytic domain of PelI interacting with OutC. In another approach, pBpa was introduced into the T2SS components, OutC and OutD. These experiments suggested that the PDZ domain of OutC interacts with the secreted protein PelB. This study, in complement with other approaches, allowed us to uncover some important molecular features of the protein secretion by the T2SS

Le système de sécrétion de type II (T2SS) est largement répandu chez les bactéries à Gram négatif. Il permet la sécrétion d’enzymes lytiques et de toxines. Chez la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi, les pectinases, sécrétées par ce système appelé Out, dégradent la pectine, provoquant les symptômes de pourriture molle. La sécrétion par le T2SS se passe en 2 étapes : les protéines traversent la membrane interne par le système Sec ou le système Tat. Une fois dans le périplasme, elles sont repliées et transloquées par le T2SS à travers la membrane externe. Le système Out est composé de 14 protéines intégrées ou associées à l’une des deux membranes. Son assemblage et son fonctionnement restent obscurs. Une plateforme serait formée dans la membrane interne par OutE, -F, -L, -M et –C. Ces trois derniers composants sont des protéines bitopiques dont la stœchiométrie et le rôle sont inconnus. Pour identifier des interactions entre ses composants, nous avons utilisé le double-hybride bactérien, basé sur la reconstitution de l’activité d’adénylate cyclase. Nous avons démontré que le domaine de type ferrédoxine, situé en C-terminus d’OutL et d’OutM, est directement impliqué dans l’homo- et l’hétérodimérisation de ces protéines. Une interaction entre les régions périplasmiques d’OutC et d’OutD a été aussi détectée (Login et al., 2010). Pour mieux analyser les multiples interactions au sein du T2SS, des expériences de triple-hybride ont été réalisées en co-exprimant différentes combinaisons des régions solubles de trois composants. Nos résultats suggèrent qu’OutL empêche l’interaction entre OutC et OutD. Par ailleurs, OutL est impliquée dans l’activation de l’ATPase OutE, le moteur du système (Camberg et al., 2007). OutL serait donc impliquée dans la transmission du signal entre le périplasme et le cytoplasme et pourrait intervenir dans la dissociation du complexe OutD/OutC. Afin d’analyser le rôle des segments transmembranaires (TMS) de composants du T2SS, nous avons adapté la technique du double-hybride. Le domaine de la protéine rapporteur Cya a été fusionné au N-terminus du TMS et BlaM au C-terminus. BlaM sert à contrôler la topologie correcte des fusions dans la membrane. Plusieurs interactions bi-partenaires entre les TMS d’OutC, OutL et OutM ont été ainsi détectées. Ce travail a été complété par une étude in vitro (pull-down) et par mutagenèse dirigée. Ces interactions TMS-TMS pourraient intervenir dans la transmission du signal du périplasme vers le cytoplasme à travers la membrane interne. / The type II secretion system (T2SS) is widely used to secrete toxins and lytic enzymes by animal and plant pathogenic Gram-negative bacteria. The phytopathogen bacterium Erwinia chrysanthemi secretes several pectinases by the T2SS called Out and causes soft rot disease. The exoproteins cross the cytoplasmic membrane either by the Sec or Tat systems. Once in the periplasm, the folded exoproteins are translocated across the outer membrane by the T2S machinery. The Out system is composed of 14 proteins integrated in or associated with the two bacterial membranes. The molecular organization and the mode of action of the T2SS remain unclear. Several components of this T2SS, OutC, -L, -M, -F and -E, are thought to form a platform in the inner membrane OutC, -Land -M are bitopic inne membrane but their stoichiometry and role in secretion are unknown. We used a bacterial two-hybrid system to detect protein interactions We have shawn that the ferredoxin-like domain at the C-terminus of OutL and OutM allows homo- and - heterodimerization of these proteins. An interaction between OutC and OutD periplasmic regions has been detected (Login et al., 201 0). Three-hybrid has been performed and our results suggest that OutL would destabilize the interaction between OutC and OutD. Also, OutL is implicated in the activation of ATPase OutE, which is thought to be the motor of the system (Cam berg et al., 2007). Thus, OutL could be implicated in the signal transduction from periplasme to cytoplasm and could dissociate the OutC/ OutD complex. To analyse protein-protein interactions within bacterial membranes, we developed a system specially adapted from the bacterial two-hybrid. One of the sub-domain of Cya has been fused to the N-terminus of TMS and BlaM to the C-terminus. Correct topology of fusions can be controlled using BlaM properties. B using this assay znd site-directed mutagenesis, we detected multiple bi-partner interactions between the TMS of OutC, OutL and OutM.

<p>Retractable surface appendages Type IV pili (T4P) are one of the major virulence determinants in the opportunistic pathogen <em>Pseudomonas aeruginosa </em>(Pa), that is the leading cause of mortality in CF patients. T4P are heteropolymers composed of the major-pilin subunit PilA and the less-abundant minor pilins (MPs), FimU/PilV/W/X/E. Pilins share high sequence and structural similarity with pseudopilins (XcpT/U/V/W/X), that are proposed to form a periplasmic-structure in the evolutionarily related Type II secretion system (T2SS). Similar to T4P system, the T2SS is a multi-subunit complex that spans the inner (IM) and the outer (OM) membranes. It involves a two-step process facilitating the secretion of toxins into the extracellular milieu from the periplasm.</p> <p>Using immunogold TEM analysis and Western blot we identified, under native conditions, the major pseudopilin of T2SS XcpT, is incorporated into the T4P appendage, thus appearing on the surface. This is in contrast to previous studies reporting, the otherwise periplasmic structure, the pseudopilus appears on the surface only upon over-expression of XcpT. Further, we identified this incorporation is strictly dependent on PilA expression, such that levels of surface-XcpT co-varied with the levels of surface-PilA. However, XcpT incorporation into the T4P fiber did not affect T4P-mediated twitching motility or T2SS-mediated elastase secretion. Based on these observations we proposed two explanations. Firstly, given the similarity between XcpT and type IV pilins, it is possible the pseudopilin is recognized by the T4P machinery and therefore is incorporated into the pilus. Secondly, since XcpT incorporation does not affect T4P-mediated motility, it may affect other properties of T4P, such adherence during biofilm formation, previously associated with surface-exposed pseudopilus. In addition, we also identified enhanced expression of <em>fimU</em> and <em>pilX</em> MPs drastically increased elastase secretion, through a yet to be discovered mechanism. Regardless, our results present an alternative role of both minor pilins and XcpT in their non-native systems suggesting there is more overlap between the T4P and T2S systems than previously appreciated. Further exploration of this overlap will aid in the study of the two systems in Pa, as well as in other pathogens.</p> / Master of Science (MSc)

Le système de sécrétion de type II (T2SS) est largement répandu chez les bactéries à Gram négatif et est, entre autre, exploité par de nombreux pathogènes pour sécréter des facteurs de virulence dans le milieu extérieur. Le T2SS est constitué de 12 à 15 protéines différentes s’associant en une machinerie complexe qui traverse la totalité de l’enveloppe bactérienne. Ce système assure la sécrétion de protéines repliées du périplasme au milieu extracellulaire. Le mode de fonctionnement de cette machinerie n’est toujours pas connu. Pour comprendre les mécanismes moléculaires régissant la sécrétion des protéines par le T2SS, nous avons utilisé comme modèle le T2SS de la bactérie phytopathogène Dickeya dadantii, nommé Out, qui assure la sécrétion de pectinases entrainant la pourriture molle chez de nombreux végétaux. Nous avons employé des approches de pontage disulfure, double hybride bactérien et GST-pull down afin d’étudier l’arrangement et l’organisation des composants au sein du système de sécrétion. Nous avons ainsi montré que les composants de la membrane interne et la sécrétine de la membrane externe se coordonnent entre eux grâce à un réseau d’interactions complexe et dynamique qui peut être modifié par la présence d’une protéine à sécréter. En combinant des approches génétiques, biochimiques, structurales et bioinformatiques, nous avons étudié le mécanisme de reconnaissance de la pectinase PelI, par deux composants majeurs du système, la protéine de membrane interne OutC et la sécrétine OutD qui forme le pore du T2SS dans la membrane externe. Nous avons montré que PelI interagit avec les domaines périplasmiques HR et PDZ d’OutC et N0 et N1 d’OutD. La présence de N1 renforce l’interaction PDZ/PelI suggérant que le processus de sécrétion pourrait être régi par une succession de contacts synergiques. PDZOutC reconnait une boucle de 9 résidus au sein de l’exoprotéine PelI. Cette boucle constitue un motif d’adressage spécifique contrôlant le recrutement de PelI par la machinerie de sécrétion Out. Des études in silico et in vivo ont montré l’existence de régions similaires à cette boucle au sein d’autres pectinases sécrétées par D. dadantii. Par ailleurs, l’interaction N1OutD/PelI impliquerait un contact de brins β ainsi que la région non structurée située en amont de N1. Ces travaux constituent la première démonstration expérimentale du rôle de signal de sécrétion d’un élément structural précis d’une exoprotéine sécrétée par un T2SS. Ils ont également permis pour la première fois de caractériser des sites précis d’interactions entre une protéine sécrétée et des composants du T2SS. Cette étude constitue une avancée majeure dans la compréhension des mécanismes moléculaires qui gouvernent le recrutement et la sécrétion des protéines par le système de type II. / The type II secretion system (T2SS) is widespread in Gram-negative bacteria. It is notably exploited by various pathogenic bacteria to secrete virulence factors into the extracellular milieu and host tissues. The T2SS is composed of 12 to 15 proteins that assemble together into a complex machine that spans the bacterial envelope. It allows the translocation of fully folded proteins from the periplasm across the outer membrane. The exact mode of action of this sophisticated machine is still unknown. The phytopathogenic bacterium Dickeya dadantii uses a T2SS, named Out, to secrete several plant cell-wall degrading enzymes that cause the soft rot disease of many plants. We used the Out system of this bacterium as a model to study the molecular mechanism of protein secretion by T2SS. In order to study the mutual arrangement of the different components of this machinery, we used disulfide bonding, bacterial two hybrid and GST-pull down. We showed that the components of the inner membrane platform interact together and we characterized several interfaces between the inner membrane component OutC and the outer membrane secretin OutD. These various contacts create a complex and dynamic network within the secretion machine that can be modulated by the presence of a protein to be secreted. Subsequently, we combined genetic, biochemical, structural and bioinformatics approaches to study how the pectinase PelI is recognized by the inner membrane component OutC and the pore-forming secretin OutD. We showed that PelI interacts with the periplasmic domains HR and PDZ of OutC and N0 and N1 of OutD. The presence of N1OutD positively modulates the PDZ/PelI interaction, suggesting that protein progression through the T2SS could involve a succession of synergistic contacts. The OutC PDZ domain recognizes a short loop of PelI. This loop acts as a specific secretion signal that controls exoprotein recruitment by the T2SS. Concerted in silico and in vivo approaches suggest the occurrence of equivalent secretion motifs in other exoproteins. The interaction between PelI and OutD could involve a β-strand contact and an intrinsically disordered region located upstream of N1. This work provides the first experimental evidence of molecular mechanisms that govern exoprotein recruitment by the T2SS. Notably, we identified a short structural element acting as a secretion signal and characterized for the first time the interfaces between the T2SS components and a protein to be secreted. This study provides important new mechanistic insights to understand the functioning of this secretion machine.