京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第23952号 / 農博第2501号 / 新制||農||1091(附属図書館) / 学位論文||R4||N5387(農学部図書室) / 京都大学大学院農学研究科応用生命科学専攻 / (主査)教授 栗原 達夫, 教授 小川 順, 教授 阪井 康能 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DGAM

Le système de sécrétion de type II (T2SS) est largement exploité par les bactéries à Gram négatif pour sécréter divers facteurs de virulence depuis le périplasme vers le milieu extra-cellulaire. La bactérie phytopathogène Dickeya dadanti (ex. Erwinia chrysanthemi) utilise ce système, appelé Out, pour la sécrétion de pectinases responsable de la maladie de la pourriture molle chez de nombreuses plantes. Les deux composants essentiels du système Out, la protéine de membrane interne OutC et la sécrétine OutD, formant un pore dans la membrane externe, sont impliqués dans la spécificité de sécrétion. L'interaction entre OutC et OutD pourrait assurer l’intégrité structurelle et fonctionnelle du système de sécrétion en reliant les deux membranes. Nous avons entrepris une étude structure-fonction de ces deux composants afin d’identifier et caractériser leurs sites d’interaction et de mieux comprendre leurs rôles. Nous avons appliqué une approche intégrative impliquant une analyse in vivo par cystéine-scanning et pontage disulfure, une analyse in vitro par GST pull down et une analyse structurale d’OutC et OutD et de leurs interactions par RMN. Nos résultats indiquent la présence d'au moins trois sites d'interaction entre les régions périplasmiques d’OutC et d’OutD et suggèrent que ces interactions s’établissent par un mécanisme d’addition des brins β. Nous avons démontré qu’un site situé sur le domaine HR d’OutC pouvait interagir avec deux sites distincts d’OutD suggérant un mode d’interaction alternatif. La présence d’exoprotéines et/ou des composants de membrane interne du système OutE-L-M, modifie différemment l’affinité de ces trois sites d'interaction entre OutC et OutD. Nous proposons que ces interactions alternatives entre divers sites d’OutC et OutD pourraient refléter une succession d’étapes fonctionnelles lors du processus de sécrétion. Pour étudier le mécanisme d’adressage et d’assemblage de la sécrétine OutD dans la membrane externe, nous avons exploité les interactions entre OutD et deux composants auxiliaires du T2SS, la protéine de la membrane interne OutB et la lipoprotéine de la membrane externe OutS. Nous avons montré une interaction directe entre le domaine périplasmique d’OutB et le domaine N0 d’OutD. Une analyse structure-fonction du complexe OutS-OutD a révélé que la pilotine OutS interagit fortement avec 18 résidus à l’extrémité C-terminale de la sécrétine, entraînant la structuration sous forme hélicoïdale de cette région initialement non structurée. Ce travail nous permet de mieux comprendre le mécanisme d’assemblage et de fonctionnement du système de sécrétion de type II. / The type II secretion system (T2SS) is widely exploited by Gram-negative bacteria to secrete diverse virulence factors from the periplasm into the extra-cellular milieu. The phytopathogenic bacterium Dickeya dadanti (ex. Erwinia chrysanthemi) uses this system, named Out, to secrete several cell-wall degrading enzymes that cause soft-rot disease of many plants. The two core components of the Out system, the inner membrane protein OutC and the secretin OutD, which forms a secretion pore in the outer membrane, are involved in secretion specificity. The interaction between OutC and OutD could assure the structural and functional integrity of the secretion system by connecting the two membranes. To understand structure-function relationships between these two components and characterize their interaction sites, we applied an integrative approach involving in vivo cysteine scanning and disulfide cross-linking analysis, truncation analysis of OutC and OutD combined with in vitro GST pull-down, and structural analysis of these proteins and of their interactions by NMR. Our results indicate the presence of at least three interacting sites between the periplasmic regions of OutC and OutD and suggest a β-strand addition mechanism for these interactions. We demonstrated that one site of the HR domain of OutC can interact with two distinct sites of OutD suggesting an alternative mode of their interactions. The presence of exoproteins or/and the inner membrane components of the system OutE-L-M differently alters the affinity of the three OutC-OutD interacting sites. We suggest that successive interactions between these distinct regions of OutC and OutD may have functional importance in switching the secretion machinery between different functional states. To study the mechanism of the targeting and assembly of the secretin OutD into the outer membrane, we exploited the interactions between OutD and two auxiliary proteins, i.e., the inner membrane protein OutB and the outer membrane lipoprotein OutS. We showed a direct interaction between the periplasmic domain of OutB and the N0 domain of OutD. Structure-function analysis of OutS-OutD complex shows that the pilotin OutS binds tightly to 18 residues close to the C-terminus of the secretin subunit causing this unstructured region to become helical on forming the complex. This work allows us to better understand the assembly and function mechanism of the type II secretion system.

Les bactéries à Gram négatif sont entourées par une enveloppe cellulaire qui, contrairement aux bactéries à Gram positif, possèdent une organisation membranaire complexe composée d’une membrane interne appelée généralement membrane cytoplasmique, un espace périplasmique contenant une matrice de peptidoglycane et une membrane externe asymétrique constituée d’une monocouche de phospholipides surmontée d’une assise de lipopolysaccharide (LPS). Afin de franchir cette barrière, les bactéries à Gram négatif ont développé différentes voies de sécrétions spécifiques dédiées à l’export des protéines (effecteurs) du milieu intracellulaire vers le milieu extracellulaire. Jusqu'à présent, six systèmes de sécrétion ont été identifiés chez ces bactéries. Chez Pseudomonas aeruginosa, une bactérie pathogène opportuniste, le système de sécrétion de type II appelé aussi sécréton Xcp constitue l’un des facteurs principales de sa virulence. Le sécréton Xcp est un complexe macromoléculaire formé par 12 protéines, nommées XcpAO et XcpPC-XcpZM. Ce complexe macromoléculaire est organisé en trois sous-complexes : i) une plateforme d’assemblage ancrée dans la membrane interne formé par les protéines XcpRESFYLZM ii) un pore de sécrétion localisé dans la membrane externe formé par l’oligomérisation d’une protéine appelé la sécrétine XcpQD. Le pore de sécrétion est connecté à la plateforme de la membrane interne par une protéine appelée XcpPC iii) un pseudopilus périplasmique sous forme de fibre hélicoïdale qui est formé par la multimérisation d’une protéine appelée la pseudopiline majeure XcpTG. D’autres protéines appelées les pseudopilines mineures XcpUH-VI-WJ-XK intègrent le pseudopilus. La première partie du travail effectué au cours de cette thèse a eu pour but d’étudier et de comprendre par des approches structurales, biochimiques et biophysiques le mécanisme d’assemblage des pseudopilines en pseudopilus. La deuxième partie de ce travail a porté sur l’étude des réseaux d’interactions entre les substrats sécrétés et les composants de la machinerie Xcp. Durant cette thèse, nous avons ainsi i) identifier grâce à l’étude des interactions protéine-protéine l’existence d’un complexe quaternaire entre les pseudopilines mineures XcpUH-VI-WJ-XK localisées au sommet du pseudopilus ii) déterminer les structures de la pseudopiline majeure XcpTG par RMN et de la pseudopiline mineure XcpWJ par cristallographie aux rayons X iii) déterminer les différents éléments du sécréton qui interagissent avec les exoprotéines du sécréton. Ce réseau d’interaction nous a permis de proposer un modèle de fonctionnement du sécréton qui élucide le cheminement des exoprotéines dans le sécréton afin qu’elles soient exportées vers le milieu extracellulaire. / Gram-negative bacteria are characterized by a complex organization of their cell envelope composed by the inner membrane (IM) called cytoplasmic membrane, the periplasmic space containing a peptidoglycan layer and the outer membrane (OM) covered by the lipopolysaccharide matrix. Gram-negative bacteria have evolved several specialized machines called secretion systems to export their effectors from the intracellular medium to the extracellular milieu or to the host cells. Up to now, at least six secretion systems have been identified. In the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa, the type II secretion system called the Xcp secreton is the major pathway for the release of virulence factors. The Xcp secreton is a macromolecular complex composed by 12 proteins called XcpAO, XcpPC-XcpZM. This machinery is organized in 3 sub-complexes: i) the assembly platform localized in the IM implicating XcpRESFYLZM proteins ii) the OM pore composed by the oligomerization of the secretin XcpQD. The connection between the assembly platform and the secretin is performed by XcpPC anchored in the IM iii) a periplasmic pseudopilus consisting of the multimerization of the so-called major pseudopilin XcpTG. The pseudopilus is a helicoidally filament spanning the periplasmic area and pushing the substrate into the secretin pore. Four other proteins, the minor pseudopilins XcpUH-VI-WJ-XK, were found in the pseudopilus. In the present work we first focused on the study of the pseudopilus components by biochemical, biophysical and structural strategies to understand their assembly. Secondly, we investigate the protein interactome between periplasmic secreton component and secreted substrates. Thus, we revealed the presence of a quaternary complex composed by XcpUH-VI-WJ-XK located at the tip of the pseudopilus. To understand at atomic scale the regulation of the pseudopilus, we determined the structure of two components of the pseudopilus XcpTG by NMR and XcpWJ by X-ray crystallography. Using systematic protein-protein interaction studies between secreton components and purified exoproteins of Pseudomonas aeruginosa, we identified 5 proteins of the secreton able to interact with exoproteins. This interaction network allowed us to propose a model for the secretion process including the sequential steps followed by exoproteins inside the secreton to leave the cell envelop.

Type II secretion system (T2SS) is one of the secretion systems found in gram-negative bacteria that provides transport of some bacterial proteins across the outer membrane. The passage through the membrane is mediated by a pore assembled from subunits called GspD or secretin. Together with three other components of T2SS, GspD was discovered in the genome of several protists including Naegleria gruberi, Andalucia godoyi, Reclinomonas americana, Neovahlkampfia damariscottae or in s species of genus Malawimonas. Previously it was found out that these proteins localize into the mitochondria. If found functional and with analogous topology to the bacterial system, the eukaryotic T2SS would represent unique mitochondrial protein export system. Secretin is essential subunit of T2SS which is not only the passive membrane channel, but also participates in the recognition of the substrate. Therefore, the research of the eukaryotic secretin could bring a valuable knowledge about the function of the mitochondrial T2SS. The experimental part of this thesis tries to characterize the eukaryotic secretin and it focuses on (i) the assembly of the secretin channel, in both, the bacteria and in the artificial membranes, (ii) the interactions of GspD with the other subunits of T2SS and (iii) the mechanism of import...

Le système de sécrétion de type II (T2SS) assure le transport de protéines sous une forme repliée du périplasme dans le milieu extracellulaire. Ce système est largement exploité par les bactéries à Gram négatif pathogènes des plantes, des animaux et de l'homme où il permet la sécrétion de facteurs de virulence (des toxines et des enzymes lytiques). La bactérie phytopathogène Dickeya dadantii utilise le T2SS appelé Out, pour sécréter une douzaine de pectinases qui dégradent les parois des cellules végétales. Les protéines sécrétées par le T2SS n'ont pas de motif de sécrétion apparent et leur sécrétion implique plusieurs interactions transitoires avec les composants du système. La nature moléculaire de ces interactions n'est pas connue. Afin de capter ces interactions transitoires lors du processus de sécrétion, j'ai utilisé le pontage dirigé in vivo. Cette technique repose sur l'incorporation d'un analogue photoréactif d'un acide aminé (le para-benzoyl Lphénylalanine, pBpa) à la place des résidus soupçonnés de faire partie d'un site d'interaction. Le pontage est ensuite activé par une courte exposition des cellules aux UV ce qui permet la formation des complexes protéiques. Tout d'abord, cette technique a été utilisée pour introduire le pBpa dans plusieurs régions exposées à la surface d'une exoprotéine, PelI. Cette stratégie a permis de mettre en évidence qu'un élément structural, la boucle 3 du domaine Fn3 de PelI, est impliquée dans l'interaction avec la sécrétine OutD, le composant du T2SS situé dans la membrane externe, et avec le domaine PDZ d'OutC, un composant de la membrane interne. Ces résultats suggèrent que la boucle 3 fait partie d'un motif de sécrétion. Deux autres régions ont été identifiées au sein de PelI : le linker entre les deux domaines de PelI qui est impliqué dans l'interaction avec OutD et une région exposée du domaine catalytique qui interagit avec la protéine OutC. La même approche a été utilisée pour introduire le pBpa dans les deux composants du T2SS, OutC et OutD. Ces expériences ont suggéré que le domaine PDZ d'OutC interagit avec une autre exoprotéine, PelB. Cette étude, de façon complémentaire à d'autres approches, nous a permis de démontrer certains détails moléculaires essentiels de la sécrétion par le T2SS / The type II secretion system (T2SS) transports folded proteins from the periplasm through the outer membrane into the milieu. In many pathogenic Gram-negative bacteria, the T2SS secretes various virulence factors in host tissue and is directly involved in pathogenesis. The phytopathogen Dickeya dadantii secretes a dozen of pectinases through a T2SS named Out. The secreted proteins are lacking an obvious common signal and secretion is thought to involve multiple transient interactions of folded exoproteins with several T2SS components. Molecular nature of these interactions remains unknown. To address this question we used an in vivo sitespecific photo-crosslinking approach to capture such transient interactions within the functional T2SS of D. dadantii. In this technique, the photo-crosslinker para-benzoyl-L-phenylalanine, pBpa, is introduced in vivo in place of a residue of interest and UV-irradiation of living cells provokes the formation of complexes between the protein of interest and its partners. First, in a systematic approach, pBpa was introduced at several surface-exposed sites of the secreted protein PelI. This strategy permitted us to identify that one structural element, loop 3 of Fn3 domain in PelI, interacts both with the secretin, the outer membrane T2SS component, and with the PDZ domain of OutC, an inner membrane T2SS component. These results suggest that this loop 3 is a part of the secretion motif. The same approach permitted us to identify two other regions of PelI interacting with the T2SS: a linker situated between the two domains of PelI, which interacts with OutD, and an exposed region of the catalytic domain of PelI interacting with OutC. In another approach, pBpa was introduced into the T2SS components, OutC and OutD. These experiments suggested that the PDZ domain of OutC interacts with the secreted protein PelB. This study, in complement with other approaches, allowed us to uncover some important molecular features of the protein secretion by the T2SS

Le système de sécrétion de type II (T2SS) est largement répandu chez les bactéries à Gram négatif et est, entre autre, exploité par de nombreux pathogènes pour sécréter des facteurs de virulence dans le milieu extérieur. Le T2SS est constitué de 12 à 15 protéines différentes s’associant en une machinerie complexe qui traverse la totalité de l’enveloppe bactérienne. Ce système assure la sécrétion de protéines repliées du périplasme au milieu extracellulaire. Le mode de fonctionnement de cette machinerie n’est toujours pas connu. Pour comprendre les mécanismes moléculaires régissant la sécrétion des protéines par le T2SS, nous avons utilisé comme modèle le T2SS de la bactérie phytopathogène Dickeya dadantii, nommé Out, qui assure la sécrétion de pectinases entrainant la pourriture molle chez de nombreux végétaux. Nous avons employé des approches de pontage disulfure, double hybride bactérien et GST-pull down afin d’étudier l’arrangement et l’organisation des composants au sein du système de sécrétion. Nous avons ainsi montré que les composants de la membrane interne et la sécrétine de la membrane externe se coordonnent entre eux grâce à un réseau d’interactions complexe et dynamique qui peut être modifié par la présence d’une protéine à sécréter. En combinant des approches génétiques, biochimiques, structurales et bioinformatiques, nous avons étudié le mécanisme de reconnaissance de la pectinase PelI, par deux composants majeurs du système, la protéine de membrane interne OutC et la sécrétine OutD qui forme le pore du T2SS dans la membrane externe. Nous avons montré que PelI interagit avec les domaines périplasmiques HR et PDZ d’OutC et N0 et N1 d’OutD. La présence de N1 renforce l’interaction PDZ/PelI suggérant que le processus de sécrétion pourrait être régi par une succession de contacts synergiques. PDZOutC reconnait une boucle de 9 résidus au sein de l’exoprotéine PelI. Cette boucle constitue un motif d’adressage spécifique contrôlant le recrutement de PelI par la machinerie de sécrétion Out. Des études in silico et in vivo ont montré l’existence de régions similaires à cette boucle au sein d’autres pectinases sécrétées par D. dadantii. Par ailleurs, l’interaction N1OutD/PelI impliquerait un contact de brins β ainsi que la région non structurée située en amont de N1. Ces travaux constituent la première démonstration expérimentale du rôle de signal de sécrétion d’un élément structural précis d’une exoprotéine sécrétée par un T2SS. Ils ont également permis pour la première fois de caractériser des sites précis d’interactions entre une protéine sécrétée et des composants du T2SS. Cette étude constitue une avancée majeure dans la compréhension des mécanismes moléculaires qui gouvernent le recrutement et la sécrétion des protéines par le système de type II. / The type II secretion system (T2SS) is widespread in Gram-negative bacteria. It is notably exploited by various pathogenic bacteria to secrete virulence factors into the extracellular milieu and host tissues. The T2SS is composed of 12 to 15 proteins that assemble together into a complex machine that spans the bacterial envelope. It allows the translocation of fully folded proteins from the periplasm across the outer membrane. The exact mode of action of this sophisticated machine is still unknown. The phytopathogenic bacterium Dickeya dadantii uses a T2SS, named Out, to secrete several plant cell-wall degrading enzymes that cause the soft rot disease of many plants. We used the Out system of this bacterium as a model to study the molecular mechanism of protein secretion by T2SS. In order to study the mutual arrangement of the different components of this machinery, we used disulfide bonding, bacterial two hybrid and GST-pull down. We showed that the components of the inner membrane platform interact together and we characterized several interfaces between the inner membrane component OutC and the outer membrane secretin OutD. These various contacts create a complex and dynamic network within the secretion machine that can be modulated by the presence of a protein to be secreted. Subsequently, we combined genetic, biochemical, structural and bioinformatics approaches to study how the pectinase PelI is recognized by the inner membrane component OutC and the pore-forming secretin OutD. We showed that PelI interacts with the periplasmic domains HR and PDZ of OutC and N0 and N1 of OutD. The presence of N1OutD positively modulates the PDZ/PelI interaction, suggesting that protein progression through the T2SS could involve a succession of synergistic contacts. The OutC PDZ domain recognizes a short loop of PelI. This loop acts as a specific secretion signal that controls exoprotein recruitment by the T2SS. Concerted in silico and in vivo approaches suggest the occurrence of equivalent secretion motifs in other exoproteins. The interaction between PelI and OutD could involve a β-strand contact and an intrinsically disordered region located upstream of N1. This work provides the first experimental evidence of molecular mechanisms that govern exoprotein recruitment by the T2SS. Notably, we identified a short structural element acting as a secretion signal and characterized for the first time the interfaces between the T2SS components and a protein to be secreted. This study provides important new mechanistic insights to understand the functioning of this secretion machine.