AntecedentsDurant els primers dies del desenvolupament postnatal les plaques motores es troben multiinnervades fins amb 5 axons. Aquesta multiinnervació decreix progressivament fins a l'adultesa on les plaques motores es troben innervades per un sol axó. En aquesta pèrdua axonal o eliminació sinàptica es troben implicats una sèrie de mecanismes presinàptics i postsinàptics relacionats amb el nivell d'activitat neuromuscular. En aquest context, poden estar implicats els autoreceptors muscarínics (mAChRs). En les sinapsis neuromusculars colinèrgiques existeixen autoreceptors muscarínics axonals sensibles al neurotransmissor que ell mateixos alliberen. Objectius S'estudia la participació dels diferents tipus de mAChRs en el procés d'eliminació sinàptica en la sinapsi neuromuscular de rata nounat mitjançant tècniques electrofisiològiques de registre intracel·lular convencional. També es vol determinar amb precisió els tipus de mAChRs presents en la sinapsi neuromuscular de la rata adulta, la seva relació amb els canals de calci dependents de voltatge (VDCC) i els mecanismes intraaxonals implicats.MetodologiaS'utilitza com a model les sinapsis neuromusculars del múscul Levator Auris Longus de rates adultes i nounats. Mitjançant el registre intracel·lular estudiem com diferents antagonistes muscarínics afecten els potencials de placa evocats (EPP) de la sinapsi neuromuscular adulta i de la sinapsi monoinnervada i doblement innervada de l'animal nounat. Per estudiar la possible relació dels muscarínics amb els VDCC incubem, prèviament, el múscul mitjançant blocadors dels canals de calci (Nitrendipina, -Conotoxina-GVIA i -Agatoxina-IVA) abans de determinar la resposta muscarínica. Per identificar una sinapsi doblement innervada en els animals nounats observem si a mesura que augmentem la intensitat de l'estímul elèctric apareix un segon EPP després del primer. Seguidament, les amplades dels potencials de placa més baixes i més altes es designen com a "EPP petit" i "EPP gran", respectivament.Principals resultatsEn l'adult, l'antagonista selectiu pel receptor muscarínic M1, Pirenzepina redueix la neurotransmissió evocada. Per altra banda, l'antagonista selectiu pel receptor muscarínic M2, Metoctramina incrementa l'alliberació evocada del neurotransmissor. Aquests dos mecanismes mediats pels muscarínics M1 i M2 depenen de l'entrada de calci per mitjà del canal P/Q. No trobem cap dada que ens indiqui la presència dels receptors muscarínics M3 (sensibles a 4-DAMP) i els receptors muscarínics M4 (sensibles a Tropicamida) en els músculs d'animals adults. En el nadó, la resposta dels agents muscarínics en el terminal nerviós de les sinapsis monoinnervades és similar a la resposta de l'EPP gran en les sinapsis doblement innervades. Aquestes respostes impliquen una inhibició de l'alliberació de l'ACh per mitjà de l'antagonista del receptor muscarínic M1, Pirenzepina i per mitjà de l'antagonista del receptor muscarínic M2, Metoctramina. L'EPP petit és també inhibit per l'antagonista del receptor muscarínic M2, Metoctramina però, és augmentat per l'antagonista del receptor M1, Pirenzepina i l'antagonista del receptor M4, Tropicamida.En relació als canals de calci dependents de voltatge, observem un canvi gradual des de la implicació dels VDCC tipus P/Q, N i L en totes les respostes mediades pels muscarínics M1, M2 i M4 en l'EPP petit, fins a la implicació d'un únic canal, el P/Q, en les respostes dels receptors M1 i M2 en les plaques monoinnervades. Aquest fet indica l'existència d'un progressiu tancament dels VDCC paral·lel a l'especialització del canal tipus P/Q de l'adult. Conclusió principalEls autoreceptors muscarínics poden, globalment, potenciar el terminal que genera l'EPP gran i inhibir el terminal que genera l'EPP petit col·laborant així en l'eliminació sinàptica del desenvolupament. / AntecedentsDuring first postnatal developing days the motor endplates are multiinnervated, this multiinnervation decrease at the next weeks until the adult age, when the motor endplates are monoinnervated. Is in this axonal losing or synaptic elimination where there are implicated presynaptic and postsynaptic mechanisms related with neuromuscular activity levels. In this context, muscarinic autoreceptors (mAChRs) can be involved. In the cholinergic neuromuscular junctions there are presynaptic muscarinic autoreceptors(mAChRs) with sensibility to neurotransmitter released by themselves. ObjectivesIn this work we investigate the participation of different subtypes of mAChRs in the synaptic elimination period in the newborn rat neuromuscular junction with electrophysiological recording techniques. We want previously determining, the presence of different subtypes, the functional behaviour and the voltage dependent calcium channels (VDCC)-dependence of the mAChRs in the adult motor nerve terminals.MethodsWe investigate presynaptic muscarinic autoreceptors involved in the modulation of neurotransmitter release and their VDCC-dependence, in the Levator Auris Longus muscle neuromuscular junction of newborn and adult rats. We use intracellular recording techniques to study who different muscarinic antagonists affect the endplate potentials (EPP) in the adult and newborn neuromuscular junctions.We previously incubated the muscle with VDCC blockers (Nitrendipine, -Conotoxin- GVIA, -Agatoxin-IVA) before determining the muscarinic response, to study the possible relation to mAChRs with VDCC.ResultsIn the adult, the M1 antagonist Pirenzepine (10 µM) decreases the evoked release. On the other hand, the M2 antagonist Methoctramine (1 µM) increases the evoked neurotransmitter release. Both mechanisms, depends on the calcium influx from the external media via P/Q calcium channels. We found no indices of M3 (4-DAMP-sensitive) or M4 (Tropicamide-sensitive) muscarinic receptors in the adult animals muscles.In the newborn, in dually innervated fibers, a second EPP can appear after the first when the intensity of the electrical stimulus is raised. The lowest and highest EPP amplitudes are designed as "the small- EPP" and "the large- EPP", respectively.The muscarinic agents response in the nerve terminal of monoinnervated synapses is similar to the large EPP response in dually innervated junctions. This response involved an ACh release inhibition by M1 muscarinic antagonist Pirenzepine and by M2 muscarinic antagonist Methoctramine. However, M1 antagonist Pirenzepine and M4 antagonist Tropicamide increase the small EPP.In relation to VDCC-dependence we observe a gradual change in the small EPP, from the P/Q, N, and L VDCC implication in all responses where the M1, M2 and M4 muscarinics are involved, to the implication of a lonely channel, the P/Q, in the M1 and M2 responses in the monoinnervated endplates.This indicates the existence of a progressive shutoff in parallel with maturation and specialization of the adult type P/Q channel.Main conclusionIn summary, muscarinic autoreceptors can directly modulate both, large-EPP generating ending potentiation, and small-EPP generating ending depression by their association with VDCC in developing neuromuscular junction.

INTRODUCCIÓ: La teràpia amb làser a baixa potència (LLLT) a una longitud d'ona i fluència específica manté l'activitat electrofisiològica de nervis perifèrics lesionats en animals d'experimentació, preveu els canvis degeneratius i la formació de cicatrius en neurones motores lesionades de la medul·la espinal, així com accelera la regeneració dels nervis lesionats. El tractament de pacients amb diode làser d'infraroig proper redueix l'espasme muscular i al mateix temps s'ha descrit un augment de la mobilitat muscular.OBJECTIU: Estudiar l'efecte de la LLLT, 655 nm (vermell) i 830 nm (infraroig proper) en l'alliberació de neurotransmissor en la unió neuromuscular del diafragma de rata.MATERIAL i MÈTODE: Es van realitzar dos tipus d'estudi:1) In vitro en 60 músculs diafragmàtics amb els seus respectius nervis frènics2) In vivo en 20 músculs elevator longus de l'orella de ratolí. Els làsers eren diodes de Gallium-Aluminium-Arsenide (GaAlAs):a) 655 nm (vermell) a una densitat d'energia d'1 a 12 Jouls per centímetre quadrat b) 830 nm (infraroig proper) a una densitat d'energia de 4 a 12 J/cm2. 1) Control de la temperatura en el medi de manteniment de la mostra a les dosis màximes utilitzades, comprovant que no es produís cap tipus de modificació que pogués interferir en el registre dels potencials. 2) L'alliberació de neurotransmissor es va estudiar seguint la tècnica convencional de registre intracel·lular de potencial de membrana, en un medi amb concentracions altes de magnesi (bloqueig presinàptic) o curaritzat (bloqueig postsinàptic). Es va mesurar el contingut quàntic, l'amplitud, la latència i el temps mitjà dels potencials de placa terminal (EPPs). També es va analitzar la freqüència i l'amplitud dels potencials espontanis en miniatura, al voltant de la placa terminal (MEPPs). La facilitació de l'alliberació de neurotransmissor es va avaluar després de l'estímul d'un parell de polsos.3) Es va mesurar indirectament la transmissió de la pell de ratolí i la humana, així com la de la musculatura del ratolí per poder fer l'aproximació de quanta energia es necessita a la superfície per poder arribar fins a les sinapsi neuromuscular dels paquets musculars subcutanis.4) Amb la tècnica de neurografia es van avaluar els potencials d'acció compostos (PAMCs) amb dosis superficials d'entre 92,9 - 416,5 J/cm2. RESULTATS: La irradiació de la placa motora amb làser de 655 nm en les condicions dosimètriques testades en aquest estudi no va produir cap efecte estadísticament significatiu en cap dels paràmetres estudiats. El làser de 830 nm a 12 J/cm2 produeix un canvi estadísticament significatiu en la reducció del contingut quàntic (P=0.01) i en l'amplitud (P=0.04) dels EPPs. No s'observaren altres canvis significatius en la resta de paràmetres estudiats. Així com tampoc s'han observat canvis in vivo en els PAMCs ni amb 655 nm ni amb 830 nm als paràmetres estudiats.CONCLUSIÓ: El làser de 655 nm a les dosis testades no afecta, en condicions properes a la normalitat, el funcionament fisiològic de la sinapsi neuromuscular. Per això podem afirmar que la irradiació clínica de la pell o d'altres teixits, a aquesta longitud d'ona, no interfereix col·lateralment en la fisiologia de la sinapsi neuromuscular. El làser de 830 nm a les dosis testades afecta, en condicions properes a la normalitat, el funcionament fisiològic de la sinapsi neuromuscular en un mecanisme independent del calci. Per tant, podem afirmar que, sigui o no l'objectiu de tractament, la irradiació clínica, a aquesta longitud d'ona pot provocar un efecte de relaxació del múscul irradiat. / BACKGROUND: Several recent papers report the efficacy of low energy laser radiation in the red and near-infra-red part of the spectrum in the stimulation and regeneration of tissue under normal and stressful conditions. Gallium-aluminum-arsenic (GaAlAs) lasers, which emit radiation in this region of the spectrum, can reduce spasms and increase neuromuscular activity. The molecular mechanisms of this process, however, are not well understood.OBJETIVE: The objective of this study was to determine the effect of red (655 nm) and near infrared (830 nm) laser radiation on neurotransmission in the neuromuscular junctions of mice.METHODS: Experiments were undertaken on sixty diaphragm muscles and twenty elevating muscles of mouse ears. GaAlAs laser radiation (655 nm and 830 nm) with an energy density between 4 and 12 J/cm2 was employed. The liberation of neurotransmitters was studied through the conventional technique of intracellular measurement in muscles treated with curare or in a medium with a high magnesium concentration. Neurotransmission was evaluated as: 1) The quantum content, amplitude, latency of evoked end-plate potentials (EPPs).2) The frequency and amplitude of the spontaneous end-plate potentials (MEPPs).3) Short-term plasticity of the neurotransmitter release (fast facilitation). The objective of this study was to determine the effect of red (655 nm) and near infrared (830 nm) laser radiation on neurotransmission in the neuromuscular junctions of mice. Was also evaluated by paired pulse stimulation. 4) The compound muscular action potential (CMPA) was evaluated using the neurographic technique. RESULTS: The liberation of neurotransmitter from the motor end-plate in mice, did not present detectable modifications after GaAlAs laser irradiation at 655 nm. The 830 nm laser radiation at 12 J/cm2 promoted a significant reduction in the quantum content (P=0.01) and amplitude of the EPPs (P=0.04), but the latency, the spontaneous liberation of neurotransmitter (MEPPs) and the facilitation for paired pulse was unaltered. No alteration was observed in neuromuscular junctions irradiated with 4 and 12 J/cm2 and alterations were also not detected in CMPA (92.9-416.5 J/cm2).CONCLUSIONS: In conclusion, irradiation with a diode laser emitting at 830 nm and an energy density of 12 J/cm2, can affect the liberation of neurotransmitter evoked in the motive terminal plate of mice in some situations. KEY- WORDS: Laser, GaAlAs, Neurophysiology, Neurography, MEPP, EPP

Determinar l'acció d'uns anticossos anti-gangliòsids d'un pacient amb polineuropatia crònica motora desmielinitzant associada a un component monoclonal IgM, sobre conducció nerviosa i sobre la neurotransmissió d'un mamífer adult tant en un estudi agut com crònic i, comprovar que els gangliòsids estan relacionats amb l'entrada de calci al terminal nerviós.Metodologies emprades:Determinació de l'especificitat del sèrum del pacient amb tècniques d'ELISA i d'immunoHPTLC utilitzant gangliòsids comercials i gangliòsids purificats de cervell boví, de cervell humà i de cultiu de cèl·lules YAC-1.Purificació d'anticossos de la classe IgM mitjançant cromatografia d'afinitat amb anticossos de cabra contra IgM humana.Tècniques d'immunohistoquímica per comprovar la fixació de l'anticòs a la regió presinàptica de la unió neuromuscular.Inoculació local repetitiva dels anticossos anti-gangliòsid en el múscul LAL de ratolins, cada 24 h durant 15 dies. Utilització de prendisolona per a reduir la resposta inflamatòria local. Els controls es van realitzar amb el mateix protocol però injectant les IgM desnaturalitzades per calor (90 ºC, 20 min) i altres solucions fisiològiques sobre el múscul.Estudis electrofisiològics convencionals de neurografia motora per determinar potencials motors compostos.Estudis electrofisiològics intracel·lulars per a comprovar l'efecte del sèrum (i la seva component monoclonal) del malalt tant en incubacions agudes com en els músculs tractats crònicament amb les IgManti-GM2.Resultats i conclusions:S'ha portat a terme un estudi sobre el paper del sèrum d'un pacient amb una neuropatia crònica desmielinitzant motora pura i un component monoclonal IgM que mostra afinitat per GM2 en la unió neuromuscular. Els estudis electrofisiològics aguts in vitro han mostrat que les IgM del pacient indueixen una reducció de la transmissió neuromuscular que està provocat per un bloqueig en l'entrada de calci a través dels canals tipus P/Q dependents de voltatge, molt probablement alterant algun mecanisme regulador controlat per gangliòsids. En aquest estudi també hem trobat que els gangliòsids contra els que van dirigits els anticossos del malalt es troben habitualment a nivell de sinapsis neuromuscular (tant en l'axó com en la cèl·lula de Schwann) i en el nervi intramuscular (tant en la beina de mielina com en l'axó motor). Pel que fa a l'aplicació crònica dels anticossos anti-gangliòsids del pacient sobre un múscul d'un mamífer adult el que provoquen són alteracions morfològiques (trobem sinapsis amb creixements i/o retraccions axonals) i alteracions funcionals (tenim un bloqueig de la neurotransmissió i l'aparició d'un nou canal de calci) en les unions neuromusculars. Les neurografies motores d'aquest músculs mostren bloqueig de la conducció axonal. / Objective:To determine the action of anti-gangliosides antibodies of a patient with a chronic motor demyelinating polyneuropathy associated with a IgM monoclonal component on the nerve conduction and on the neurotransmission of a adult mammalian both in a acute and chronic study and, to investigate that the gangliosides are involved in the entry of calcium in the nerve. Methods:Determination the serum specificity of the patient with ELISA and immuneHPTLC techniques using commercial and purified gangliosides of bovine brain, human brain and YAC-1 cells. IgM antibodies purifying with affinity chromatography with goat antibodies against human IgM.Immunehistochemistry techniques to search the antibody fixation at the presynapticc region of the neuromuscular junction. Passive transfer of anti-gangliosides antibodies into the LAL muscle of mice, every 24 h during 15 days. Utilization of prendisolone to reduce the inflammatory response. The controls followed the same protocol but the injection contain desnaturalized IgM (90 ºC, 20 min) and other physiological solution on the muscle. Conventional electrophysiological studies of motor to determinate compost motors action potentials.Intracellular electrophysiological studies to investigate the serum of patient effect (and the this monoclonal component) both in acutes incubations and in the muscles chronically treated with the anti-gangliosides IgM.Results and conclusions:We are made a study about the paper of the serum of a patient with a chronic motor desmielinating polineuropathy associated and an IgM monoclonal component that showed affinity for the GM2 on the neuromuscular junction. The electrophysiological acute studies in vitro have showed that that IgM induced a neuromuscular transmission reduction by the block of calcium entry through the calcium channels dependent voltage P/Q types, probably by the alteration of a regulatory mechanism controlled for gangliosides. In this study we also have found that the gangliosides against the antibodies of patient are normally localized in the region of the neuromuscular synapses (both in the axon and the Schwann cell) and in the intramuscular nerve (both in the myelin and the motor axon). The chronic passive transfer of antibodies anti-gangliosides on the adult mammalian muscle induced morphological alterations, (synapses with sprouts and/or axonal retractions) and functional alterations (neurotransmission block and a new calcium channel were found) on the neuromuscular junctions. In that muscles, the motor neurographies showed axonal conduction block.

L’atròfia muscular espinal (AME) és una malaltia d’origen genètic que afecta, majoritàriament a la població infantil. La malaltia cursa amb una mort de les motoneurones  i atròfia muscular. El gen implicat és el survival motor neuron (SMN) que està delecionat en un 95% dels casos. El nostre estudi està dividit en dues parts: 1- l’aprofundiment de les alteracions musculars en dos models animals murins transgènics que pateixen les formes més greus d’AME (Tipus 1-2) i 2- estudi dels possibles efectes terapèutics del liti en un d’aquests models d’AME. S’ha trobat alteracions greus en les unions neuromusculars d’animals nounats i prenatals en marcadors relacionats amb l’ancoratge de les vesícules a la membrana presinàptica, organització dels canals de calci presinàptics i altres proteïnes presinàptiques, desorganització i apoptosi de les cèl•lules musculars, apoptosi massiva del timus i alteracions generalitzades en els òrgans limfoides. L’estudi ultraestructural del múscul ens indica que hi ha una mort, per apoptosi, de les cèl•lules satèl•lit, confirmat amb la tècnica de TUNEL. L’augment de les apoptosi, però no es reflexa en un increment, per altra banda esperat, de la densitat dels macròfags. El tractament amb concentracions terapèutiques del liti no millora l’evolució de la malaltia en els ratolins que manifesten l’AME, s’observa una acumulació progressiva dels nivells de liti, provocant toxicitat en l’animal. L’efecte del liti inhibint la GSK3 no es tradueix en el increment d’expressió de SMN, tal com s’ha deduït d’alguns experiments publicats. / La atrofia muscular espinal (AME) es una enfermedad de origen genético que afecta, mayoritariamente a la población infantil. La enfermedad cursa con muerte de las motoneuronas y atrofia muscular. El gen implicado es el “survival motor neuron” (SMN) que está delecionado en un 95% de los casos. Nuestro estudio está dividido en dos partes: 1 - la caracterización de las alteraciones musculares en dos modelos animales murinos transgénicos que sufren las formas más graves de AME (Tipo 1-2) y 2 - estudio de los posibles efectos terapéuticos del litio en uno de estos modelos. Se han encontrado alteraciones pre y postnatales graves en las sinapsis neuromusculares a nivel de marcadores relacionados con el anclaje de las vesículas en la membrana presináptica, en la organización de los canales de calcio presinápticos y en otras proteínas presinápticas, Asimismo se ha hallado desorganización y apoptosis de las células musculares, apoptosis masiva del timo y alteraciones generalizadas en los órganos linfoides. El estudio ultraestructural del músculo nos revela muerte, por apoptosis, de las células satélite, confirmado con la técnica de TUNEL. El aumento de las apoptosis muscular no conlleva un incremento, por otra parte esperado, de la densidad de los macrófagos. El tratamiento con litio no mejora la evolución de la enfermedad en los ratones con AME. Se observa un incremento progresivo de los niveles de litio, provocando toxicidad en el animal. Por otra parte, el efecto del litio inhibiendo la GSK3 no se traduce en un aumento de la expresión de SMN, tal como se ha deducido de algunos experimentos publicados. / The spinal muscular atrophy (SMA) is a pediatric genetic disease. The SMA is a motor neuron disease that affects the motor neurons causing its death and muscle atrophy. The gene involved is the survival motor neuron (SMN) that is mutated in the 95% of the cases. Our study is divided into two parts: 1 – studies of the neuromuscular junction in two transgenic SMA murine models that develop the most severe forms of SMA (type 1-2) and 2 - study of the possible therapeutic effects of lithium on one of these models of SMA. We found severe alterations in the neuromuscular junctions of newborn animals and also in prenatal markers related to the vesicle docking at the presynaptic membrane, lack of organization of presynaptic calcium channels and defects in the expression of other presynaptic proteins. We found also, disruption and apoptosis of muscular cells, massive apoptosis of the thymus and widespread alterations in lymphoid organs. The ultrastructural study of muscle identifies apoptotic satellite cells that was confirmed by the TUNEL technique. The increase in apoptosis is not followed by the expected increase, in the macrophage density. Treatment with therapeutic concentrations of lithium does not improve the course of the disease in SMA mice. There was a progressive accumulation of lithium, causing toxicity in the animal. The effect of lithium inhibiting GSK3 does not determine an increased expression of SMN, as could be deduced from some published experiments.